專利名稱：檸檬酸發(fā)酵種子培養(yǎng)的方法及發(fā)酵制備檸檬酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檸檬酸發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種檸檬酸發(fā)酵種子培養(yǎng)的方法及一種發(fā)酵制備朽1檬酸的方法。
背景技術(shù)：
檸檬酸是當(dāng)今世界上用量最大的一種有機酸，至今世界上消費的檸檬酸主要采用以黑曲霉為菌種的發(fā)酵法生產(chǎn)。檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)一般包括種子罐培養(yǎng)階段和發(fā)酵罐發(fā)酵階段?，F(xiàn)有檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)中，往往只注重發(fā)酵罐發(fā)酵階段的調(diào)控，對于種子罐培養(yǎng)階段的控制則相對比較粗放，一般只是在固定的罐壓、通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速條件下進行種子培養(yǎng)，例如培養(yǎng)的條件包括溫度 為30-38°C，起始pH值為5-6，通氣量為O. 3-0. 8體積(體積·π η)，罐壓為O. 04-0. 12MPa，攪拌轉(zhuǎn)速為250-450rpm。現(xiàn)有的種子培養(yǎng)方法一般造成培養(yǎng)出的種子的種齡偏長，一般為26-35h，菌球形態(tài)松散，菌絲長，致使發(fā)酵階段的發(fā)酵周期長、轉(zhuǎn)化率低。種子是影響發(fā)酵的最為關(guān)鍵的因素，因此，研發(fā)出適合的種子培養(yǎng)方法對檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中種子培養(yǎng)階段培養(yǎng)出的種子的種齡長、種子質(zhì)量差，致使發(fā)酵階段發(fā)酵周期長、轉(zhuǎn)化率低的缺陷，提供一種新的檸檬酸發(fā)酵種子培養(yǎng)的方法及一種發(fā)酵制備檸檬酸的方法。本發(fā)明的發(fā)明人在研究中意外發(fā)現(xiàn)，在種子培養(yǎng)階段，種子培養(yǎng)10_15h后的罐壓、通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速分別高于之前的罐壓、通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，可縮短種子培養(yǎng)的時間，即縮短種齡，并提高種子質(zhì)量，即使培養(yǎng)出的菌球較密實圓整，菌絲短而粗壯；且采用培養(yǎng)得到的種子液進行發(fā)酵，可縮短發(fā)酵周期，提高轉(zhuǎn)化率。優(yōu)選情況下，種子培養(yǎng)10-15h后，罐壓提高40-150%，通氣量提高50-180%，攪拌轉(zhuǎn)速提高10_80%，可進一步縮短種齡，提高種子質(zhì)量，縮短發(fā)酵周期，提高轉(zhuǎn)化率。因此，為了實現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供了一種檸檬酸發(fā)酵種子培養(yǎng)的方法，所述方法包括，在種子培養(yǎng)條件下，將檸檬酸發(fā)酵菌種接入種子罐的種子培養(yǎng)基中進行種子培養(yǎng)，得到種子液，其特征在于，種子培養(yǎng)10_15h后的罐壓、通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速分別高于之前的罐壓、通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。優(yōu)選地，種子培養(yǎng)10_15h后，罐壓提高40-150%，通氣量提高50-180%，攪拌轉(zhuǎn)速提高10-80% ;更優(yōu)選地，種子培養(yǎng)10-15h后，罐壓提高60-100%，通氣量提高80-120%，攪拌轉(zhuǎn)速提高25-60%。優(yōu)選地，從種子培養(yǎng)開始至種子培養(yǎng)10_15h的時間段內(nèi)，將罐壓控制在O. 04-0. 06MPa,將通氣量控制在O. 3-0. 6體積(體積· min)，將攪拌轉(zhuǎn)速控制在250-350rpm ;在種子培養(yǎng)10_15h后，將罐壓控制在O. 06-0. IMPa，將通氣量控制在O. 6-0. 8體積(體積· min),將攪拌轉(zhuǎn)速控制在350_450rpm。另一方面，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵制備檸檬酸的方法，所述方法包括在種子培養(yǎng)條件下，將檸檬酸發(fā)酵菌種進行種子培養(yǎng)，然后在生成檸檬酸的條件下，將種子培養(yǎng)后得到的種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā) 酵，得到發(fā)酵液，其特征在于，檸檬酸發(fā)酵菌種按照如上所述的方法進行種子培養(yǎng)。本發(fā)明提供的檸檬酸發(fā)酵種子培養(yǎng)的方法，可縮短種齡，且培養(yǎng)出的菌球較密實圓整，菌絲短而粗壯；本發(fā)明提供的發(fā)酵制備檸檬酸的方法，可縮短發(fā)酵周期，提高終點檸檬酸含量和轉(zhuǎn)化率；本發(fā)明方法大大降低了種子培養(yǎng)時間和發(fā)酵周期，降低了水電等動力消耗，節(jié)約了成本。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式
部分予以詳細說明。


圖I是為本發(fā)明實施例I培養(yǎng)出的種子形態(tài)照片(10 X 15倍)；圖2是為本發(fā)明對比例I培養(yǎng)出的種子形態(tài)照片(10X 15倍)。
具體實施例方式以下對本發(fā)明的具體實施方式
進行詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實施方式
僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。一方面,本發(fā)明提供了一種朽1檬酸發(fā)酵種子培養(yǎng)的方法,該方法包括,在種子培養(yǎng)條件下，將檸檬酸發(fā)酵菌種接入種子罐的種子培養(yǎng)基中進行種子培養(yǎng)，得到種子液，種子培養(yǎng)10_15h后的罐壓、通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速分別高于之前的罐壓、通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。本發(fā)明中，“種子培養(yǎng)”是指將檸檬酸發(fā)酵菌種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基之前，先接種至種子罐的種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，使培養(yǎng)后的檸檬酸發(fā)酵菌種適合于檸檬酸的發(fā)酵?！胺N子液”是指種子罐的種子培養(yǎng)基接種后經(jīng)過種子培養(yǎng)得到的含有培養(yǎng)后的檸檬酸發(fā)酵菌種的種子培養(yǎng)基?！胺N子”是指種子液中經(jīng)過培養(yǎng)后的檸檬酸發(fā)酵菌種，即經(jīng)過培養(yǎng)后的黑曲霉。本發(fā)明中，“種齡”是指從種子培養(yǎng)開始(即將檸檬酸發(fā)酵菌種接入種子罐開始)到停止種子培養(yǎng)所經(jīng)歷的時間，即種子培養(yǎng)的時間。本發(fā)明中，術(shù)語“通氣量” 一般以通氣比來表示，通常以每min內(nèi)通過單位體積培養(yǎng)基的空氣體積比來表示(V / V · min)，例如通氣比為1:0. 1_1，簡稱通氣量為O. 1_1體積(體積· min)。根據(jù)本發(fā)明，盡管種子培養(yǎng)10_15h后的罐壓、通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速分別高于之前的罐壓、通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，即可實現(xiàn)本發(fā)明的目的，即縮短種齡，提高種子質(zhì)量，縮短發(fā)酵周期，提高轉(zhuǎn)化率。但優(yōu)選情況下，種子培養(yǎng)10_15h后，罐壓提高40-150%，通氣量提高50-180%,攪拌轉(zhuǎn)速提高10-80%，可進一步縮短種齡，提高種子質(zhì)量，縮短發(fā)酵周期，提高轉(zhuǎn)化率；更優(yōu)選情況下，種子培養(yǎng)10_15h后，罐壓提高60-100%，通氣量提高80-120%，攪拌轉(zhuǎn)速提高25-60%，可更進一步縮短種齡，提高種子質(zhì)量，縮短發(fā)酵周期，提高轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明雖然僅對種子培養(yǎng)10_15h前后罐壓、通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速的高低進行了限定，沒有限定罐壓、通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速的具體取值范圍，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，罐壓、通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速的具體取值范圍應(yīng)該在適于種子培養(yǎng)的范圍內(nèi)，即應(yīng)該在本領(lǐng)域常規(guī)采用的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，從種子培養(yǎng)開始至種子培養(yǎng)10-15h的時間段內(nèi)，將罐壓控制在O. 04-0. 06MPa,將通氣量控制在O. 3-0. 6體積(體積· min)，將攪拌轉(zhuǎn)速控制在250-350rpm ;在種子培養(yǎng)10_15h后，將罐壓控制在O. 06-0. IMPa,將通氣量控制在O. 6-0. 8體積(體積· min),將攪拌轉(zhuǎn)速控制在350_450rpm。更優(yōu)選地,從種子培養(yǎng)開始至種子培養(yǎng)10-15h的時間段內(nèi)，將罐壓控制在O. 04-0. 05MPa，將通氣量控制在O. 3-0. 4體積(體積· min),將攪拌轉(zhuǎn)速控制在250_350rpm ;在種子培養(yǎng)10_15h后,將罐壓控制在O. 07-0. IMPa，將通氣量控制在O. 6-0. 8體積(體積·π η)，將攪拌轉(zhuǎn)速控制在400_450rpm。本發(fā)明中，除了對罐壓、通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速有上述限定外，對種子培養(yǎng)的其他條件無特殊要求，可以采用本領(lǐng)域常用的培養(yǎng)條件，例如種子培養(yǎng)條件可以包括溫度為30-38 °C，起始 pH 值為 5-6。本發(fā)明中，對于種子培養(yǎng)基無特殊要求，可以采用本領(lǐng)域常用的種子培養(yǎng)基。例如可以采用含有淀粉質(zhì)原料酶解產(chǎn)物的種子培養(yǎng)基。
淀粉質(zhì)原料酶解產(chǎn)物即是指將淀粉質(zhì)原料粉碎，將粉碎后的產(chǎn)物調(diào)漿后進行酶解，得到的產(chǎn)物。淀粉質(zhì)原料可以為本領(lǐng)域公知的各種可以用于酶解、發(fā)酵制備檸檬酸的含有淀粉的原料，例如，可以選自玉米、薯類(如木薯)和小麥中的一種或幾種，優(yōu)選情況下，所述淀粉質(zhì)原料為玉米。所述酶解步驟可以通過本領(lǐng)域常用的方法完成，比如向粉碎產(chǎn)物中添加產(chǎn)酶微生物和/或酶，在產(chǎn)酶微生物的生長溫度和/或酶有活力的溫度下保溫完成。所述產(chǎn)酶微生物為能夠分泌淀粉酶的產(chǎn)酶微生物。所述酶包括淀粉酶。由于微生物生長會產(chǎn)生副產(chǎn)物，因此優(yōu)選直接加入酶。所述酶的用量越多越好，出于成本考慮，優(yōu)選以每克粉碎后的粉碎產(chǎn)物的干重計，淀粉酶的用量為15-50個酶活力單位。本發(fā)明中，淀粉酶的酶活力單位的定義為在pH值為6. O、溫度為70°C的條件下，Imin將I毫克淀粉轉(zhuǎn)化為還原糖所需的酶量為一個酶活力單位。酶解的溫度可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選為70_105°C，更優(yōu)選為80_95°C。酶解的時間理論上越長越好，考慮到設(shè)備利用率，優(yōu)選酶解的時間為90-150min，更優(yōu)選為100-120min。酶解的pH值可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選為5. 0-7. O。淀粉酶是指能夠分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱，淀粉酶一般包括α -淀粉酶、β -淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用α -淀粉酶和/或異淀粉酶。本發(fā)明的種子培養(yǎng)基優(yōu)選將淀粉質(zhì)原料酶解產(chǎn)物加水稀釋至總糖為8-12重量％得到。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，種子培養(yǎng)基需高溫滅菌后降溫，才能接種檸檬酸發(fā)酵菌種，此為本領(lǐng)域的常規(guī)操作，在此不再贅述。本發(fā)明中，檸檬酸發(fā)酵菌種采用本領(lǐng)域常用的發(fā)酵菌種，例如黑曲霉。對于黑曲霉在種子培養(yǎng)基中的接種量無特殊要求，可以采用本領(lǐng)域常規(guī)接種量，例如，以每升種子培養(yǎng)基為基準，黑曲霉的接種量為2Χ 108-3X IO8個孢子。孢子的數(shù)量可以通過本領(lǐng)域公知的方法測定，例如，通過血球計數(shù)板計數(shù)。黑曲霉種子培養(yǎng)的程度可以通過酸度測定來確定，當(dāng)種子液酸度> lg/100mL時
停止培養(yǎng)。
另一方面，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵制備朽1檬酸的方法，該方法包括在種子培養(yǎng)條件下，將檸檬酸發(fā)酵菌種進行種子培養(yǎng)，然后在生成檸檬酸的條件下，將種子培養(yǎng)后得到的種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，得到發(fā)酵液，檸檬酸發(fā)酵菌種按照如上所述的方法進行種子培養(yǎng)。本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)基為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的概念，指微生物發(fā)酵所需的供微生物生長和維持用的人工配制的養(yǎng)料，一般都含有碳水化合物、含氮物質(zhì)、無機鹽(包括微量元素)以及維生素和水等。發(fā)酵液也為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的概念，指接入微生物菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后所得產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明，對發(fā)酵培養(yǎng)基的成分沒有特別的要求，只要可以用于檸檬酸發(fā)酵即可。優(yōu)選地，發(fā)酵培養(yǎng)基含有淀粉質(zhì)原料酶解產(chǎn)物，淀粉質(zhì)原料酶解產(chǎn)物如前所述，在此不再贅述。一般地，淀粉質(zhì)原料酶解產(chǎn)物稱為液化液，液化液經(jīng)固液分離得到酶解殘渣和液化清液。本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選由液化液和液化清液與水混合或不與水混合得到，且進一步優(yōu)選以發(fā)酵培養(yǎng)基的總重量為100重量份為基準，液化清液的用量為80-85重量份，液化 液的用量為15-20重量份。本發(fā)明中，固液分尚的條件使酶解殘禮:的固含量為45-55重量％，優(yōu)選為49_51重量％。固液分離的方法與裝置為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，壓濾機或離心機。本發(fā)明中，以每升發(fā)酵培養(yǎng)基為基準，種子液的量使得在發(fā)酵培養(yǎng)基中的黑曲霉的接種量優(yōu)選為1.8X 107-3. 8X 107個孢子，進一步優(yōu)選為2. 2X 107-3. 6X 107個孢子。將經(jīng)過種子培養(yǎng)得到的種子液加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，通常用接入發(fā)酵培養(yǎng)基的種子液的體積占接入種子液后發(fā)酵培養(yǎng)基的體積的百分比來表示黑曲霉的接種量，當(dāng)接入發(fā)酵培養(yǎng)基的種子液的體積占接入種子液后發(fā)酵培養(yǎng)基的體積的8-12%時，能夠滿足以每升發(fā)酵培養(yǎng)基為基準，接種量在2. 2 X 107-3. 6 X IO7個孢子范圍內(nèi)。因此，優(yōu)選的接種量可以表示為接種量為8-12%。本發(fā)明中，發(fā)酵條件可以為本領(lǐng)域常規(guī)的發(fā)酵條件，例如，發(fā)酵的條件可以包括溫度為30-40°C，優(yōu)選為35-37°C ;起始pH值為4_5 ;通氣量為O. 1-1體積(體積· min)，優(yōu)選為O. 3-0. 8體積:(體積· min),罐壓為O. 05-0. 06MPa,攪拌轉(zhuǎn)速為350_450rpm。本發(fā)明中，發(fā)酵周期是指從在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種開始至發(fā)酵液中還原糖含量達到O. 3g/100mL以下的這段時間。按照GB/T5009. 7-2008的方法測定發(fā)酵培養(yǎng)基中還原性糖的濃度。發(fā)酵的設(shè)備為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，可以使用發(fā)酵罐。按照本發(fā)明的方法制備得到的發(fā)酵產(chǎn)物檸檬酸可以用常規(guī)的方法，根據(jù)不同工業(yè)產(chǎn)品的要求分離并精制，比如中和、酸解、脫色、濃縮、結(jié)晶、包裝。以上詳細描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護范圍。另外需要說明的是，在上述具體實施方式
中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。實施例以下的實施例將對本發(fā)明作進一步的說明，但并不因此限制本發(fā)明。在以下實施例和對比例中 黑曲霉囷種為黑曲霉Co827。種子形態(tài)種子液取樣，用顯微鏡(OLYMPUS BX41)觀察、拍照。按照GB/T5009. 8-2003的方法測定發(fā)酵培養(yǎng)基中總糖的濃度。按照GB/T5009. 7-2008的方法測定發(fā)酵培養(yǎng)基中還原性糖的濃度。 根據(jù)GB 1987-2007標準檢測所得檸檬酸溶液的濃度(即終點檸檬酸含量)。單罐供酸量=檸檬酸溶液的濃度X檸檬酸溶液的體積。轉(zhuǎn)化率(％)=單罐供酸量/用糖的總重量X 100%，其中用糖的總重量包括種子罐用糖重量和發(fā)酵罐用糖重量。實施例I本實施例用于說明本發(fā)明提供的朽1檬酸發(fā)酵種子培養(yǎng)的方法及發(fā)酵制備朽1檬酸的方法。(I)將收獲的玉米進行粉碎，得到平均粒子直徑為400微米的粉碎后產(chǎn)物。(2)將粉碎后產(chǎn)物按24重量％的濃度調(diào)漿，相對于每克粉碎后產(chǎn)物，加入20個酶活力單位的淀粉酶(諾維信公司，α -淀粉酶，下同)，進入噴射器，在93°C、pH為5. 9的條件下酶解IOOmin得到產(chǎn)物，即液化液。(3)將部分液化液通過用液壓式板框壓濾機進行壓濾，分離出液化清液和酶解殘渣，其中，酶解殘渣的固含量為51重量％。(4)將步驟(2)中的部分液化液，加水稀釋至總糖為10重量％，得到種子培養(yǎng)基，將種子培養(yǎng)基投入種子罐，加熱到121°C消毒，維持30min后快速降溫至36°C，接入黑曲霉菌種，以每升種子培養(yǎng)基為基準，黑曲霉的接種量為2. 5X IO8個孢子。在35°C、起始pH值為5的條件下進行種子培養(yǎng)，從種子培養(yǎng)開始至種子培養(yǎng)12h時，將罐壓控制在O. 04MPa，將通氣量控制在O. 3體積(體積· min)，將攪拌轉(zhuǎn)速控制在300rpm ;在種子培養(yǎng)12h后，將罐壓控制在O. 07MPa,將通氣量控制在O. 66體積(體積· min)，將攪拌轉(zhuǎn)速控制在420rpm。通過酸度測定對黑曲霉的生長進行觀察，當(dāng)酸度> lg/100mL時停止培養(yǎng)，得到種子液。記錄培養(yǎng)時間，即種齡，見表I。在顯微鏡下觀察種子形態(tài)，照片如圖I所示。(5)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，將180. 5千克的上述液化清液和35. 5千克的上述液化液滅菌后加入到300L的發(fā)酵罐中，得到發(fā)酵培養(yǎng)基。(6)將步驟(4)得到的種子液加入到步驟(5)的發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，接種量為8%，發(fā)酵條件包括溫度為35°C，起始pH值為5，通氣量為O. 3體積(體積· min)，罐壓為O. 05MPa，攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm。發(fā)酵至發(fā)酵液中還原糖含量達到O. 3g/100mL以下停止發(fā)酵，記錄發(fā)酵周期見表1，然后進行固液分離得到檸檬酸溶液。測定檸檬酸溶液的濃度，即終點檸檬酸含量，并計算轉(zhuǎn)化率見表I。實施例2本實施例用于說明本發(fā)明提供的朽1檬酸發(fā)酵種子培養(yǎng)的方法及發(fā)酵制備朽1檬酸的方法。
(1)將收獲的玉米進行粉碎，得到平均粒子直徑為380微米的粉碎后產(chǎn)物。(2)將粉碎后的產(chǎn)物按27重量％的濃度調(diào)漿，相對于每克粉碎后產(chǎn)物，加入50個酶活力單位的淀粉酶，進入噴射器，在95°C、pH為5. 8的條件下酶解IlOmin得到產(chǎn)物，即液化液。(3)將部分液化液通過用液壓式板框壓濾機進行壓濾，分離出液化清液和酶解殘渣，其中，酶解殘渣的固含量為50重量％。(4)將步驟(2)中的部分液化液，加水稀釋至總糖為8重量％，得到種子培養(yǎng)基，將種子培養(yǎng)基投入種子罐，加熱到121°C消毒，維持30min后快速降溫至36°C，接入黑曲霉菌種，以每升種子培養(yǎng)基為基準，黑曲霉的接種量為2 X IO8個孢子。在36°C、起始pH值為5. 5的條件下進行種子培養(yǎng)，從種子培養(yǎng)開始至種子培養(yǎng)IOh時，將罐壓控制在O. 05MPa，將通氣量控制在O. 4體積(體積· min)，將攪拌轉(zhuǎn)速控制在250rpm ;在種子培養(yǎng)IOh后，將罐壓控制在O. IMPa，將通氣量控制在O. 8體積(體積·π η)，將攪拌轉(zhuǎn)速控制在400rpm。通過酸度測定對黑曲霉的生長進行觀察，當(dāng)酸度> lg/100mL時停止培養(yǎng)，得到種子液。記錄種齡，見表I。在顯微鏡下觀察種子形態(tài)，與實施例I類似，照片未示出。(5)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，將177. I千克的上述液化清液和38. 9千克的上述液化液滅菌后加入到300L的發(fā)酵罐中，得到發(fā)酵培養(yǎng)基。(6)將步驟(4)得到的種子液加入到步驟(5)的發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，接種量為10%，發(fā)酵條件包括溫度為36 °C，起始pH值為4. 5，通氣量為O. 8體積(體積· min)，罐壓為O. 06MPa，攪拌轉(zhuǎn)速為350rpm。發(fā)酵至發(fā)酵液中還原糖含量達到O. 3g/100mL以下停止發(fā)酵，記錄發(fā)酵周期見表1，然后進行固液分離得到檸檬酸溶液。測定終點檸檬酸含量，并計算轉(zhuǎn)化率見表I。實施例3本實施例用于說明本發(fā)明提供的朽1檬酸發(fā)酵種子培養(yǎng)的方法及發(fā)酵制備朽1檬酸的方法。(I)將收獲的玉米進行粉碎，得到平均粒子直徑為370微米的粉碎后產(chǎn)物。(2)將粉碎后的產(chǎn)物按26重量％的濃度調(diào)漿，相對于每克粉碎后產(chǎn)物，加入15個酶活力單位的淀粉酶，進入噴射器，在90°C、pH為6. O的條件下酶解120min得到產(chǎn)物，即液化液。(3)將部分液化液通過用液壓式板框壓濾機進行壓濾，分離出液化清液和酶解殘渣，其中，酶解殘渣的固含量為49重量％。(4)將步驟(2)中的部分液化液，加水稀釋至總糖為12重量％，得到種子培養(yǎng)基，將種子培養(yǎng)基投入種子罐，加熱到121°C消毒，維持30min后快速降溫至36°C，接入黑曲霉菌種，以每升種子培養(yǎng)基為基準，黑曲霉的接種量為3X IO8個孢子。在37°C、起始pH值為6的條件下進行種子培養(yǎng)，從種子培養(yǎng)開始至種子培養(yǎng)15h時，將罐壓控制在O. 05MPa,將通氣量控制在O. 4體積(體積· min)，將攪拌轉(zhuǎn)速控制在350rpm ;在種子培養(yǎng)15h后，將罐壓控制在O. 08MPa,將通氣量控制在O. 72體積(體積· min)，將攪拌轉(zhuǎn)速控制在450rpm。通過酸度測定對黑曲霉的生長進行觀察，當(dāng)酸度> lg/100mL時停止培養(yǎng)，得到種子液。記錄種齡，見表I。在顯微鏡下觀察種子形態(tài)，與實施例I類似，照片未示出。(5)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，將169千克的上述酶解液化清液和42. 2千克的酶解得到的產(chǎn)物滅菌后加入到300L的發(fā)酵罐中，得到發(fā)酵培養(yǎng)基。(6)將步驟(4)得到的種子液加入到步驟(5)的發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，接種量為12%，發(fā)酵條件包括溫度為35°C，起始pH值為5，通氣量為O. 6體積(體積· min)，罐壓為
O.05MPa，攪拌轉(zhuǎn)速為450rpm。發(fā)酵至發(fā)酵液中還原糖含量達到O. 3g/100mL以下停止發(fā)酵，記錄發(fā)酵周期見表1，然后進行固液分離得到檸檬酸溶液。測定終點檸檬酸含量，并計算轉(zhuǎn)化率見表I。實施例4本實施例用于說明本發(fā)明提供的朽1檬酸發(fā)酵種子培養(yǎng)的方法及發(fā)酵制備朽1檬酸的方法。按照實施例I的方法進行種子培養(yǎng)和發(fā)酵制備檸檬酸，不同的是，在種子培養(yǎng)12h 后，將罐壓控制在O. IMPa,將通氣量控制在O. 5體積(體積· min)，將攪拌轉(zhuǎn)速控制在450rpm。記錄種齡、發(fā)酵周期見表1，測定終點檸檬酸含量，并計算轉(zhuǎn)化率見表I。實施例5本實施例用于說明本發(fā)明提供的朽1檬酸發(fā)酵種子培養(yǎng)的方法及發(fā)酵制備朽1檬酸的方法。按照實施例I的方法進行種子培養(yǎng)和發(fā)酵制備檸檬酸，不同的是，在種子培養(yǎng)12h后，將罐壓控制在O. 06MPa,將通氣量控制在O. 8體積(體積· min)，將攪拌轉(zhuǎn)速控制在350rpmo記錄種齡、發(fā)酵周期見表1，測定終點檸檬酸含量，并計算轉(zhuǎn)化率見表I。對比例I按照實施例I的方法進行種子培養(yǎng)和發(fā)酵制備檸檬酸，不同的是，在種子培養(yǎng)12h后，將罐壓控制在O. 03MPa,將通氣量控制在O. 2體積(體積· min)，將攪拌轉(zhuǎn)速控制在250rpm。記錄種齡、發(fā)酵周期見表1，測定終點檸檬酸含量，并計算轉(zhuǎn)化率見表I。對比例2按照實施例I的方法進行種子培養(yǎng)和發(fā)酵制備檸檬酸，不同的是，在種子培養(yǎng)過程中，將罐壓控制在O. 06MPa,將通氣量控制在O. 6體積(體積· min)，將攪拌轉(zhuǎn)速控制在350rpm，并各自保持恒定不變。記錄種齡、發(fā)酵周期見表1，測定終點檸檬酸含量，并計算轉(zhuǎn)化率見表I。表I
權(quán)利要求
1.一種檸檬酸發(fā)酵種子培養(yǎng)的方法，所述方法包括，在種子培養(yǎng)條件下，將檸檬酸發(fā)酵菌種接入種子罐的種子培養(yǎng)基中進行種子培養(yǎng)，得到種子液，其特征在于，種子培養(yǎng)10-15h后的罐壓、通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速分別高于之前的罐壓、通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，種子培養(yǎng)10-15h后，罐壓提高40-150%，通氣量提高50-180%，攪拌轉(zhuǎn)速提高10-80%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，種子培養(yǎng)10-15h后，罐壓提高60-100%，通氣量提高80-120%，攪拌轉(zhuǎn)速提高25-60%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項所述的方法，其中，從種子培養(yǎng)開始至種子培養(yǎng)10-15h的時間段內(nèi)，將罐壓控制在O. 04-0. 06MPa,將通氣量控制在O. 3-0. 6體積(體積· min)，將攪拌轉(zhuǎn)速控制在250-350rpm ;在種子培養(yǎng)10_15h后，將罐壓控制在O.06-0. IMPa,將通氣量控制在O. 6-0. 8體積(體積·π η)，將攪拌轉(zhuǎn)速控制在350_450rpm。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，種子培養(yǎng)條件包括 .溫度為30-38°C，起始pH值為 5-6。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述檸檬酸發(fā)酵菌種為黑曲霉。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，以每升種子培養(yǎng)基為基準，黑曲霉的接種量為2X 108-3X 108 個孢子。
8.一種發(fā)酵制備朽1檬酸的方法，所述方法包括在種子培養(yǎng)條件下，將朽1檬酸發(fā)酵菌種進行種子培養(yǎng)，然后在生成檸檬酸的條件下，將種子培養(yǎng)后得到的種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，得到發(fā)酵液，其特征在于，檸檬酸發(fā)酵菌種按照權(quán)利要求1-7中任意ー項所述的方法進行種子培養(yǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，以每升發(fā)酵培養(yǎng)基為基準，種子液的量使得在發(fā)酵培養(yǎng)基中的黑曲霉的接種量為I. 8X 107-3. 8X IO7個孢子。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其中，發(fā)酵的條件包括溫度為30-40°C，起始PH值為4-5，通氣量為O. 1-1體積(體積· min)，罐壓為O. 05-0. 06MPa,攪拌轉(zhuǎn)速為350-450rpmo
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檸檬酸發(fā)酵種子培養(yǎng)的方法，所述方法包括，在種子培養(yǎng)條件下，將檸檬酸發(fā)酵菌種接入種子罐的種子培養(yǎng)基中進行種子培養(yǎng)，得到種子液，其特征在于，種子培養(yǎng)10-15h后的罐壓、通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速分別高于之前的罐壓、通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。還公開了一種發(fā)酵制備檸檬酸的方法，所述方法包括在種子培養(yǎng)條件下，將檸檬酸發(fā)酵菌種進行種子培養(yǎng)，然后在生成檸檬酸的條件下，將種子培養(yǎng)后得到的種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，得到發(fā)酵液，其特征在于，檸檬酸發(fā)酵菌種按照如上所述的方法進行種子培養(yǎng)。本發(fā)明方法，可縮短種齡，提高種子質(zhì)量，縮短發(fā)酵周期，提高轉(zhuǎn)化率和終點檸檬酸含量，降低了水電等動力消耗，節(jié)約了成本。
文檔編號C12N1/14GK102864082SQ20121035641
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月19日
發(fā)明者羅虎, 盧宗梅, 劉夢涵, 鐘華, 章輝平 申請人:中糧生物化學(xué)(安徽)股份有限公司