專利名稱：一種與胰腺癌相關(guān)的血清/血漿miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程及腫瘤學(xué)領(lǐng)域，涉及一種與胰腺癌相關(guān)的血清/血漿miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胰腺癌是常見的消化道腫瘤之一，據(jù)估計，全球2008年新發(fā)胰腺癌病例達(dá)27萬。在我國，近20年來胰腺癌發(fā)病率增長了將近6倍，特別是在經(jīng)濟(jì)較發(fā)達(dá)的地區(qū)，胰腺癌的發(fā)病率已與西方國家持平。胰腺癌惡性程度高，預(yù)后極差，由于其特殊的生物學(xué)行為，即易于侵犯血管和神經(jīng)，腫瘤很小時就發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，對常規(guī)化療、放療和免疫治療等均不敏感等，我國的5年生存率僅為5%左右。近年來，隨著胰腺癌發(fā)病率和死亡率的繼續(xù)增高，胰腺癌已嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命。
盡管胰腺癌高度惡性，但是如果能早期發(fā)現(xiàn)早期治療，仍可獲得最佳治療效果，如早期胰腺癌手術(shù)切除率為90%-100%，5年生存率可達(dá)70%-100%，與進(jìn)展期胰腺癌相比，兩者治療效果存在著巨大的反差?？墒牵捎谝认俳馄饰恢蒙钤诩耙认侔┑纳飳W(xué)特性，導(dǎo)致了胰腺癌早期診斷困難，大部分患者就診時已處于晚期。目前對胰腺癌的生物學(xué)標(biāo)志進(jìn)行了大量而廣泛的研究，包括基因標(biāo)記、血清學(xué)標(biāo)記和細(xì)胞學(xué)標(biāo)記等，由于這些指標(biāo)的特異性和敏感性各有差異，對于早期胰腺癌目前還沒有準(zhǔn)確有效的篩查方法，也缺乏可靠的診斷措施，鑒于此，胰腺癌早期診斷率亟待提高，尋找有效的標(biāo)志物對胰腺癌早期診斷、促進(jìn)其預(yù)后具有重要意義。MicroRNAs (即miRNAs)是近年來腫瘤分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的一個熱點,它的成熟狀態(tài)是一類長約19-23個核苷酸的小單鏈RNA分子，進(jìn)化上具有高度保守性。它廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，其本身不具有開放閱讀框(ORF)。miRNA具有高度的保守性、時序性和組織特異性，通過與靶mRNA的3'端非編碼區(qū)結(jié)合，降解或者抑制mRNA的翻譯導(dǎo)致靶基因的轉(zhuǎn)錄后沉默，從而調(diào)節(jié)生物體內(nèi)在的與機(jī)體生長、發(fā)育、疾病發(fā)生過程有關(guān)的基因的表達(dá)。自從參與調(diào)控線蟲時序發(fā)育的lin-4與let-7被發(fā)現(xiàn)以來，miRNA分別在2002年和2003年兩度入選Science雜志年度十大科技突破。2005年預(yù)測miRNAs至少能調(diào)控5300個人類基因，即所有基因的30%。隨著研究的深入，越來越多的miRNAs不斷被發(fā)現(xiàn)。聚光燈下的miRNA已經(jīng)逐步擺脫了 DNA光芒的掩蓋，從“配角”變成“主角”，并且對DNA的中心地位提出了新的挑戰(zhàn)。近年來，miRNA與腫瘤的關(guān)系已經(jīng)成為研究的熱點和重點，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA通過負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)與肺癌，乳腺癌，胃癌，胰腺癌等的發(fā)病高度相關(guān)。研究已經(jīng)證實血清/血漿中存在幾百種的miRNAs，這些小分子RNAs性質(zhì)穩(wěn)定、含量豐富、易于定量檢測，且存在顯著的疾病特異性。血清/血漿miRNA作為腫瘤診斷和預(yù)后分子標(biāo)志物不僅具有創(chuàng)傷小，方法準(zhǔn)確、便捷的優(yōu)勢，而且還可改進(jìn)疾病診斷、腫瘤分類、預(yù)后估計、療效及復(fù)發(fā)預(yù)測的精度。但是，由于血清/血漿中miRNA的表達(dá)量較低，尋找一種靈敏度高、操作簡便且成本低廉的檢測方法是目前血清/血漿miRNA在腫瘤臨床檢測中亟待解決的問題。另一方面，僅僅采用一種血清/血漿miRNA作為腫瘤標(biāo)志物往往特異性不足，若將多種miRNA組合使用并與其他類型腫瘤標(biāo)志物檢測相結(jié)合，可有望顯著提高診斷的準(zhǔn)確性。然而，目前還沒有用于胰腺癌診斷的較為穩(wěn)定的生物標(biāo)志物的報道，若能篩選出胰腺癌異常表達(dá)的血清/血漿miRNAs作為生物標(biāo)志物，并研制相應(yīng)的診斷試劑盒，對我國胰腺癌的診斷現(xiàn)狀必將是一次有力的推動。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的是針對上述技術(shù)問題，提出一種與胰腺癌相關(guān)的血清/血漿miRNA標(biāo)志物。本發(fā)明的第二個目的是提供上述血清/血漿miRNA標(biāo)志物的引物。
本發(fā)明的第三個目的是提供上述血清/血漿miRNA標(biāo)志物及其引物在制備胰腺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明第四個目的是提供胰腺癌輔助診斷的試劑盒。發(fā)明人通過分離和研究胰腺癌患者及與其年齡、性別匹配的健康對照血清/血漿中miRNAs，尋找一組與胰腺癌高度相關(guān)的高特異性和敏感性的miRNAs，并研制出可便于臨床應(yīng)用的胰腺癌診斷試劑盒，為胰腺癌的篩查和診斷提供數(shù)據(jù)支持，為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價值的新型小分子藥物提供數(shù)據(jù)支持。本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實現(xiàn)的一種與胰腺癌相關(guān)的血清/血漿miRNA標(biāo)志物，該標(biāo)志物為miR-451和miR-409-3p 的組合。所述的血清/血漿miRNA標(biāo)志物的引物，這些引物為miR-451 的引物為 SEQ ID No. I 和 SEQ ID No. 2 ;miR-409_3p 的引物為 SEQ IDNo. 3 和 SEQ ID No. 4。所述的血清/血漿miRNA標(biāo)志物在制備胰腺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。所述血清/血漿miRNA標(biāo)志物的引物在制備胰腺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。一種胰腺癌輔助診斷試劑盒，該試劑盒用于檢測血清/血漿中miR-451和miR-409_3po所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有血清/血衆(zhòng)miRNA中miR-451和miR-409_3p的引物。所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有的血清/血漿miRNA標(biāo)志物的引物為miR-451 的引物為 SEQ ID No. I 和 SEQ ID No. 2 ;miR-409_3p 的引物為 SEQ IDNo. 3 和 SEQ ID No. 4。所述診斷試劑盒還可以包括PCR反應(yīng)常用的酶和試劑，如逆轉(zhuǎn)錄酶，緩沖液，dNTPs，MgCl2, DEPC水和Taq酶等；還可以含有標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌?。具體地說，本發(fā)明解決問題的技術(shù)方案包括(1)建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本庫和數(shù)據(jù)庫以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料和臨床資料。(2)血清/血漿miRNA差異表達(dá)譜分析選擇胰腺癌病例、與胰腺癌病例年齡、性別匹配的健康人對照，檢測其血清/血漿miRNA表達(dá)譜及含量，分析胰腺癌病例和健康人對照間血清/血漿miRNA的共性和特性，篩選差異表達(dá)miRNAs，進(jìn)行進(jìn)一步單個樣本驗證，確定胰腺癌發(fā)病相關(guān)血清/血漿miRNAs (3)血清/血漿miRNA篩查和診斷試劑盒的研制根據(jù)胰腺癌病例和健康人對照的特異血清/血衆(zhòng)miRNA開發(fā)miRNAs診斷試劑盒。本發(fā)明人以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料、臨床資料等(這些資料可用于判斷疾病進(jìn)展，并控制患者年齡和性別等因素對于發(fā)病的影響)，并米用了 RT-PCR、Real-time PCR 方法、TaqMan Low Density Array (TLDA)芯片檢測等。具體來說研究的實驗方法主要包括以下幾個部分I.研究樣本的選擇( I)經(jīng)病理學(xué)明確診斷的胰腺癌病例(2)采血前未經(jīng)過手術(shù)和放化療，無手術(shù)前放化療 (3)與病例年齡、性別匹配的健康人對照本研究共采用48例符合標(biāo)準(zhǔn)的樣本進(jìn)行研究。2. Trizol 試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA)和 miRNeasy Mini Kit (QIAGEN 公司)提取血清/血漿總RNA，按常規(guī)方法操作。通常能得到 5 μ gRNA/50ml血清或血漿。3. TLDA (Applied Biosystems 公司)芯片檢測(I)總RNA通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA樣品(2) cDNA樣品進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)(3 )預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行TLDA芯片檢測，得到miRNA的表達(dá)譜(4)數(shù)據(jù)分析與處理4. Real-time RT-PCR (qRT-PCR)方法(I)取受試者的血清/血衆(zhòng)總RNA,通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA樣品；(2)設(shè)計引物；( 3)加入熒光探針或染料進(jìn)行PCR反應(yīng)；(4)檢測并比較胰腺癌病例與健康人對照血清/血漿樣本中miRNA的量的變化。5.診斷試劑盒制備方法TLDA芯片檢測方法綜合確定胰腺癌病例和健康人對照中有拷貝差異和表達(dá)差異，通過qRT-PCR技術(shù)篩選在胰腺癌病例和健康人對照中表達(dá)量和差異程度大的一組血清/血漿miRNA，作為胰腺癌輔助診斷的指標(biāo)。最后篩選出的與胰腺癌發(fā)病有關(guān)的血清/血漿miRNA組成診斷試劑盒(miR-451和miR-409_3p)。診斷試劑盒可以包括這些血清/血衆(zhòng)微小核糖核酸組合的引物，探針，以及Taq酶、dNTP等試劑。6.統(tǒng)計分析方法運用X 2檢驗(用于分類變量)或者student t檢驗(用于連續(xù)性變量)比較人口學(xué)特征、組織類型和miRNA平均表達(dá)水平在研究對象組間分布的差異。我們在24例胰腺癌病例和24例健康人對照中運用TLDA芯片的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)有6種miRNAs與胰腺癌發(fā)病情況有顯著關(guān)聯(lián)。個體miRNAs檢測的不同表達(dá)水平以表示，其中ACt=CTtMi-CT_，我們在每一個樣本提取時加入cel-mir-39的RNA作為參照，計算相對表達(dá)量。對有統(tǒng)計學(xué)顯著差異的miRNAs在24例胰腺癌病例和24例對照中進(jìn)行單個驗證，進(jìn)而觀察本研究結(jié)果的穩(wěn)定程度。
為了進(jìn)一步研究這兩種miRNAs構(gòu)成的綜合指征用于胰腺癌診斷的效果，我們構(gòu)建了一個數(shù)學(xué)公式，綜合考慮每種miRNA與胰腺癌發(fā)病的正、負(fù)關(guān)聯(lián)情況和聯(lián)系強(qiáng)度。具體來說，首先以健康人對照組miR-451、miR-409-3p表達(dá)量的單側(cè)95%參考值范圍為標(biāo)準(zhǔn)，分別將這2種miRNA的表達(dá)水平評為O分和I分，然后我們再以對照人群的回歸系數(shù)為權(quán)重，綜合考慮每種miRNA的表達(dá)情況給每個病人確定一個危險分值。危險分值的計算方法如下:危險分值=(5. 771XmiR-451的評分)+ (3. 243XmiR-409_3p的評分)，獲得的危險分值系數(shù)以及界限值被直接應(yīng)用于48例樣本人群中。統(tǒng)計學(xué)分析均通過專門的統(tǒng)計學(xué)分析軟件完成(SAS，v. 9. I. 3)。統(tǒng)計學(xué)顯著性水平P值設(shè)為O. 05，所有統(tǒng)計學(xué)檢驗均為雙側(cè)檢驗。以下是本發(fā)明進(jìn)一步的說明在上述48例符合條件的胰腺癌病例及48例健康人對照中，兩組年齡按個體精確匹配。我們將這兩組人群作為探索性樣本TLDA芯片檢測獲得相關(guān)結(jié)果。 根據(jù)TLDA芯片檢測，本發(fā)明人檢測到在“胰腺癌病例”組和“健康人對照”組的血清中存在差異表達(dá)(Λ Λ CT>2)的微小核糖核酸包括hsa-miR-451、hsa_miR-30e、hsa_miR-30a、hsa-miR-766、hsa_miR-30d、hsa-miR-409_3p、hsa-miR-923、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-652、hsa-miR-25、hsa-miR-122、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-345、hsa-miR-16、hsa-miR-140_3p、hsa_miR-20b、hsa-miR-195、hsa-miR-93、hsa-miR-192、hsa-miR-532_5p、 hsa-miR-185、 hsa-miR-486_5p、 hsa_let_7b、 hsa_miR-193b、hsa_miR-20a、hsa-miR-193a_5p、hsa-miR-186、hsa-miR-17、hsa_miR-92a、hsa_miR-19a、hsa-miR-660、hsa_miR-148a、hsa-miR-215、hsa_miR-18a、hsa_miR-106a、hsa_miR-19b、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-152、hsa-miR-223、hsa-miR-128、hsa-miR-130b、hsa-miR-106b、hsa-miR-483_5p、hsa-miR-339_3p、hsa-miR-101。我們選擇在“胰腺癌病例”組和“健康人對照”組中CT值均小于35的miRNA，以提高檢測效率，滿足上述條件的 miRNAs 包括miR-451, miR-30e, miR-30a, miR-766, miR-30d和miR-409-3p。探針法和染料法qRT-PCR結(jié)果均發(fā)現(xiàn)在24例胰腺癌病例和24例健康人對照中，miR-451和miR-409-3p在“胰腺癌病例”組和“健康人對照”組中的表達(dá)情況存在
顯著性差異。多因素Logistic回歸分析結(jié)果表明，這2種miRNAs的表達(dá)水平均與胰腺癌的發(fā)病存在著顯著關(guān)聯(lián)miR-451在病例中高表達(dá)，miR-409-3p在對照中高表達(dá)。根據(jù)上述結(jié)果，將這2種與胰腺癌發(fā)病相關(guān)的miRNAs在24例胰腺癌病例和24例健康人對照中進(jìn)一步的單個驗證。我們發(fā)現(xiàn)血清/血漿高表達(dá)miR-451與胰腺癌發(fā)病相關(guān)聯(lián)，低表達(dá)miR-409-3p與胰腺癌發(fā)病相關(guān)聯(lián)，染料法的結(jié)果與探針法一致。進(jìn)一步分析這2種miRNA的組合用于胰腺癌診斷的效果，發(fā)現(xiàn)其組合對胰腺癌發(fā)病診斷的 AUCtArea Under the ROC Curve, ROC 曲線(Receiver Operating CharacteristicCurve,受試者工作特征曲線)下面積與單個miRNA相比增加。根據(jù)上述實驗結(jié)果，本發(fā)明人制備了一種能用于胰腺癌診斷的試劑盒，包含測定受試者血清/血漿中穩(wěn)定存在且可檢測的成熟miR-451和miR-409-3p的引物和其他檢測試劑。具體而言,這2種miRNAs,或者這2種miRNA的引物組合構(gòu)成的相關(guān)診斷試劑盒有助于胰腺癌的診斷，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者的疾病狀態(tài)和病情嚴(yán)重程度，及時采取更具個性化的防治方案提供支持，從而最大限度提高胰腺癌患者的生存率。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供的血清/血衆(zhòng)微小核糖核酸(microRNAs/miRNAs)標(biāo)志物作為胰腺癌診斷的標(biāo)志物的優(yōu)越性在于(I)血清/血漿miRNAs是一種新型生物標(biāo)志物，區(qū)別于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物,不僅穩(wěn)定、微創(chuàng)、易于檢測，且定量精確，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，該類小分子RNA生物標(biāo)志物的成功開發(fā)有助于胰腺癌的輔助診斷，為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供借鑒。 (2 )血清/血漿miRNAs試劑盒是一種系統(tǒng)、全面的診斷和監(jiān)測試劑盒,可用于胰腺癌患者的輔助診斷，有助于反映胰腺癌患者的疾病狀態(tài)，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者病 情、及時采取更具個性化的防治方案提供支持。(3)采用嚴(yán)密的設(shè)計和評價體系，本發(fā)明人采用TLDA芯片檢測以獲取疾病特異和異常表達(dá)的血清/血漿miRNAs表達(dá)譜，并應(yīng)用qRT-PCR的方法進(jìn)行單個驗證，采用了兩種不同的方法(熒光探針法和染料法)進(jìn)行驗證；以上方法和策略的應(yīng)用加速和保證了血清/血漿miRNAs生物標(biāo)志物和診斷試劑盒的應(yīng)用，也為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供方法和策略上的借鑒。本發(fā)明通過控制年齡和性別等對疾病發(fā)展的影響因素，研究血清/血漿miRNA在胰腺癌輔助診斷的應(yīng)用前景，闡述異常表達(dá)的miRNAs對于胰腺癌進(jìn)展的影響，揭示其篩查和診斷價值。因此，本發(fā)明獲得了胰腺癌發(fā)病相關(guān)血清/血漿miRNAs表達(dá)數(shù)據(jù)庫和特異性標(biāo)志物；通過血清/血漿miRNAs生物標(biāo)志物和診斷試劑盒的研制和應(yīng)用，可使得胰腺癌的診斷更加方便易行，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者病情，為臨床治療效果評價奠定基礎(chǔ)，并為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價值的新型小分子藥物靶標(biāo)提供幫助。


圖I.顯示胰腺癌病例組和健康人對照組miRNA的表達(dá)箱線圖。圖2.顯示胰腺癌病例組對健康人對照組為參照的ROC曲線。其中..................合并miR-451和miR-409_3p :區(qū)分胰腺癌病例組與對照組=AUC
93. 8%，靈敏度95. 8%，特異度91. 7%。.........單獨使用miR-451 :區(qū)分胰腺癌病例組與對照組AUC 91. 7%，靈敏度
91. 7%，特異度91. 7%_______單獨使用miR-409_3p :區(qū)分胰腺癌病例組與對照組AUC 75. 0%，靈敏度
58. 3%，特異度91. 7%
具體實施例方式實施例I樣品的收集和樣品資料的整理病例為2007年6月-2010年12月在淮安市腫瘤醫(yī)院及江蘇省腫瘤醫(yī)院收集的新發(fā)胰腺癌病例，均經(jīng)病理組織學(xué)確診。對照為同期進(jìn)行社區(qū)疾病篩查的健康個體，按性別和年齡(±5歲)與病例進(jìn)行頻數(shù)匹配。用于研究的樣本為同期收取，采樣、分裝、保存條件均一，通過對樣品資料的整理，發(fā)明人從中選擇了 48例符合下列標(biāo)準(zhǔn)的樣本作為TLDA芯片檢測和后續(xù)一系列qRT_PCR驗證的實驗樣品I、新發(fā)胰腺癌病例2、采血前未經(jīng)過手術(shù)和放化療，無手術(shù)前放化療3、與病例年齡、性別匹配的健康人對照并系統(tǒng)采集了這些樣本的人口學(xué)資料、臨床資料等情況。
實施例2血清/血漿中miRNA的TLDA芯片檢測將24例胰腺癌患者和24例健康人對照經(jīng)TLDA芯片檢測獲得相關(guān)結(jié)果。具體步驟為I、分別取“胰腺癌病例”組和“健康人對照”組患者的血清600 μ 1，加入3倍體積的Trizol試劑；2、相分離室溫放置15min，加入終濃度為1(Γ4ρπιο1/μ I的cel-39 (TAKARA)作為內(nèi)參，然后加入與血衆(zhòng)等體積的氯仿，震蕩50s,室溫15min,14, OOOrpm, 4°C,離心15min ；3,RNA沉淀將水相轉(zhuǎn)移到新的15ml的離心管，加入I. 5倍水相體積的無水乙醇，充分混勻；4、用QIAGEN miRNeasy kit富集RNA :每次吸取700 μ 樣本至離心柱中，14，OOOrpm離心15s，棄去收集管中濾液，重復(fù)至樣本均過柱；加入700 μ I洗液1，14, OOOrpm離心15s,棄收集管中濾液；加入500 μ I洗液2,14, OOOrpm離心15s,棄收集管中濾液；再加入500 μ I洗液2，14，OOOrpm離心2min，棄收集管中濾液；將離心柱放回空的收集管中，14，OOOrpm離心2min以干燥離心管；將離心管放入新的I. 5ml管中，加入50 μ I無核酸酶水，10, OOOrpm離心Imin ;將管中的液體倒回離心柱中，14, OOOrpm離心Imin,棄離心柱；5、測量濃度通常能得到 1250ng RNA/600 μ I血清；6、用TLDA芯片配套的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系包括O. 8μ I逆轉(zhuǎn)錄引物(10Χ)、0. 2μ I IOOmM dNTPs混合物、I. 5 μ I逆轉(zhuǎn)錄酶(50U/μ L)、0. 8 μ I IOX逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、O. 9 μ I 25mM氯化鎂、O. I μ I RNA抑制劑以及O. 2 μ I無核酸酶水。加入3μ l(l-350ng)的總RNA。反應(yīng)步驟為16°C孵育2分鐘，42°C反應(yīng)I分鐘，50°C反應(yīng)I秒，上述3步經(jīng)40個循環(huán)反應(yīng)，再85°C孵育5分鐘；7、對芯片特異性的miRNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增以增加表達(dá)所需的cDNA的量。預(yù)擴(kuò)增的反應(yīng)體系包括12. 5μ I預(yù)擴(kuò)增Master Mix (2 X)、2· 5 μ I預(yù)擴(kuò)增引物(10 X)、7· 5 μ I無核酸酶水、2. 5 μ I cDNA。反應(yīng)步驟為95°C 10分鐘一55°C 2分鐘一72°C 2分鐘一95°C 15秒、600C 4分鐘，12個循環(huán)一99. 90C 10分鐘；反應(yīng)結(jié)束后加入75 μ I O. IX TE稀釋；8、取9μ I稀釋后的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，加入450μ I基因表達(dá)Master Mix，441 μ I無核酸酶水，充分混勻后，在TLDA芯片上加入100 μ I/孔；IOOOrpm離心lmin，離心2次。TLDA芯片實驗使用的是ABI Prism 7900突光定量PCR儀。選擇384-well TaqMan Low DensityArray特定的程序進(jìn)行反應(yīng)；9、數(shù)據(jù)分析與處理用RQ-Manger軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Ct閾值設(shè)為O. 2，Δ Ct=Ct#本-Ct39 (cel-39用以控制RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄時的差異)，兩組樣品血清miRNAs的表達(dá)量比值可用方程Λ ACt表示，Λ Λ Ct= Λ Ctsw-Λ Ct WM。運用TLDA芯片檢測發(fā)現(xiàn)的“胰腺癌病例”組和“健康人對照”組中血清差異表達(dá)的微小核糖核酸在上文中(見說明書第5-6頁)已經(jīng)羅列出。實施例3血清/血漿中miRNA的qRT-PCR實驗根據(jù)上述TLDA結(jié)果,選擇滿足下列條件的miRNAs用qRT-PCR方法進(jìn)一步的驗證OTLDA芯片中兩組研究對象的CT值均不大于35以提高檢測效率；2)TLDA芯片中Λ Λ CT大于2。對所選擇的miR-451、miR-409-3p兩個miRNAs設(shè)計逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR的引物(見表I)。對“胰腺癌病例”組和“健康人對照”組的血清單個個體進(jìn)行miRNA的qRT-PCR檢測。在整個研究過程中均實施嚴(yán)格的質(zhì)控。每個樣本連續(xù)檢測三次。所有檢測均采用盲法，即在不清楚樣本背景的情況下完成以避免偏倚。分別用染料法和探針法兩種方法進(jìn)行qRT-PCR檢測。表I相關(guān)miRNA引物信息
miRNA引物(5，-3，)
上游引物 ACACTCCAGCTGGGAAACCGTTACCATTAC
hsa- miR-451--
下游引物 Ci CAACl GGl G I.CGI GGAG i CGGCAA J i CAG l lGAGAAC I CAG i
上游引物 ACACTCCAGCTGGGGAATGTTGCTCGGTGA
hsa- miR-409-3p--
下游引物 CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGGGGTTC
^上游引物 ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTTGAC
hsa-miR-30e--
F 游引物 ΓΤΓΑΑΓΤΟΓιΤΟΤΓΟΤΟΟΑΟΤΓΟΟΓΛΑΤΤΓΑΓ ΤΤΟΑΟΓΤΤΓΓΑΟΤ
'上游引物 ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC
''下游弓 IVM CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTCCAGT
^上游引犧 ACACTCCAGCTGGGAGGAGGAATTGGTGCT
hsa-miR-766 --
下-游引物 CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAAGACCAG
上游引物 ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCCCGAC
hsa-miR-30d--
T 游引物 CTCAArrGGTGTCGTGGAGTCGGCAA 丁 TCAGTTGAGCTTCCAGT(I)制備RNA樣品a)取100 μ I血清；b)加3倍體積的Trizol室溫放置15min，加入終濃度為10-4pmol/μ I的cel-39 (TAKARA)作為內(nèi)參，然后加入與血漿等體積的氯仿，震蕩50s,室溫15min, 14, OOOrpm, 4°C,離心15min ;c)將水相轉(zhuǎn)移到新的15ml的離心管，加入I. 5倍水相體積的無水乙醇，充分混勻；d)用QIAGEN公司的miRNeasy kit富集RNA :每次吸取700 μ I樣本至離心柱中，14，OOOrpm離心15s，棄去收集管中濾液，重復(fù)至樣本均過柱；加入700 μ I洗液1，14，OOOrpm離心15s，棄收集管中濾液；加入500 μ I洗液2，14，OOOrpm離心15s,棄收集管中濾液；再加入500 μ I洗液2,14，OOOrpm離心2min,棄收集管中濾液；將離心柱放回空的收集管中，14，OOOrpm離心2min以干燥離心管；將離心管放入新的I. 5ml管中，加入50 μ I無核酸酶水，10，OOOrpm離心Imin ;將管中的液體倒回離心柱中，14，OOOrpm離心lmin，棄離心柱，將管中的液體作為RNA樣品；(2)探針法使用ABI試劑盒。a)通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。探針法的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括0. 15 μ I IOOmMdNTPs混合物、I μ I逆轉(zhuǎn)錄酶(50U/ μ L)、I. 5 μ I 10Χ逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、0. 19 μ I RNA抑制劑以及3μ I 5Χ逆轉(zhuǎn)錄引物一種或幾種的混合物(指引物總量3μ 1，如一種引物的量為3μ 1，二種引物則分別為I. 5 μ 1，三種引物則分別為I. O μ 1，即多種引物時，每種引物的量為總量的平均值，下同)。加入9. 16 μ I的總RNA。反應(yīng)步驟為16°C孵育30分鐘，42°C反應(yīng)30分鐘，85 °C孵育5分鐘；b) q-PCR 將cDNA加入5 μ I水稀釋，取I μ I稀釋后的cDNA，加入O. 25 μ I20 X MicroRNA檢測探針、2· 5μ I 2 X基因表達(dá)Master Mix、I. 25 μ I雙蒸水，5 μ I體系進(jìn)行q-PCR。儀器使用的是ABI Prism 7900熒光定量PCR儀，PCR的反應(yīng)條件是95°C、5分鐘進(jìn)行I個循環(huán)一950C、15秒，60°C、I分鐘進(jìn)行45個循環(huán)。(3)染料法a)通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。染料法的逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系包括4 μ I 5 X AMV緩沖液、2 μ I IOmM dNTP 混合物(Takara 公司)、0· 5μ I RNase 抑制劑(Takara 公司)、2μ IAMV (Takara公司)以及I. 5μ I miRNA特異性反向引物一種或幾種的混合物。反應(yīng)步驟為16°C孵育15分鐘，42°C反應(yīng)I小時，85°C孵育5分鐘； b) q-PCR :將 cDNA 按 1/5 體積稀釋，取 O. 5μ I 稀釋后的 cDNA，加入 O. 15μ I Taq酶(Takara 公司)，0· 5μ I 20 X EVA GREEN, O. I μ I 10 μ M 正向引物一種，0· I μ I IOyMffl用反向引物(URP:TGGTGTCGTGGAGTCG，SEQ ID No. 15),0. 6μ I 25mM MgCl2,0. 8 μ I 2. 5mMdNTP混合物(Takara公司)，I μ I 10XPCR緩沖液，6. 75 μ I雙蒸水，10 μ I體系進(jìn)行q-PCR。儀器使用的是ABI Prism 7900熒光定量PCR儀，PCR的反應(yīng)條件是95°C、5分鐘進(jìn)行I個循環(huán)一950C、15秒，60°C、I分鐘進(jìn)行45個循環(huán)。(4)數(shù)據(jù)處理與分析兩組樣品血清miRNAs的表達(dá)量比值可用方程f 表示，其中Λ Ct=CTtMi-CT @#，我們在每一個樣本提取時加入cel-39的RNA作為參照，計算相對表達(dá)量(cel-39:SEQ IDNo. 13 和 SEQ ID No. 14)。探針法和染料法qRT-PCR結(jié)果均發(fā)現(xiàn)在48例樣本中，有2種miRNAs (miR-451和miR-409-3p)在兩組間的表達(dá)情況存在顯著性差異，探針法結(jié)果見表2、表3、圖I、圖2、染料法結(jié)果與探針法類似，不再列出。表2單因素logistic回歸分析結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種與胰腺癌相關(guān)的血清/血漿miRNA標(biāo)志物，其特征在于該標(biāo)志物為miR-451和miR-409-3p 的組合。
2.權(quán)利要求I所述的血清/血漿miRNA標(biāo)志物的引物，其特征在于該引物為 miR-451 的引物為 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ;miR-409_3p 的引物為 SEQ ID No. 3 和SEQ ID No. 4。
3.權(quán)利要求I所述的血清/血漿miRNA標(biāo)志物在制備胰腺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的血清/血漿miRNA標(biāo)志物的引物在制備胰腺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
5.一種胰腺癌輔助診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒用于檢測血清/血漿中miR-451和 miR-409-3p。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的診斷試劑盒,其特征在于該試劑盒含有血清/血楽;miRNA中miR-451 和 miR-409_3p 的引物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權(quán)利要求2所述的血清/血漿miRNA標(biāo)志物的引物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒還可以包括PCR反應(yīng)常用的酶和試劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程及腫瘤學(xué)領(lǐng)域，公開了一種與胰腺癌相關(guān)的血清/血漿miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用。該標(biāo)志物為miR-451和miR-409-3p的組合。該標(biāo)志物及其引物可用于制備診斷試劑盒，用于胰腺癌的輔助診斷。
文檔編號C12N15/113GK102876676SQ20121035970
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月24日
發(fā)明者潘峰, 高勇, 祁付珍, 胡志斌, 董靜, 聞洋 申請人:南京醫(yī)科大學(xué)