專利名稱：利用調(diào)控蛋白ALsR適度加強(qiáng)枯草芽孢桿菌乙偶姻合成的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
利用正向調(diào)控蛋白適度加強(qiáng)枯草芽孢桿菌乙偶姻合成途徑，屬于生物工程中基因技術(shù)與發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乙偶姻(3-羥基-2- 丁酮)，為淡黃色液體，長期放置生成二聚體，微溶于水和乙醇、丙二醇等有機(jī)熔劑，熔點(diǎn)15°C，沸點(diǎn)143 148°C。乙偶姻自然界存在于玉米、葡萄、可可、蘋果、香蕉、干酪、肉類等許多食品中。是一種應(yīng)用廣泛、令人喜愛的食用香料，并且在其它眾多行業(yè)中也有廣泛的應(yīng)用。
在食品中的應(yīng)用主要用作奶油、乳品、酸奶和草莓型等香料的生產(chǎn)，國家標(biāo)準(zhǔn)GB2760-86規(guī)定其為允許使用的食品香料。80%含量的乙偶姻俗稱“醋嗡”，是酒類調(diào)香中一個(gè)極其重要的品種。該產(chǎn)品因其應(yīng)用范圍極其廣泛，用量也較大，是奶用、酒用香料中的重要品種。在制藥行業(yè)采用乙偶姻和光氣為原料合成重要醫(yī)藥中間體CDMD0，乙偶姻還可以合成抗菌藥倫氨芐西林鹽酸鹽。在化工行業(yè)乙偶姻可以合成起泡劑、殺菌和殺蟲劑，含氯聚合物的穩(wěn)定劑，另外乙偶姻還是一種昆蟲的性激素。乙偶姻生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法。化學(xué)合成法生產(chǎn)乙偶姻存在著產(chǎn)品收率和得率較低，且環(huán)境污染較嚴(yán)重等缺點(diǎn)，而且產(chǎn)品質(zhì)量很難達(dá)到目前乙偶姻的最大消費(fèi)領(lǐng)域——食用香料的要求；更為嚴(yán)重的是這三種工藝的原料來源受阻，導(dǎo)致了適用化學(xué)法生產(chǎn)乙偶姻難以大規(guī)模發(fā)展。酶法轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)乙偶姻產(chǎn)物得率高，沒有其它副產(chǎn)物，并且產(chǎn)物具有旋光度，但要獲得大量特異性的酶比較困難。發(fā)酵法生產(chǎn)乙偶姻首先成本較低，其次對(duì)環(huán)境污染也較小，并且以葡萄糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻大大減輕了原料來源的限制。目前，發(fā)酵法生產(chǎn)乙偶姻的方法，國內(nèi)外還大都處在研究階段。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)枯草芽孢桿菌代謝途徑中的某一個(gè)酶，會(huì)使得整個(gè)菌體的代謝變慢，代謝流的協(xié)調(diào)性降低，并且過量表達(dá)的蛋白造成了代謝能量的浪費(fèi)。因此需要一個(gè)較弱的啟動(dòng)子來適度的加強(qiáng)表達(dá)代謝途徑中的關(guān)鍵酶來加強(qiáng)某一產(chǎn)物的代謝流。課題組在研究枯草芽孢桿菌bdhA基因的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)其上游啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)導(dǎo)致該啟動(dòng)子的啟動(dòng)效率較低，因此構(gòu)建了具有適度加強(qiáng)型啟動(dòng)子PbdhA的枯草芽孢桿菌表達(dá)質(zhì)粒pMA5_PbdhA0枯草芽孢桿菌利用糖制原料合成乙偶姻的過程首先是通過EMP途徑將葡萄糖轉(zhuǎn)變成丙酮酸；其次是在α -乙酰乳酸合成酶(ALSS)的催化下合成α -乙酰乳酸；然后在α-乙酰乳酸脫羧酶(ALSD)的作用下生成乙偶姻，乙偶姻又會(huì)在乙偶姻還原酶/2，3-丁二醇脫氫酶的作用下和2，3-丁二醇相互轉(zhuǎn)換。研究結(jié)果表明在Bacillus subtilis 168中分別單一的過量表達(dá)ALSS和ALSD不僅沒有提高乙偶姻的產(chǎn)量，還使得工程菌的生長速率及底物消耗速率下降。文獻(xiàn)報(bào)道編碼ALSS和ALSD的基因alsS和alsD在同一個(gè)操縱子中，并且受到alsR編碼的調(diào)控蛋白ALsR的正向調(diào)控作用?；谝陨匣A(chǔ)，本發(fā)明利用PbdhA來適度加強(qiáng)表達(dá)alsR基因，使得乙偶姻合成途徑中由丙酮酸到乙偶姻支路中的兩個(gè)酶同時(shí)受到ALsR正向調(diào)控作用，最終使得乙偶姻和2，3-丁二醇的總產(chǎn)量提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要研究內(nèi)容利用分子技術(shù)分別克隆了來自實(shí)驗(yàn)室前期篩選得到的 Bacillus subtilis JNA(保藏號(hào) CCTCC M209309 2009. 12. 21 ;專利申請(qǐng)公布號(hào) CN101864381A)的PbdhA和alsR基因，構(gòu)建重組表達(dá)載體pMA5-PbdhA_alsR，并將其轉(zhuǎn)化Bacillus subtilis 168,成功構(gòu)建基因工程菌pMA5-PbdhA_alsR/B· subtilis 168。對(duì)該菌的酶活力及發(fā)酵性能進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)乙偶姻合成途徑相關(guān)酶的活力得到加強(qiáng)并且乙偶姻的生產(chǎn)效率得到提高，為微生物發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻的工業(yè)化提供了有益的指導(dǎo)。 本發(fā)明的技術(shù)方案I.引物設(shè)計(jì)及PCR條件根據(jù)NCBI中枯草芽孢桿菌的全基因組核酸序列中PbdhA和alsR基因序列設(shè)計(jì)PCI^_P1、P2、P3、P4、P5、P6。其中引物Pl和P2設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)將alsR基因連接在pMA5上強(qiáng)啟動(dòng)子HPaII后面，P3和P4將alsR基因連接在PbdhA后面，P5和P6為PbdhA引物。PCR 反應(yīng)體系10 X ExTaq Buffer2. 5 μ L, dNTP 2 μ L，模板 DNA lyL，上下游引物各O. 5 μ L，ExTaq 酶 0· 5 μ L，ddH20 補(bǔ)齊至總體積 25 μ L。PCR 反應(yīng)條件94°C 4min, 94°C 90s,56°C 90s, 72°C 120s，循環(huán) 30 次，72°C IOmin, 15°C IOmin0Pl :5，-ACCG GGATCC ATGGAGCTTCGCCA-3J (BamH I)P2 :5’ -5’ -ACCG ACGCGT TCATGTACCTGCATC-3J (Mlu I)P3 :5，-ACCG GATATC ATGGAGCTTCGCCA-3J (EcoR V)P4 :5’ -ACCG AAGCTT TCATGTACCTGCATC-3’ (Hind III)P5 :5’ -ACCG GAATTC TTCGTCCCCCTGTTTGTT-3’ (EcoR I)P6 :5，-ACCG GATATC GGATTACCACTCCTATAACT-3J (EcoR V)2.重組表達(dá)載體的構(gòu)建以B. subtilis JNA(CCTCC M209309)染色體DNA作為模板，根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)好的引物P5和P6、PCR擴(kuò)增條件和擴(kuò)增體系進(jìn)行PCR。采用凝膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，電泳檢驗(yàn)回收產(chǎn)物的濃度。采用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對(duì)載體PMA5和純化的PCR產(chǎn)物雙酶切，電泳檢驗(yàn)酶切產(chǎn)物，并用凝膠回收試劑盒對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收。將載體和PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶過夜連接。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E. coli JM109的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取陽性轉(zhuǎn)化子于IOmL的LB(Amp+)培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證正確即成功構(gòu)建pMA5-PbdhA，將菌液加入甘油于-40 V冰箱保存。用同樣的方法利用弓I物Pl，P2，P3，P4擴(kuò)增得到alsR片段，將其分別連接到載體pMA5_HPaII和pMA5_PbdhA上，并成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pMA5-HPaII-alsR和pMA5-PbdhA_alsR。3.化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒到模式菌株B. subtilis 168將經(jīng)驗(yàn)證構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pMA5-HpaII-alsR和pMA5-PbdhA_alsR用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至模式菌株Bacillus subtilis 168中表達(dá)。轉(zhuǎn)化方法為采用改進(jìn)的Spizizen法。挑取在具有卡那霉素抗生素壓力平板上長出的菌落，搖瓶發(fā)酵，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證。4.重組 B. subtilis 168 酶活測定
將培養(yǎng)24h的菌液8000rpm 4 V離心lOmin，收集到的菌體用細(xì)胞洗滌液(NaH2PO4O. 2Mm, Na2HPO4 2. 2mM, NaCl 8. 5mM, pH 7. 4)洗滌三遍，然后懸于 IOmL 洗滌液中。采用超聲波細(xì)胞破碎法破碎細(xì)胞(300W，工作IS隔3S，工作時(shí)間4min)，15000rpm 4°C離心30min，得到上清即為粗酶液。ALS 活性的測定磷酸緩沖液(A 液):Imo I/L K2HP0461. 5mL 和 Imo I/LKH2PO438. 5m用去離子水定容至1L。提取緩沖液(B液)5mM MgCl2、IOmM丙酮酸鈉、O. ImM FAD、O. 5mMTPPUmM DTT用A液定容至250mL。酶促反應(yīng)液(C液)5mM MgCl2、IOOmM丙酮酸鈉、O. ImM FADUmM TPP用A液定容至50mL。顯色液0. 5%肌酸、5% NaOH、5% α-萘酚、去離子水按I : I : I : 5. 3配制取粗酶液用B液稀釋100倍作為反應(yīng)酶液，取300 μ L，加入ImL C液在37 °C反應(yīng)lh，迅速加入200 μ L 3Μ H2SOjS止反應(yīng)，在60°C水浴脫羧15min，之后加入8. 5mL顯色液(O. 5%肌酸、5% NaOH、5% α-萘酚、去離子水按I : I : I : 5. 6配制)在37°C顯色30min，在520nm下測OD值。一個(gè)單位酶活(IU)定義為在37°C，pH 7. O的反應(yīng)條件下，一分鐘合成I μ mo I乙酰乳酸所用的酶量。 ALDC活性的測定乙偶姻在堿性條件下可以與肌酸和α -萘酚的混合物反應(yīng)生成紅色的物質(zhì)，在一定的范圍內(nèi)生成的紅色物質(zhì)的吸光值與乙偶姻的含量成正比，根據(jù)這一原理，來測定α -乙酰乳酸脫羧酶的活性。取200 μ L粗酶液與200 μ L底物混合，在30°C水浴反應(yīng)IOmin加入4. 6mL顯色劑30°C水浴30min顯色，520nm處測定吸光值。一個(gè)單位酶活(IU)定義為在30°C，pH 6.0的反應(yīng)條件下，一分鐘使α -乙酰乳酸脫羧形成Iymol乙偶姻的酶量。5.培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件LB培養(yǎng)基蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，NaCl 10g/l (固體培養(yǎng)基加入2 %瓊脂粉)。發(fā)酵培養(yǎng)基與條件將菌株接種于50ml種子培養(yǎng)基(蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，NaCl 10g/l，葡萄糖 20g/l)的 250ml 的三角瓶中，37°C，150r/min，培養(yǎng) 8h 后，按 5% (v/v)接種量加入到含有10%葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中(玉米漿6g/l，酵母膏5g/l，尿素2g/l，pH6. 8)，37°C，150r/min,培養(yǎng) 120h。6.發(fā)酵液主要產(chǎn)物定量測定毛細(xì)管柱氣相色譜檢測發(fā)酵液中的產(chǎn)物，條件為柱箱230°C，檢測器250°C，柱溫160°C，進(jìn)樣量O. 2μ 1，載氣流量O. 06ml/min，采用FID檢測器。本發(fā)明的有益效果通過基因工程手段擴(kuò)增枯草芽孢桿菌中的調(diào)控蛋白alsR基因，借助于本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的適度加強(qiáng)型表達(dá)質(zhì)粒及枯草模式菌株B. subtilis 168,構(gòu)建重組菌pMA5-PbdhA-alsR/B. subtilis 168。將該菌以5 %的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)144h，乙偶姻產(chǎn)量達(dá)到約31. 8g/l，2，3-丁二醇約15. lg/Ι，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到95. 9%，比菌株B. subtilis 168 提高了約 29%。將較廉價(jià)底物葡萄糖轉(zhuǎn)化成具有附加價(jià)值較高的乙偶姻，其是重要的化工原料和醫(yī)藥中間體；同時(shí)用微生物法生產(chǎn)乙偶姻，其較之化學(xué)生產(chǎn)法具有反應(yīng)條件溫和、原料利用率高、產(chǎn)品純度高及工藝簡單、易于控制等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)有利于環(huán)境保護(hù)，易于推廣應(yīng)用。


圖I 酶切驗(yàn)證 pMA5-PHpaII_alsR 和 pMA5-PbdhA_alsRIHind III 單酶切；2EcoR V, Hind III 雙酶切；3BamH I 單酶切；4BamH I, Mlu I雙酶切；5DL2000 Marker ；6Hind III Marker圖2PCR 驗(yàn)證 pMA5-PbdhA-alsR/B. subtilis 168 轉(zhuǎn)化子I DL2000 Marker ;2PbdhA_alsR 片段；3alsR 片段；4Hind III Marker具體實(shí)施方法實(shí)施例I :重組B. subtilis 168菌株的構(gòu)建
以B. subtilis JNA(CCTCC M209309)為出發(fā)菌株，以其染色體為模板，利用PCR手段獲得啟動(dòng)子基因PbdhA及調(diào)控蛋白基因alsR，將基因和載體用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切，過夜連接并轉(zhuǎn)化E. coli JM109的感受態(tài)細(xì)胞。在Amp抗性平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，并提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證。將構(gòu)建好的質(zhì)粒通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化B. subtilis 168,從卡納霉素平板上挑取陽性菌落并提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證最終獲得基因工程菌pMA5-HpaII-alsR/B. subtilis168 和 pMA5-PbdhA-alsR/B. subtilis 168。實(shí)施例2 =ALS和ALDC酶活力測定菌株B. subtilis 168、pMA5-HpaII_alsR/B· subtilis 168 和 pMA5-PbdhA_alsR/B. subtilis 168在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)24h，8000rpm離心lOmin，收集到的菌體用細(xì)胞洗滌液(NaH2PO4O. 2Mm, Na2HPO4 2. 2mM, NaCl 8. 5mM, pH 7. 4)洗滌三遍，然后懸于 IOmL 洗滌液中。采用超聲波細(xì)胞破碎法破碎細(xì)胞(300W，工作IS隔3S，工作時(shí)間4min)，15000rpm 4°C離心30min，得到上清即為粗酶液。按照技術(shù)方案中所述酶活測定方法分別測定三株菌中ALS和ALDC的酶活力。實(shí)施例3 :重組菌與宿主菌發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻和2，3- 丁二醇性能檢測將菌株接種于50ml種子培養(yǎng)基(蛋白胨10g/l,酵母膏5g/l,葡萄糖20g/l)的250ml的三角瓶中，37°C，150r/min，培養(yǎng)8h后，按5% (v/v)接種量加入到含有10%葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中(玉米衆(zhòng)6g/l,酵母膏5g/l,尿素2g/l, pH 6. 8)，37°C, 150r/min,培養(yǎng)144h，經(jīng)毛細(xì)管氣相色譜檢測。其中菌株pMA5-PbdhA-alsR/B. subtilis 168乙偶姻產(chǎn)量達(dá)到約31. 8g/l，2，3- 丁二醇約15. lg/Ι，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到95.9%,比菌株B. subtilis 168提高了約 29%,比 pMA5-HpaII-alsR/B. subtilis 168 提高約 9. 3%
權(quán)利要求
1.一種新型表達(dá)載體的構(gòu)建，其特征是以B. subtilis JNA基因組DNA為模板，擴(kuò)增得到啟動(dòng)子基因PbdhA，將其克隆到枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pMA5上，構(gòu)建重組適度加強(qiáng)表達(dá)型質(zhì)粒 pMA5-PbdhA。
2.一種適度加強(qiáng)表達(dá)調(diào)控蛋白ALsR的表達(dá)載體的構(gòu)建，其特征是以B. subtilis JNA基因組DNA為模板，擴(kuò)增得到編碼調(diào)控蛋白ALsR的基因alsR，將其克隆到具有適度加強(qiáng)型啟動(dòng)子的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pMA5-PbdhA上，獲得重組質(zhì)粒pMA5-PbdhA-alsR。
3.—種重組枯草芽孢桿菌基因工程菌，其特征是將權(quán)利要求2中構(gòu)建的重組載體pMA5-PbdhA-alsR用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到模式菌株B. subtilis 168中，重組枯草芽孢桿菌中ALS和ALSD酶活較宿主菌有一定提高。
4.權(quán)利要求3所述的菌株在發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻中的應(yīng)用，其特征是將該菌株接種于含有50ml種子培養(yǎng)基(蛋白胨10g/l,酵母膏5g/l, NaCl 10g/l,葡萄糖20g/l,去離子水配置)的250ml的三角瓶中，37°C，150r/min培養(yǎng)8h后，按5%接種量加入到含有10%葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中(該發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為玉米漿6g/l，酵母膏5g/l，尿素2g/l，去離子水配置，pH6. 8)，37°C，150r/min培養(yǎng)144h，最終乙偶姻產(chǎn)量達(dá)到約31. 8g/l，2，3- 丁二醇約.15. lg/Ι，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到95. 9%，比菌株B. subtilis 168提高了約29% ·。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用調(diào)控蛋白ALsR適度加強(qiáng)枯草芽孢桿菌乙偶姻合成。本發(fā)明通過基因工程手段擴(kuò)增B.subtilis JNA中的啟動(dòng)子基因PbdhA和調(diào)控蛋白基因alsR，構(gòu)建重組菌pMA5-PbdhA-alsR/B.subtilis 168。對(duì)該菌的酶活力及發(fā)酵性能進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)乙偶姻合成途徑相關(guān)酶的活力得到加強(qiáng)并且乙偶姻的生產(chǎn)效率得到提高。將該菌以5％的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)144h，乙偶姻產(chǎn)量達(dá)到約31.8g/l，2，3-丁二醇約15.1g/l，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到95.9％，比菌株B.subtilis 168提高了約29％。本發(fā)明為微生物工業(yè)化生產(chǎn)乙偶姻提供有益指導(dǎo)。
文檔編號(hào)C12N15/75GK102876703SQ20121036050
公開日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月20日
發(fā)明者饒志明, 張顯, 楊套偉, 徐美娟, 李靜靜, 張靜, 劉俊佳 申請(qǐng)人:江南大學(xué)