專利名稱：一種don 降解酶的編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶基因工程及酶工程領(lǐng)域，涉及一種DON降解酶的編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalnol，D0N)，又稱嘔吐毒素(vomitoxinorvomitingtoxin, VT),是單端孢霉烯族毒素中的一種,在自然界中廣泛存在，主要由鐮刀菌屬的黃色鐮刀菌和禾谷鐮刀菌產(chǎn)生，是鐮孢菌、頭孢菌和木霉菌等真菌的次級代謝產(chǎn)物之一。DON為雪腐鐮刀菌烯醇(nivalenol，NIV)的脫氧衍生物，可溶于極性溶劑和水，如含水甲醇、含水乙醇或乙酸乙酯等，但不溶于乙醚和正己烷。DON屬天然產(chǎn)物，通過人工合成途徑極難獲得。DON具有較強(qiáng)的熱抵抗力和耐酸性，在乙酸乙酯中可長期保存。DON非常耐 存貯，結(jié)構(gòu)式如下。
八8> e、Z
0 / 1 OE 0H CH3'HDON作為常見的真菌毒素之一，自然發(fā)生于食品污染物，污染糧食最為普遍，主要污染谷物及其制品。而且可能與人的食道癌及大骨節(jié)病的發(fā)生有關(guān)系。我國糧食中DON的污染呈高污染率、高濃度的趨勢。為了阻止霉菌毒素在食物鏈中傳播，我國規(guī)定豬、犢牛、泌乳期動物配合飼料中DON含量不得超過Img · kg—1，牛和家禽的配合飼料中DON的含量少量超過5mg · kg'德國在2005年提出除了面包中DON的最大建議量為500 μ g -kg^1外，谷物及食品中DON的最大量為750μ g · kg'加拿大和美國規(guī)定供人食用小麥中DON的限量標(biāo)準(zhǔn)為2mg · kg—1，嬰兒食品為Img · kg'DON的結(jié)構(gòu)中12-13環(huán)氧環(huán)是引起DON毒性的主要基團(tuán)，如果該基團(tuán)被破壞，將極大的降低DON的毒性，簽于此，本專利通過克隆及表達(dá)塔賓曲霉(H6)中DON降解酶基因，生產(chǎn)DON降解酶來對DON的結(jié)構(gòu)中12-13環(huán)氧環(huán)進(jìn)行水解，以降低DON的毒性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種DON降解酶的基因。本發(fā)明的另一目的是提供該基因編碼的DON降解酶。本發(fā)明的又一目的是提供該基因的應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
一種DON降解酶基因，縮寫為eh基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。本發(fā)明所述的eh基因編碼的DON降解酶，縮寫為酶，其氨基酸序列如SEQ IDNO. 2所示。含有本發(fā)明所述的DON降解酶的表達(dá)載體。含有本發(fā)明所述的DON降解酶的工程菌。本發(fā)明所述的DON降解酶基因在制備DON脫毒劑(即DON降解劑)中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的DON降解酶在降解DON中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的表達(dá)載體在制備DON脫毒劑(即DON降解劑)中的應(yīng)用。有益效果 本發(fā)明以脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)為唯一碳源，通過富集培養(yǎng)從土壤中分離到一株可以生物轉(zhuǎn)化DON的真菌塔賓曲霉H6 (CCTCC NO :M2012128)。通過克隆塔賓曲霉H6中DON降解酶-環(huán)氧化物水解酶基因并表達(dá)，獲得了 DON降解酶，可用于制備DON脫毒劑或降解劑，為實(shí)際生產(chǎn)中DON的降解提供有效的生物脫毒辦法，對于霉菌毒素的脫毒具有重要意義。本發(fā)明還具備DON降解酶基因克隆表達(dá)方法簡便可行，DON降解酶基因表達(dá)蛋白特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。


圖I H6菌中eh基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中，M表示Marker，泳道1-2表示RT-PCR產(chǎn)物。圖2 pMD-EHa/DH5 α質(zhì)粒PCR結(jié)果，其中，M表示Marker，泳道1-4表示質(zhì)粒PCR結(jié)果。圖3 pET-EHse表達(dá)載體及含有該載體的E. coli BL21PCR鑒定結(jié)果，其中M表示DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 4泳道.E. coli BL21菌液PCR結(jié)果；1’ 4’ . pET-EHse質(zhì)粒PCR結(jié)果O圖4 pET-EHse在BL21中表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(低);1 3.未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4h的BL21，pET32a( + )/BL21，pET-EHse/BL21 ；4 6.經(jīng)終濃度為 Immol · L-1IPTG 誘導(dǎo) 4h 后的 pET_EHse/BL21，pET32a(+ ) /BL21, BL21。圖5優(yōu)化培養(yǎng)條件后的可溶蛋白與包涵體蛋白SDS-PAGE分析M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(低)；1.可溶蛋白；2.包涵體蛋白。生物材料保藏信息塔賓曲霉H6,分類命名為Aspergillus tubingensis H6,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱為CCTCC，保藏地址為中國武漢，武漢大學(xué)，保藏日期為2012年4月24日，保藏編號為 CCTCC NO M2012128o
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I塔賓曲霉H6(CCTCC NO :M2012128)是申請者以脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)為唯一碳源，通過富集培養(yǎng)從土壤中分離到一株可以生物轉(zhuǎn)化DON的真菌。用真菌通用引物ITSl和 ITS4 擴(kuò)增了該菌的 ITS 區(qū)間(Internal transcribed spacer),包括 ITSl 和 ITS2,擴(kuò)增片段大小為565bp，通過在GenBank數(shù)據(jù)庫上比較將該菌鑒定了屬，然后用種間弓I物Bt2a和Bt2b擴(kuò)增了該菌的β-tubulin基因序列，擴(kuò)增片段大小為511pb。通過ITS和β-tubulin基因序列分析和形態(tài)學(xué)觀察最終鑒定該菌株為塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)。該菌的β -tubulin基因序列在GenBank的登錄號為DQ902579。實(shí)施例2eh基因的克隆2. I塔賓曲霉H6的活化及擴(kuò)增培養(yǎng)將一 70°C保存的塔賓曲霉H6 (CCTCC NO :M2012128)挑一接種環(huán)于察氏固體培養(yǎng)基平面上劃線，28°C，培養(yǎng)4d。轉(zhuǎn)接2次。從平板上挑取一環(huán)菌于裝有50mL察氏液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，28°C，150r · min-1搖床培養(yǎng)30h。以1%的接種量吸取種子液于IOOmL察氏液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，28°C，150r · min-1搖床培養(yǎng)5d。2. 2塔賓曲霉H6總RNA的提取及測定 取28°C, 150r · min-1 搖床培養(yǎng) 5d 的菌液 2OmL, 12000r · min-1 離心 25min,去除上清，收集菌體。用吸水紙吸干上面的液體。稱取干燥后的菌絲體，通過RNAisoTM Plus勻漿法提取H6的總RNA，于超凈臺中晾干沉淀。用50 100 μ L無Rnase水溶解沉淀。在260nm和280nm波長處測其吸光值。結(jié)果0D260/0D280比值在I. 7-2. O之間。提取物進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳。2. 3RT-PCR以塔賓曲霉H6總RNA為模版，Oligo (T) 15為引物進(jìn)行RT，獲得含有目的基因的cDNA第一鏈。再以此為模版，EHa-I和EHa_2為引物進(jìn)行PCR，獲得塔賓曲霉H6的eh基因片段。EHa-I 5/ -TTGAATTCCATATGGCACTCGCTTACAGCAAC-3，(SEQ ID NO. 3)；EHa-2 5/ -TAGGATCCATCTCATTTTCTACCAG-3’(SEQ ID NO. 4);依次在100 μ L EP管中加入下列PCR反應(yīng)液ddH20 31 μ L, dNTP (各2. 5mM)4μ L, IOXPCRbuffer 5 μ L, MgCl2 (25mM,加之前要搖勻)4 μ L，EHal (20 μ Μ) I μ L，EHa2 (20 μ Μ) I μ L，模板 cDNA 3 μ L，Takara rTaq 酶 I μ L?；靹蚝?，低速離心 15s。反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s, 52°C lmin，72°C延伸lmin,30個循環(huán)；然后72。。延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)I. 0%瓊脂糖凝膠電泳，電壓為3 5V/cm，在紫外光下觀察結(jié)果，使用凝膠成像系統(tǒng)照像并記錄，結(jié)果如圖I。切取含有目的基因片段的凝膠，放入無菌I. 5mL離心管中稱重，使用BI0MIGA膠回收純化試劑盒進(jìn)行目的片段回收，4°C保存?zhèn)溆谩?. 4 pMD-EHa克隆載體的構(gòu)建利用Takara pMD 18-T Simple Vector與2. 3中回收的eh基因片段連接。制備DH5a大腸桿菌感受態(tài)，采用熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5 a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。篩選、PCR鑒定鑒定大腸桿菌陽性克隆(PCR鑒定的方法同2. 3)，結(jié)果見圖2。將4株陽性克隆進(jìn)行編號，分別為 pMD-EHal、pMD-EHa 2、pMD_EHa 3、pMD_EHa 4。取 pMD-EHa I 送去測序，測序結(jié)果見SEQ ID NO. I。將測得序列與Genebank上的Aspergillus niger SQ-6的mRNA的全序列相比較，有91%的相似性。實(shí)施例3 pET-EHse表達(dá)載體的構(gòu)建3. I使用引物Hlse I與Hlse 2擴(kuò)增pMD-EHa重組質(zhì)粒
EHse-I 5/ -GATGAATTCATGGCACTCGCTTACAGCAAC-3’ (SEQ ID NO. 5)EcoR IEHse-2 5/ -CGTGTCGACATCTCATTTTCTACCA-3’ (SEQ ID NO. 6)Sal I 擴(kuò)增pMD-EHa重組質(zhì)粒，反應(yīng)體系為pMD_EHa重組質(zhì)粒I μ L，2 X PCR Mix12. 5 μ L，EHse I (10 μ mol · L-1) I μ L, EHse 2 (10 μ mol · L-1) I μ L, ddH20 補(bǔ)齊至 25 μ L ；混勻后，離心15s。反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，52°C lmin，72°C延伸lmin，30個循環(huán)；然后72°C延伸5min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定并記錄。切膠回收PCR產(chǎn)物。3. 2 pET-EHse表達(dá)載體的構(gòu)建 利用Takara pMD 18-T Simple Vector與3· I中回收的PCR產(chǎn)物連接得到PMD-EHse克隆載體，篩選并雙酶切鑒定pMD-EHse大腸桿菌陽性克隆。用SalI和EcoRI對pMD_EHse重組質(zhì)粒和載體pET_32a質(zhì)粒雙酶切。切膠回收酶切后得到的目的片段，用T4連接酶連接酶切片段。采用熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到T0P10感受態(tài)細(xì)胞中。挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA，將其作為模板瓊脂糖凝膠電泳觀察記錄PCR結(jié)果。用SalI和EcoRI再次雙酶切重組載體pET-EHse質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳觀察并記錄酶切結(jié)果。采用熱激法將已檢測無誤的重組子轉(zhuǎn)化到宿主菌E. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中，挑選轉(zhuǎn)化后的BL21陽性克隆，進(jìn)行菌液PCR與質(zhì)粒PCR，并且進(jìn)行雙酶切鑒定，進(jìn)行PCR及酶切檢測。結(jié)果表明該陽性克隆包含重組質(zhì)粒pET-Ehse，結(jié)果見圖3。實(shí)施例4H1的誘導(dǎo)表達(dá)4. I EH的誘導(dǎo)表達(dá)a)分別從甘油保存含有pET-EHse重組質(zhì)粒的BL21、含有pET 32a( + )質(zhì)粒的BL21與不含載體質(zhì)粒的BL21菌中接一環(huán)細(xì)胞加入3mL Amp LB培養(yǎng)基中。37°C，200rpm培養(yǎng)至OD600 約為 O. 5。b)將3mL菌液加入IOOmL Amp LB培養(yǎng)基中。37°C，200rpm培養(yǎng)。生長過程中無菌條件下取出菌液測定0D_值。當(dāng)OD6tltl值約為O. 8時，將IOOmL菌液分為2份各50mL。其中一份加入IPTG至終濃度為Immol · L—1。另一份不加IPTG作為不誘導(dǎo)對照。25°C，180rpm，培養(yǎng)16h。產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有pET_EHse重組質(zhì)粒的BL21總蛋白提取物中有一條蛋白條帶，大小量約為63. 5KDa (圖4)，與預(yù)期的融合蛋白大小一致，確定為目的蛋白。4. 2 EH 的分析對細(xì)胞總蛋白、培養(yǎng)基、細(xì)胞周質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)可溶部分、細(xì)胞質(zhì)不溶部分中的組分進(jìn)行分析，觀察融合蛋白表達(dá)位置。SDS-PAGE結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)生長條件為25°C，200r · mirT1，IPTG終濃度為Immol · Γ1誘導(dǎo)16h時，在誘導(dǎo)組和非誘導(dǎo)組的培養(yǎng)基上清中均有少量的蛋白，但目的蛋白在細(xì)胞質(zhì)可溶部分與細(xì)胞質(zhì)不溶部分中含量更多。優(yōu)化培養(yǎng)條件改為25°C，200r · mirT1，IPTG終濃度為O. 4mmol · I/1誘導(dǎo)16h時，SDS-PAGE結(jié)果中可見，可溶蛋白與包涵體蛋白量之間的比例近似為I : I。4. 3 EH 的純化使用一站式His蛋白微量純化試劑盒對細(xì)胞裂解上清與包涵體進(jìn)行純化。SDS-PAGE結(jié)果(圖5)可見細(xì)胞裂解上清與包涵體進(jìn)行純化后，有一條63. 5KDa大小的條帶?？捡R斯蛋白定量試劑盒測定純化后蛋白含量，在培養(yǎng)條件為約25°C，200r ^irT1, IPTG終濃度為O. 4mmol · Γ1誘導(dǎo)16h時，目的蛋白表達(dá)量約為2. 3g · Γ1菌液。實(shí)施例5 EH酶對DON的水解效果將純化的lg/mL EH與10ng/mL DON,在pH為O的PBS中，35 °C恒溫振蕩反應(yīng) 30min，提取溶液中的D0N，用HPLC檢測對DON的水解效果，水解率為73. 82 % 75. 6 %。對照組的水解率為O %。
權(quán)利要求
1.一種DON降解酶基因，縮寫為eh，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.—種權(quán)利要求I所述的基因編碼的DON降解酶，縮寫為H1，其氨基酸序列如SEQ IDNO. 2所示。
3.含有權(quán)利要求I所述的DON降解酶基因的表達(dá)載體。
4.含有權(quán)利要求I所述的DON降解酶基因的基因工程菌。
5.權(quán)利要求I所述的DON降解酶基因在制備DON脫毒劑中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求2所述的DON降解酶在降解DON中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體在制備DON脫毒劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，涉及一種DON降解酶的編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明所述的DON降解酶基因eh核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼的DON降解酶氨基酸序列如SEQID NO.2所示。本發(fā)明還提供了含有基因eh的大腸桿菌表達(dá)載體pET-EHse以及在大腸桿菌中的高效表達(dá)。本發(fā)明可用于降解霉菌毒素DON工業(yè)化生產(chǎn)的基因工程菌的構(gòu)建，提高微生物中降解霉菌毒素DON的水平和質(zhì)量。
文檔編號C12N1/15GK102827854SQ20121035988
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月24日
發(fā)明者何成華, 樊彥紅, 皇超英, 孟玲玲, 楊彥瓊, 張海彬 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)