專利名稱:一種枯草芽孢桿菌β-甘露聚糖酶的耐酸性改造的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
發(fā)明涉及ー種β -甘露聚糖酶耐酸性定點改造的方法,屬于分子生物學(xué)和基因エ程領(lǐng)域。
背景技術(shù):
β -甘露聚糖酶(β -mannanase EC 3. 2. 1. 78)是一種半纖維素水解酶,以內(nèi)切方式降解β_1,4糖苷鍵,降解產(chǎn)物的非還原末端為甘露糖,其作用底物包括葡萄甘露聚糖,半乳甘露聚糖及β_甘露聚糖等,β_甘露聚糖酶的來源非常廣泛,包括植物、細(xì)菌、真菌、放線菌甚至軟體動物。 β -甘露聚糖酶可消除食料中甘露聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用,改善飼料的營養(yǎng)價值,以及配合其他的酶(木聚糖酶、蛋白酶)進(jìn)ー步提高家畜的生產(chǎn)性能;作為ー種典型的飼料用酶,其需要滿足飼料生產(chǎn)以及動物消化系統(tǒng)對酶的性質(zhì)的特殊要求,但由于動物腸道對pH的要求在PH2. 0左右,而本項目前期對純化到的β -甘露聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)分析表明,其最適pH為pH6. 5,在pH4. 0以下迅速失活,故為了使其pH特性適合飼料用酶對pH的特殊要求,在理性分析其三維結(jié)構(gòu)的的基礎(chǔ)上,對β_甘露聚糖酶進(jìn)行耐酸性的定點改造,以圖得到符合エ業(yè)化需要的產(chǎn)β_甘露聚糖酶重組菌株。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要研究內(nèi)容針對來源于枯草芽孢桿菌B. subtilis 6-7(已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號為CTCCM 2009200)的β -甘露聚糖酶進(jìn)行理性分析,通過重疊PCR技術(shù)進(jìn)行定點突變,經(jīng)定點改造后的β -甘露聚糖酶基因Mlu I、BamH I雙酶切與經(jīng)同樣酶切的表達(dá)載體PMA5在T4連接酶的作用下16°C過夜連接,將連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168菌株,成功得到一株重組菌株pMA5_gmuGb54/Bacillus subtilis168,經(jīng)發(fā)酵純化后對重組蛋白進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析,其pH由pH6. 5下降到pH5. 5,酶活力也相應(yīng)的提高6.2%。本發(fā)明的技術(shù)方案以重組質(zhì)粒pMA5_manA作為模板,根據(jù)設(shè)計好的引物及提前設(shè)計好的重疊PCR擴(kuò)增條件和擴(kuò)增體系進(jìn)行定點突變,利用凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收。用PCR回收產(chǎn)物和質(zhì)粒pMA5進(jìn)行雙酶切,利用凝膠回收試劑盒回收雙酶切產(chǎn)物,利用T4DNA 連接酶 16 °C 過夜連接重組質(zhì)粒 PMA5-gmuGal76、PMA5_gmuGb54、PMA5_gmuGcl98、PMA5-gmuGdlOU PMA5_gmuGel26,用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)枯草芽孢桿菌168,挑取陽性轉(zhuǎn)化子到10ml液體LB培養(yǎng)基中,37 °C搖床培養(yǎng)過夜,提取質(zhì)粒,酶切驗證正確后加入甘油,-20°C保藏備用,S卩成功構(gòu)建了基因工程菌PMA5-gmuGal76/Bacillus subtilis168、 PMA5-gmuGb54/Baci1lus subtilis 168、 PMA5-gmuGc198/Bacillus subtilis 168、PMA5-gmuGdlO 1/Baci 1 lus subtilis 168、PMA5-gmuGe 126/Bacillus subtilis 168。將凍管保藏的基因工程菌分別按1%的接種量轉(zhuǎn)接到10ml液體LB培養(yǎng)基中,37°C搖床培養(yǎng)過夜。次日按2%的接種量轉(zhuǎn)接至50ml液體LB培養(yǎng)基中37°C搖床培養(yǎng)。發(fā)酵完成后,將發(fā)酵液4°C 8000r/min離心5min后棄上沉淀,將上清通過親和層析得到純酶液;分別對純酶液進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的分析,結(jié)果表明來自重組菌株P(guān)MA5_gmuGb54/Bacillus subtilis 168的β-甘露聚糖酶其最適pH值有ρΗ6. 5下降到ρΗ5. 5,酶活力升高6.2%。說明對β-甘露聚糖酶耐酸性定點改造成功。本發(fā)明的有益效果作為ー種典型的飼料用酶,其需要滿足飼料生產(chǎn)以及動物消化系統(tǒng)對酶的性質(zhì)的特殊要求,但由于動物腸道對pH的要求,為了使甘露聚糖酶更加適合エ業(yè)化生產(chǎn)的需要,本發(fā)明在理性分析其三維結(jié)構(gòu)的的基礎(chǔ)上,對β_甘露聚糖酶進(jìn)行耐酸性的定點改造,成功構(gòu)建了ー株產(chǎn)甘露聚糖酶基因工程菌PMA5-gmuGb54/Bacillus subtilisl68,其最適pH值有ρΗ6· 5下降到ρΗ5· 5,酶活力升高6· 2%,并研究了相應(yīng)的酶學(xué)性質(zhì)的變化,以便為酶的應(yīng)用提供實驗數(shù)據(jù)。
圖1 重疊 PCR 核酸電泳圖 M DL 2000marker 叫、a2, t^、b2, c2, c^、d2, e2 為
重疊PCR產(chǎn)物。圖2親和層析Ni-NTA柱純化得到純酶SDS-PAGE電泳圖。M Protein Marker ;1 gmuGal7 ;2 gmuGb54 ;3 gmuGcl98 ;4 gmuGdl01 ;5 gmuGel26 ;6 :突變前 β-甘露聚糖酶MANA2a圖3突變前后β -甘露聚糖酶最適pH值比較。
圖4重組菌株發(fā)酵產(chǎn)β_甘露聚糖酶的生長曲線及酶活曲線。
具體實施例方式實施例1 : β -甘露聚糖酶基因的定點突變(1)引物的設(shè)計,針對甘露聚糖酶MANA2a在理性分析的基礎(chǔ)上,通過重疊PCR技術(shù)進(jìn)行定點突變,利用DNAMAN軟件設(shè)計引物如下。P1 :5’ -GACGGATCCATGTTTAAGAAACATACGAT-3> (BamH I)P2 :5’ -GGCACGCGTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCAACGATTGGCGTTA-3’ (Mlu I)MnF3 :5’ -ATGCCATGCTCAGCGAAATTGC-3’MnR4 :5’ ~CAATTTCGCTGAGCATGG~3,MnF5 5,~ACTGGCTTGCGGACCTGCCGAAC~3’MnR6 :5’ ~TTCGGCAGGTCCGCAAGCCAG~3,MnF7 :5’ ~CTGCATGACATGAACGGCGAATG~3,MnR8 :5’ ~CCATTCGCCGTTCATGTCATGC~3,MnF9 :5’ ~CGATTATGCCGCGGGATGG~3,MnRlO :5’ ~CAAGCCATCCCGCGGCATAATCGC~3,MnFll :5’ ~GATCAGTATAAGCAAATACTAG~3,MnR12 :5’ ~GTATTTGCTTATACTGATC~3,(2)以pMA5_manA2a為模板,利用實施例1提供的引物做PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增條件為94°C,2min,1 個循環(huán);94 °C,30s,56 °C,40s,72 °C,lmin 30s, 25 個循環(huán);72°C,lOmin,1 個循環(huán);15°C,10min,l個循環(huán)。擴(kuò)增體系ddH20 17 μ 1,模板2 μ 1、相應(yīng)的引物各0. 5 μ 1,dNTP Mix 2 μ 1, extaq-buffer 2. 5 μ 1,ex-Taq 酶 0. 5 μ 1,擴(kuò)增出含相應(yīng)的突變位點的PCR 產(chǎn)物 gmuGal76(AAA — GAA) ;2 gmuGb54(CAC — GAC) ;3 gmuGcl98 (GAA — GAC) ;4 gmuGdlOl (AGA — GCG) ;5 gmuGel26 (AAA — GCA);。利用瓊脂糖凝膠回收盒對目的基因進(jìn)行回收,第一次重疊PCR瓊脂糖凝膠電泳如圖1所示。實施例2 :重組質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化Bacillus subtilis 168構(gòu)建重組載體PMA5-gmuGal76、PMA5_gmuGb54、PMA5_gmuGcl98、PMA5_gmuGdl01、PMA5-gmuGel26,將上述實施例⑵中得到的β _甘露聚糖酶基因PCR產(chǎn)物分別與質(zhì)粒pMA5同時用BamH I和Mlu I雙酶切,利用凝膠回收盒回收后進(jìn)行連接,連接體系目的基因酶切產(chǎn)物7. 5 μ 1,。嫩5酶切產(chǎn)物0.5“ 1,T4DNA連接酶buffer 1 μ 1, T4DNA連接酶1μ 1,16 °C 過夜連接。將連接好的重組質(zhì)粒 PMA5-gmuGal76、PMA5_gmuGb54、PMA5_gmuGcl98、PMA5_gmuGdl01、PMA5-gmuGel26 轉(zhuǎn)化到感受態(tài) Bacillus subtilis 168,轉(zhuǎn)化方法挑取Bacillus subtilis 168接種于5ml LB培養(yǎng),37°C搖床培養(yǎng)過夜;取lOOul過夜培養(yǎng) 的菌液,接種于用50ml離心管配好的5ml SPI培養(yǎng)基中,37°C搖床培養(yǎng),當(dāng)菌株生長到對數(shù)末期時,快速取200μ 1接種到2ml SPII培養(yǎng)基中,37 °C 100r/min搖床培養(yǎng)1. 5h加20ull00xEGTA溶液,于37°C 100r/min搖床培養(yǎng)lOmin,用1. 5ml離心管分裝成500ul每管,分別向管中加入質(zhì)粒,輕輕搖勻于37°C 100r/min搖床培養(yǎng)30min,將離心管轉(zhuǎn)移到250r/min搖床培養(yǎng)1. 5h,以4000r/min離心收集菌體,棄部分上清,留100 μ 1重懸菌體,涂布于相應(yīng)的抗性平板,37°C培養(yǎng)過夜,挑取陽性菌落經(jīng)驗證后獲得因工程菌株P(guān)MA5-gmuGal76/Bacillus subtilis 168、PMA5-gmuGb54/Baci1lus subtilis 168、PMA5_gmuGcl98/Bacillus subtilis 168、 PMA5-gmuGdlO1/Bacillus subtilis 168、 PMA5_gmuGel26/Bacillus subtilis 168。實施例3 :重組菌株β -甘露聚糖酶的純化及耐酸性分析將得到的產(chǎn)β -甘露聚糖酶重組菌株P(guān)MA5_gmuGal76/Bacillus subtilis168、 PMA5-gmuGb54/Bacillus subtilis 168、 PMA5-gmuGc198/Bacillus subtilis 168、PMA5-gmuGdlO1/Baci1lus subtilis 168> PMA5-gmuGe126/Bacillus subtilis 168 按 2%的接種量分別接到新的50ml LB液體培養(yǎng)基中,取發(fā)酵液,4°C 8000r/min離心5min后棄上沉淀,將上清通過Ni-NTA柱得到純酶液,取得到的純酶液10ul加相應(yīng)的上樣Marker作為樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測,其中SDS-PAGE使用5%的分離膠和15%的濃縮膠,采用不連續(xù)垂直電泳,用考馬斯亮藍(lán)R250染色(如圖2)。并對純化到的β -甘露聚糖酶進(jìn)行耐酸性分析,結(jié)果基因工程菌PMA5-gmuGb54/Bacillus subtilis 168產(chǎn)β -甘露聚糖酶,其酶活力為226. 23U/mL,相對定點突變前酶活力提高了 6. 2%,且其最適pH由6. 5下降到5. 5 (如圖3所示)。實施例4 :重組菌株發(fā)酵產(chǎn)β -甘露聚糖酶搖瓶水平上對重組菌株pMA5-gmuGb54/B. subtilis 168產(chǎn)β -甘露聚糖酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化后該菌株的酶活力最高達(dá)到1501U/mL,是優(yōu)化前的6倍以上。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)行了 5L發(fā)酵罐放大實驗的研究,在轉(zhuǎn)速為500r/min,溶氧為lvvm條件下,通過兩階段控溫發(fā)酵,酶活力最高達(dá)到3207. 82U/mL。(如圖4所示)
權(quán)利要求
1.一種β-甘露聚糖酶耐酸性定點改造,其特征是根據(jù)β-甘露聚糖酶三級結(jié)構(gòu)分析,通過重疊PCR技術(shù)進(jìn)行定點突變,經(jīng)過定點改造將第54位的組氨酸突變?yōu)樘於彼岷蟮摩?-甘露聚糖酶基因連接至表達(dá)載體ΡΜΑ5上,將連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168菌株,成功得到一株重組菌株 pMA5_gmuGb54/Bacillus subtilis 168。
2.對權(quán)利要求I中所獲得的重組菌種進(jìn)行發(fā)酵,將發(fā)酵液離心后上清直接通過Ni-NTA柱純化,成功的得到了純的突變型β-甘露聚糖酶,其特征在于對純化的β-甘露聚糖酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的分析,β -甘露聚糖酶最適pH由pH6. 5變?yōu)閜H5. 5,此酶更適用于在飼料中應(yīng)用。
3.對上述權(quán)利要求I中所述的重組菌株進(jìn)行β_甘露聚糖酶活力測定,將上述獲得的重組菌發(fā)酵液離心后,取上清測定β -甘露聚糖酶酶活力,與原始菌株進(jìn)行比較,其特征是重組菌株P(guān)MA5-gmuGb54/Bacillus subtilis 168 β -甘露聚糖酶酶活力提高6. 2%,經(jīng)5L發(fā)酵罐發(fā)酵,通過兩階段控溫發(fā)酵,酶活力最高達(dá)到3207. 82U/mL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種β-甘露聚糖酶耐酸性定點改造的方法,其特征是針對一種來源于枯草芽孢桿菌B.subtilis 6-7(CTCCM 2009200)的β-甘露聚糖酶在理性設(shè)計的基礎(chǔ)上,通過重疊PCR技術(shù)進(jìn)行定點突變,經(jīng)定點改造后的β-甘露聚糖酶基因與表達(dá)載體pMA5連接,轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168菌株,成功獲得一株β-甘露聚糖酶耐酸性得到顯著提高的重組菌株pMA5-gmuGb54/B.subtilis 168,其相對酶活力提高了6.2%,搖瓶水平酶活為3226.23U/mL,最適pH由6.5下降到5.5,此突變酶更利用應(yīng)用在飼料工業(yè)中。
文檔編號C12N15/75GK102952789SQ20121036055
公開日2013年3月6日 申請日期2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月20日
發(fā)明者饒志明, 徐美娟, 張顯, 劉項羽 申請人:江南大學(xué)