專利名稱：發(fā)酵法制備ε-聚-L-賴氨酸的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，特別是涉及到一種發(fā)酵法制備ε -聚-L-賴氨酸的方法。
背景技術：
1977 年日本科學家 Shima 和 SaKai 在白色鏈霉菌(Streptomyces albulus 346)發(fā)酵液中首先發(fā)現(xiàn)ε -聚-L-賴氨酸(簡稱ε -PL)。ε -PL是賴氨酸位上羰基和e位氨基結合的產物，它帶正電荷，陰離子物質可與其結合，沒有固定的熔點，250°C以上開始軟化分解；成品為淡黃色粉末、吸濕性強、略有苦味，溶于水，微溶于乙醇，但不溶于乙酸乙酯、乙醚等有機溶劑；熱穩(wěn)定性高，120°C加熱IOmin仍具有抑菌活性，遇酸性多糖類、鹽酸鹽類、磷酸鹽類、銅離子等可因結合而使活性降低，與鹽酸、檸檬酸、蘋果酸、甘氨酸和高級脂肪甘油酯等合用有增效作用。ε -PL是含有25 30個賴氨酸殘基的陽離子聚合多肽，當聚合度低于十肽時，會喪失抑菌活性。分子量在3600 4300之間的ε-PL具有高抑菌活性。l、e-PL的功能及應用(I) ε -PL 的抑菌性ε -PL的抑菌機理可能是因為它是陽離子表面活性物質，它能破壞微生物的細胞膜結構，引起細胞的物質、能量和信息傳遞中斷，還能與胞內的核糖體結合影響生物大分子的合成，最終導致細胞死亡。ε -PL對細菌、真菌、酵母的最低抑制濃度不同，原因可能是它們細胞表面結構不同。ε -PL 既可以抑制革蘭氏陽性菌生長又可以抑制革蘭氏陰性菌生長，如革蘭氏陽性菌中枯草芽孢桿菌、耐熱脂肪芽孢桿菌；革蘭氏陰性菌中大腸桿菌、產氣節(jié)桿菌等引起食物中毒和腐敗菌，ε-PL對其都有強烈的抑制作用。劉慧等研究表明:ε-PL對革蘭氏陽性微球菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、革蘭氏陰性菌大腸桿菌、沙門氏菌及酵母菌生長有明顯抑菌效果，ε -PL與醋酸復合試劑對枯草芽孢桿菌有明顯抑制作用。Shima等采用Escherichia coli K-12研究了 ε-PL的分子量與抑菌性的關系，結果表明超過9個ε -賴氨酸殘基才可以抑制微生物的生長，而化學改性a氨基會降低抑菌活性。ε -PL是一種陽離子聚合物，等電點是9.0,因此，在堿性的情況下，抑菌活性和抗噬菌體的活性是最低的。對于Ε.coli,在pH值5.0 8.0的時候,最低抑制濃度是25g/mL 50g/mL,而在pH值8.0時的最低抑制濃度大于200g/mL。同樣的,如果存在像偏磷酸這種陰離子聚合物，也會降低ε-PL的抑菌活性，其原因ε-PL損失了陽離子電荷。(2) ε -PL 的應用①ε-PL在食品中的應用ε -PL是一種天然防腐劑，而且還是人體必需氨基酸-賴氨酸的聚合物，主要是作為食品添加劑應用于食品保鮮上。Neda等對ε-PL進行了毒理學研究，經慢性和亞急性喂飼小鼠實驗證明了 ε-PL沒有毒性，甚至當ε-PL達到高劑量水平時也不會產生任何的不利效果或基因突變。此外，ε-PL對生殖系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)，以及胚胎的發(fā)育、后代的生長，甚至第二代的胚胎發(fā)育都不會產生毒性，因此是一種安全的天然防腐劑。
ε-PL作為一種新型食品防腐劑除了單獨使用外，還可以與其他食品添加劑混合使用，如甘氨酸、醋、乙醇、硫胺素(VB)等，并且混合使用后可以在很大程度上提高防腐能力，還能對不同類型食品起到保鮮作用。例如當ε-PL和甘氨酸混合用于濃縮牛奶的保鮮防腐時，會產生明顯的協(xié)同增效作用，大大提高了抑菌能力。由于這種協(xié)同作用使得食品中的防腐劑添加量得以減少。徐紅華等通過飽和試驗研究了 ε -PL和甘氨酸在牛奶中的保鮮作用，結果發(fā)現(xiàn)單獨使用ε-PL和甘氨酸，其抑菌能力明顯低于二者混合使用效果。當采用420mg/Le_PL和質量分數(shù)2 %甘氨酸配合使用時，抑菌效果最佳，可以保存I ld，還發(fā)現(xiàn)ε -PL和其他天然抑菌劑配合使用，也有明顯的協(xié)同增效作用。②ε-PL在醫(yī)學方面的應用ε-PL含有陽離子，與帶有陰離子物質間有很強的靜電作用力，并且對生物膜有良好的穿透力，因此ε -PL可以作為某些藥物載體，在醫(yī)療和制藥方面得到廣泛應用。Sospedra等用以ε-PL為主鏈的分支聚合蛋白搭載生物大分子治療肝炎病毒，取得良好療效。Diederich等研究了電脈沖對不同分子量ε -PL修飾細胞膜的破壞程度，發(fā)現(xiàn)細胞膜吸附高分子量ε-PL會降低其破壞I臨界電壓。另外，在基因治療、在基因芯片的制造(核酸生物芯片、氣基酸芯片、蛋白質芯片等)和某些藥物的包裝物制作等方面均有重要用途。2、ε-PL國內外研究現(xiàn)狀(I) ε -聚-L-賴氨酸產生菌的分離篩選20世紀70年代末，Shima等首次從白色鏈霉菌(Steptomyces albulus)的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)ε-PL。藤井正弘等 發(fā)現(xiàn)諾爾斯氏鏈霉菌(Steptomyces noursei)也可產生PL。Sz0kdin等發(fā)現(xiàn)一種絲狀的麥角真菌(Claviceps purpurea)能夠積累一種類似PL、含有大量賴氨酸的化合物-麥角胺(clavicepamines)，其化學結構與S.albulus的產物不同。從20世紀90年代末至今，篩選ε-PL高產菌株一直是研究的熱點。2002年，日本學者Nishikawa等找到了一種有效的篩選方法，通過在培養(yǎng)基中加入一種酸性染料POLY R-478，可以在ε-PL產生菌的菌落周圍看到明顯的顏色濃縮圈，因而可以進行大規(guī)模篩選，克服了盲目性。Nishikawa采用這種方法，對日本各地土壤樣品進行了大規(guī)模的篩選，獲得了許多可以產生ε-PL的菌株，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)ε-PL產生菌集中在鏈霉菌科(Streptomycetaceae)的幾個不同的屬和麥角真菌(ergot fungi)這兩類微生物上，且不同菌株的產物其賴氨酸單體數(shù)也有所不同(n = 10 36，10 24，8 9)，并且發(fā)現(xiàn)這些菌株大部分屬于鏈霉菌。但由于P0LYR-478現(xiàn)已停產，菌株篩選又變得較困難。中國學者王曉丹等、張超等、朱宏陽等采用堿性染料亞甲基藍，先后分離到了產ε-PL的菌株，但由于亞甲藍對微生物毒性較高，而且出菌率較低，分離到的菌株均為放線菌，菌種單一，ε -PL產量較低。因此探索篩選培養(yǎng)基指示劑，研究建立高通量、高分辨、高靈敏e-PL產生菌篩選模型是目前ε-PL研究的難點之一。(2) ε -聚-L-賴氨酸發(fā)酵工藝研究現(xiàn)狀采用Shima等分離的白色鏈霉菌變種，聚賴氮酸發(fā)酵產量為0.5g.T10 ε -PL產生菌株的搖瓶批式發(fā)酵產量較低，均在0.2 1.0g.L'巖田敏治等以Β21021菌株為研究對象，在3L發(fā)酵罐中采用氨水調控pH，補加葡萄糖和硫酸銨，發(fā)酵培養(yǎng)72h時，ε -PL產率為16.2g.L—1，而發(fā)酵培養(yǎng)168h時產率為31g.L—1，產率有了較大幅度的提高。Hiraki等以野生白色鏈霉菌S.albulus346為出發(fā)菌株，經誘變獲得了抗S- (2_氨乙基)-L-半胱氨酸與甘氨酸的突變株并且90%為高產菌株，其中I株在試管發(fā)酵最高產量為2.1lmg.πιΓ1，比野生菌株高了 10倍，這株菌對天冬酰胺激酶有很高的特異性。在3L發(fā)酵罐中，120h產率Kahar等報道pH與葡萄糖對ε-PL發(fā)酵產量有很大的影響。發(fā)酵分兩個階段，PH高于5.0有利于菌體生長，而pH低于4.0對產ε-PL是關鍵。通過發(fā)酵控制，ε -PL的產量由起初的g.Γ1增長到48.3g.L'此外，由于白色鏈霉菌在發(fā)酵過程中形成菌絲球，高攪拌轉速易將菌絲球剪切成絲狀，使胞內物質滲入到發(fā)酵液中，影響ε -PL的提取。Kahar等采用氣升式發(fā)酵罐，在動力消耗為0.3kW*m_3下，ε-PL產率為30g.L—1，而在攪拌罐中獲得相同產量的ε-PL則需要消耗SkW.m_3，由此表明，采用氣升式發(fā)酵罐生產ε -PL可以更有效地降低生產成本。目前在國內關于生物合成ε-PL的研究剛剛起步，姜俊云等采用5L自控式發(fā)酵罐研究了發(fā)酵過程中攪拌轉速和PH對菌體形態(tài)以及ε -PL產量的影響，發(fā)現(xiàn)攪拌轉速350r/min和控制pH時可獲得最大的ε-PL產量2.958.!^，菌體量9.338.!^。朱宏陽等從土壤中分離到I株產ε-PL菌株PL6-3，其發(fā)酵產量為Ojlg.!/1。目前ε-PL發(fā)酵工藝為液體深層發(fā)酵，雖然單批次發(fā)酵可以達到較高產量，但重復性較差。其根本問題在于溶氧較低，達到高產需要較高的溶氧，合適的轉速，但這兩者本身是一對矛盾，只能應用多尺度發(fā)酵原理與過程控制思想，優(yōu)化ε -PL發(fā)酵參數(shù)，提高發(fā)酵水平。(3) ε -聚-L-賴氨酸分離提取工藝研究開發(fā)現(xiàn)狀ε -PL是一種胞外多肽類物質，提取工藝與胞外酶或蛋白質的提取基本相似，主要方法有鹽析法、有機溶劑萃取法和離子交換法。通常情況下根據(jù)被提取物質的理化和生物學特性選擇兩種方法結合使用，ε -PL采用離子交換和有機溶劑萃取的方法。ε -PL在中性環(huán) 境中為陽離子高聚物，因此人們通常采用pH為8.5的AmberliteIRC-50(H+型)陽離子交換樹脂，通過陽離子交換層析方法從發(fā)酵液中分離提取ε-PL，發(fā)酵液先過濾除去菌體，濾液進Amberlite IRC-50層析柱交換吸附，然后依次用0.2mol.Γ1的乙酸和水洗滌,再用0.1mol.Γ1的鹽酸洗脫后，洗脫液用6mol.Γ1的NaOH中和，然后用活性炭脫色后，進行濃縮至小體積。最后使用乙醇和乙醚(2:1)混合液進行ε -PL沉淀。從方法論的角度看此法簡便快捷，不足之處為ε-PL純度不夠77.9%。周俊等采用此法得到ε -PL粗品后，Sephadex G_25凝膠過濾ε -PL粗品用重蒸水配成4g.L—1溶液，過濾(0.22 μ m微濾膜)后，取濾液上樣。周俊的方法優(yōu)點是提取的ε -PL純度較高88.3%。綜合這兩種分離提取方法，篩選更加有效的陽離子交換樹脂，研究ε -PL分離過程，優(yōu)化分離參數(shù)，減少步驟，整體提聞提取效率。綜上所述，高產菌株的獲得及高效、簡單提取工藝的建立成為制約我國e-PLI業(yè)化生產的兩大主要因素，在此背景下，本發(fā)明以自行誘變篩選獲得的白色鏈霉菌為發(fā)酵菌株，進行了發(fā)酵法制備ε-聚-L-賴氨酸工藝的開發(fā)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提出一種發(fā)酵法制備ε -聚-L-賴氨酸新工藝，為解決缺少高產菌株的問題，本發(fā)明提供了一種白色鏈霉菌CQ0723。該菌株是以白色鏈霉菌為出發(fā)菌，通過微波誘變和激光誘變結合的方法而獲得，目前已經在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏號為:CGMCCN0.6409。保藏日期從2012年08年07日起保存三十年。該菌株分類命名:白色鏈霉菌(Streptomyces albus), CQ0723。發(fā)酵法制備ε _聚-L-賴氨酸的方法，主要通過如下技術方案實現(xiàn):(I)菌株發(fā)酵培養(yǎng)以自行誘變篩選獲得取培養(yǎng)Id后的二級種子液1.5L接入裝有30L培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中，初始pH為6.5，30°C，250r/min,通氣量1200L/h，培養(yǎng)3 5d。補料分批發(fā)酵過程中，將無菌的葡萄糖和硫酸銨混合液接至酸泵上，氨水接至堿泵上的方式來自動控制發(fā)酵液pH。在發(fā)酵的前期，攪拌轉速為200r/min，發(fā)酵后期攪拌轉速為300r/min，通氣量1200L/h，將pH控制在4.0左右，培養(yǎng)8 IOd0(2)發(fā)酵液預處理發(fā)酵結束后，發(fā)酵液離心取上清，獲得e_聚-L-賴氨酸粗提液。粗提液內加入lmol/L的鹽酸，調節(jié)pH值至3.0，加熱至90°C后冷卻至室溫，離心去沉淀，可有效去除發(fā)酵液內的雜蛋白，獲得經預處理后的e-聚-L-賴氨酸溶液。(3)離子交換樹脂分離用lmol/L的NaOH溶液調節(jié)經預處理獲得e_聚-L-賴氨酸溶液pH至8.0，將調節(jié)后的e-聚-L-賴氨酸溶液過HD-2型離子交換樹脂柱，收集洗脫液備用。(4)活性炭脫色洗脫液內加入5%的活性炭，加熱至60°C，攪拌30min后冷卻至室溫，過濾獲得e-聚-L-賴氨酸脫色液。(5)超濾選用截留分子量為6000Da的聚砜超濾膜對e_聚_L_賴氨酸脫色液進行超濾濃縮。(6)噴霧干燥超濾獲得的ε -聚-L-賴氨酸超濾液濃縮至原體積的1/10后，進行噴霧干燥處理獲得ε -聚-L-賴氨酸產品。四、本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明以自行誘變篩選獲得高產ε-聚-L-賴氨酸白色鏈霉菌為發(fā)酵菌株，菌株發(fā)酵獲得粗提液，后采用離子交換層析、脫色、超濾、乙醇沉淀等技術制備獲得高質量ε -聚-L-賴氨酸產品。本發(fā)明主要優(yōu)點如下:(I)采用微波誘變和激光誘變結合的方法，篩選獲得高產菌株，發(fā)酵單位達55g/L以上。(2)發(fā)酵中采用了補料分批發(fā)酵法，通過pH的調節(jié)，有效提高了 e-聚-L-賴氨酸的發(fā)酵濃度。(3)采用離子交換層析、超濾相結合技術制備獲得了 98%以上的高純度產品，產品提取率達到75%以上。(4)采用的分離純化方法具有能耗低， 設備結構簡潔緊湊、操作方便、適合實現(xiàn)自動化生產的特點。五

圖1:微生物發(fā)酵法生產e-聚-L-賴氨酸技術工藝流程路線圖
六具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發(fā)明進一步說明。實施例一(I)菌體保藏種子液與40%的甘油以1:1體積比混合，零下80°C冰箱內冷凍保藏。(2)培養(yǎng)基平板和斜面培養(yǎng)基(％ ):葡萄糖1.0,蛋白胨0.2,酵母抽提物0.1, Agarl.5。用2molLNa0H 溶液調 pH 至 7.5，120。。，滅菌 20min。種子培養(yǎng)基):葡萄糖5.0，酵母膏 0.5，(NH4)2SO4L 00，KH2PO40.6，K2HPO40.8，MgSO4.7Η200.02，F(xiàn)eSO4.7Η200.02，pH 值 6.8，120。。，滅菌 20min。發(fā)酵培養(yǎng)基(％):葡萄糖 3.0，酵母膏 0.5，(NH4)2SO4L 2，MgSO4.7Η200.05，KH2PO40.20，K2HPO40.12，F(xiàn)eSO4.7Η200.003，ZnSO4.7Η200.008，ρΗ6.5，120°C，滅菌 20min。補料培養(yǎng)基):葡萄糖80，(NH4) 2S048.0，二者分別于120°C滅菌20min后，無菌條件下混合備用。(3)種子培養(yǎng)一級種子液培養(yǎng):取I環(huán)斜面孢子種接于裝有IOOmL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30°C，220r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)2d。二級種子液培養(yǎng):將培養(yǎng)2d后的一級種子液按5%的接種量接入裝有25L培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中，初始pH為6.8，于30°C，200r/min,通氣量1000L/h,培養(yǎng)Id。(4) 50L發(fā)酵罐內菌株發(fā)酵培養(yǎng)取培養(yǎng)Id后的二級種子液1.5L接入裝有30L培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中，初始pH為6.5，30°C，250r/min，通氣量1200L/h，培養(yǎng)4d。在補料分批發(fā)酵過程中，將無菌的葡萄糖和硫酸銨混合液接至酸泵上，氨水接至堿泵上的方式來自動控制發(fā)酵液pH。在發(fā)酵的前期，攪拌轉速為200r/min，讓pH自然下降，發(fā)酵后期攪拌轉速為300r/min，通氣量1200L/h，將pH控制在4.0左右，培養(yǎng)10d，菌株發(fā)酵濃度為55.4g/L。(5)預處理發(fā)酵結束后，發(fā)酵液離心取上清，獲得e_聚-L-賴氨酸粗提液。粗提液內加入lmol/L的鹽酸，調節(jié)pH值至3.0，加熱至90°C后冷卻至室溫，離心去沉淀，可有效去除發(fā)酵液內的雜蛋白，獲得經預處理后的e-聚-L-賴氨酸溶液。(6)離子交換樹脂分離用lmol/L的NaOH溶液調節(jié)經預處理獲得e_聚-L-賴氨酸溶液pH至8.0，將調節(jié)后的ε -聚-L-賴氨酸溶液以4mL/min的速度上樣至HD-2型離子交換樹脂柱，保持柱內pH值為8.0至樹脂吸附飽和，后用純水對飽和樹脂進行洗滌至洗滌液澄清；以0.075mol/L的HCl溶液為洗滌液，洗脫速度為2.5mL/mi n,收集洗脫液備用。(7)活性炭脫色
洗脫液內加入5%的活性炭，加熱至60°C，攪拌30min后冷卻至室溫，過濾獲得e-聚-L-賴氨酸脫色液。(8)超濾選用截留分子量為6000Da的聚砜超濾膜對e_聚_L_賴氨酸脫色液進行超濾濃縮，將e-聚-L-賴氨酸脫色液稀釋一半后，導入膜壓濾裝置進行循環(huán)濃縮超濾，收集超濾液。超濾操作條件為:操作壓力0.025MPa，操作溫度25°C。(9)噴霧干燥超濾獲得的e-聚-L-賴氨酸超濾液濃縮至原體積的1/10后，進行噴霧干燥處理獲得ε -聚-L-賴氨酸產品，產品純度可達到98.2%，收率可達到75.1%。實施例二(I)菌體保藏種子液與40%的甘油以1:1體積比混合，零下80°C冰箱內冷凍保藏。(2)培養(yǎng)基平板和斜面培養(yǎng)基):葡萄糖1.5，蛋白胨0.3，酵母抽提物0.2，Agarl.5。用2molLNa0H 溶液調 pH 至 7.5，120。。，滅菌 20min。種子培養(yǎng)基):葡萄糖6.0，酵母膏 0.6，(NH4)2SO4L 00，KH2PO40.6，K2HPO40.8，MgSO4.7Η200.02，F(xiàn)eSO4.7Η200.02，pH 值 6.8，120。。，滅菌 20min。發(fā)酵培養(yǎng)基(％):葡萄糖4.0，酵母膏 0.6，(NH4)2SO4L 2，MgSO4.7Η200.05，KH2PO40.20，K2HPO40.12，F(xiàn)eSO4.7Η200.003，ZnSO4.7Η200.008，ρΗ6.5，120°C，滅菌 20min。補料培養(yǎng)基):葡萄糖90，(NH4) 2S048.0，二者分別于120°C滅菌20min后，無菌條件下混合備用。(3)種子培養(yǎng)一級種子液培養(yǎng):取I環(huán)斜面孢子種接于裝有IOOmL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30°C，220r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)2d。二級種子液培養(yǎng):將培養(yǎng)2d后的一級種子液按5%的接種量接入裝有25L培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中，初始pH為6.8，于30°C，200r/min,通氣量1000L/h,培養(yǎng)Id。(4) 50L發(fā)酵罐內菌株發(fā)酵培養(yǎng)取培養(yǎng)Id后的二級種子液1.0L接入裝有20L培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中，初始pH為6.5，30°C，250r/min，通氣量1200L/h，培養(yǎng)4d。在補料分批發(fā)酵過程中，將無菌的葡萄糖和硫酸銨混合液接至酸泵上，氨水接至堿泵上的方式來自動控制發(fā)酵液pH。在發(fā)酵的前期，攪拌轉速為200r/min，讓pH自然下降，發(fā)酵后期攪拌轉速為300r/min，通氣量1200L/h，將pH控制在4.0左右，培養(yǎng)8d，菌株發(fā)酵濃度為55.2g/L。(5)預處理發(fā)酵結束后，發(fā)酵液離心取上清，獲得e_聚-L-賴氨酸粗提液。粗提液內加入lmol/L的鹽酸，調節(jié)pH值至4.0，加熱至90°C后冷卻至室溫，離心去沉淀，可有效去除發(fā)酵液內的雜蛋白，獲得經預處理后的e-聚-L-賴氨酸溶液。(6)離子交換樹脂分離 用lmol/L的NaOH溶液調節(jié)經預處理獲得ε -聚-L-賴氨酸溶液pH至8.0，將調節(jié)后的ε -聚-L-賴氨酸溶液以4mL/min的速度上樣至HD-2型離子交換樹脂柱，保持柱內pH值為8.0至樹脂吸附飽和，后用純水對飽和樹脂進行洗滌至洗滌液澄清；以0.075mol/L的HCl溶液為洗滌液，洗脫速度為2.5mL/min,收集洗脫液備用。(7)活性炭脫色洗脫液內加入6%的活性炭，加熱至60°C，攪拌30min后冷卻至室溫，過濾獲得ε -聚-L-賴氨酸脫色液。(8)超濾選用截留分子量為6000Da的聚砜超濾膜對ε -聚-L-賴氨酸脫色液進行超濾濃縮，將ε -聚-L-賴氨酸脫色液稀釋一半后，導入膜壓濾裝置進行循環(huán)濃縮超濾，收集超濾液。超濾操作條件為:操作壓力0.025MPa，操作溫度25°C。(9)噴霧干燥超濾獲得的ε -聚-L-賴氨酸超濾液濃縮至原體積的1/10后，進行噴霧干燥處理獲得ε -聚-L-賴氨酸產品，產品純度可達到98.5%，收率可達到75.0%。實施例三(I)菌體保藏種子液與40%的甘油以1:1體積比混合，零下80°C冰箱內冷凍保藏。(2)培養(yǎng)基平板和斜面培養(yǎng)基(％):葡萄糖2.0，蛋白胨0.5，酵母抽提物0.3，Agarl.5。用2molLNa0H 溶液調 pH 至 7.5，120。。，滅菌 20min。種子培養(yǎng)基(%):葡萄糖 8.0，酵母膏 1.0, (NH4)2SO4L 00，KH2PO40.6，K2HPO40.8，MgSO4.7Η200.02，F(xiàn)eSO4.7Η200.02，pH 值 6.8，120。。，滅菌 20min。發(fā)酵培養(yǎng)基(％):葡萄糖 5.0，酵母膏 1.0，(NH4)2SO4LO, MgSO4.7H200.05,KH2PO40.20，K2HPO40.12，F(xiàn)eSO4.7Η200.003，ZnSO4.7Η200.008，ρΗ6.5，120°C，滅菌 20min。補料培養(yǎng)基(% ):葡萄糖100，(NH4) 2S048.0，二者分別于120°C滅菌20min后，無菌條件下混合備用。(3)種子培養(yǎng)—級種子液培養(yǎng):取I環(huán)斜面孢子種接于裝有100mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30°C，220r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)2d。二級種子液培養(yǎng):將培養(yǎng)2d后的一級種子液按5%的接種量接入裝有25L培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中，初始pH為6.8，于30°C，200r/min,通氣量1000L/h,培養(yǎng)Id。(4) 50L發(fā)酵罐內菌株發(fā)酵培養(yǎng)取培養(yǎng)Id后的二級種子液1.25L接入裝有25L培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中，初始pH為6.5，30°C，250r/min,通氣量1200L/h，培養(yǎng)4d。在補料分批發(fā)酵過程中，將無菌的葡萄糖和硫酸銨混合液接至酸泵上，氨水接至堿泵上的方式來自動控制發(fā)酵液pH。在發(fā)酵的前期，攪拌轉速為200r/min，讓pH自然下降，發(fā)酵后期攪拌轉速為300r/min，通氣量1200L/h，將PH控制在4.0左右，培養(yǎng)9d，菌株發(fā)酵濃度為55.8g/L。(5)預處理發(fā)酵結束后，發(fā)酵液離心取上清，獲得ε-聚-L-賴氨酸粗提液。粗提液內加入lmol/L的鹽酸，調節(jié)pH值至3.5，加熱至90°C后冷卻至室溫，離心去沉淀，可有效去除發(fā)酵液內的雜蛋白，獲得經預處理后的e-聚-L-賴氨酸溶液。
(6)離子交換樹脂分離用lmol/L的NaOH溶液調節(jié)經預處理獲得ε -聚-L-賴氨酸溶液pH至8.0，將調節(jié)后的ε -聚-L-賴氨酸溶液以4mL/min的速度上樣至D113型離子交換樹脂柱，保持柱內pH值為8.0至樹脂吸附飽和，后用純水對飽和樹脂進行洗滌至洗滌液澄清；以0.075mol/L的HCl溶液為洗滌液，洗脫速度為2.5mL/min,收集洗脫液備用。(7)活性炭脫色洗脫液內加入10%的活性炭，加熱至60°C，攪拌30min后冷卻至室溫，過濾獲得ε -聚-L-賴氨酸脫色液。(8)超濾選用截留分子量為4000Da的聚砜超濾膜對ε _聚_L_賴氨酸脫色液進行超濾濃縮，將ε -聚-L-賴氨酸脫色液稀釋一半后，導入膜壓濾裝置進行循環(huán)濃縮超濾，收集超濾液。超濾操作條件為:操作壓力0.025MPa，操作溫度25°C。(9)噴霧干燥超濾獲得的ε -聚-L-賴氨酸超濾液濃縮至原體積的1/10后，進行噴霧干燥處理獲得ε -聚-L-賴氨酸產品，產品純度可達到98.5%，收率可達到75.4%。實施例四(I)菌體保藏種子液與40%的甘油以1:1體積比混合，零下80°C冰箱內冷凍保藏。

(2)培養(yǎng)基平板和斜面培養(yǎng)基):葡萄糖1.0，蛋白胨0.2，酵母抽提物0.1，Agarl.5。用2molLNa0H 溶液調 pH 至 7.5，120。。，滅菌 20min。種子培養(yǎng)基):葡萄糖5.0，酵母膏 0.5，(NH4)2SO4L 00，KH2PO40.6，K2HPO40.8，MgSO4.7Η200.02，F(xiàn)eSO4.7Η200.02，pH 值 6.8，120。。，滅菌 20min。發(fā)酵培養(yǎng)基(％):葡萄糖 3.0，酵母膏 0.5，(NH4)2SO4L 2，MgSO4.7Η200.05，KH2PO40.20，K2HPO40.12，F(xiàn)eSO4.7Η200.003，ZnSO4.7Η200.008，ρΗ6.5，120°C，滅菌 20min。補料培養(yǎng)基(％):葡萄糖80，(見14)23048.0，二者分別于1201:滅菌201^11后，無菌條件下混合備用。(3)種子培養(yǎng)一級種子液培養(yǎng):取I環(huán)斜面孢子種接于裝有IOOmL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30°C，220r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)2d。二級種子液培養(yǎng):將培養(yǎng)2d后的一級種子液按5%的接種量接入裝有25L培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中，初始pH為6.8，于30°C，200r/min,通氣量1000L/h,培養(yǎng)Id。(4) 50L發(fā)酵罐內菌株發(fā)酵培養(yǎng)取培養(yǎng)Id后的二級種子液1.5L接入裝有有30L培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中，初始pH為6.5，30°C，250r/min,通氣量1000L/h，培養(yǎng)4d。在補料分批發(fā)酵過程中，將無菌的葡萄糖和硫酸銨混合液接至酸泵上，氨水接至堿泵上的方式來自動控制發(fā)酵液pH。在發(fā)酵的前期，攪拌轉速為200r/min，讓pH自然下降，發(fā)酵后期攪拌轉速為300r/min，通氣量1000L/h，將PH控制在4.0左右，培養(yǎng)9d，菌株發(fā)酵濃度為55.lg/L。(5)預處理
發(fā)酵結束后，發(fā)酵液離心取上清，獲得ε-聚-L-賴氨酸粗提液。粗提液內加入lmol/L的鹽酸，調節(jié)pH值至4.0，加熱至90°C后冷卻至室溫，離心去沉淀，可有效去除發(fā)酵液內的雜蛋白，獲得經預處理后的e-聚-L-賴氨酸溶液。(6)離子交換樹脂分離用lmol/L的NaOH溶液調節(jié)經預處理獲得ε -聚-L-賴氨酸溶液pH至8.0，將調節(jié)后的ε -聚-L-賴氨酸溶液以4mL/min的速度上樣至HD-2型離子交換樹脂柱，保持柱內pH值為8.0至樹脂吸附飽和，后用純水對飽和樹脂進行洗滌至洗滌液澄清；以0.075mol/L的HCl溶液為洗滌液，洗脫速度為2.5mL/min,收集洗脫液備用。(7)活性炭脫色洗脫液內加入5%的活性炭，加熱至60°C，攪拌30min后冷卻至室溫，過濾獲得ε -聚-L-賴氨酸脫色液。(8)超濾選用截留分子量為6000Da的聚砜超濾膜對ε _聚-L-賴氨酸脫色液進行超濾濃縮，將ε -聚-L-賴氨酸脫色液稀釋一半后，導入膜壓濾裝置進行循環(huán)濃縮超濾，收集超濾液。超濾操作條件為:操作壓力0.025MPa，操作溫度25°C。(9)噴霧干燥超濾獲得的ε -聚-L-賴氨酸超濾液濃縮至原體積的1/10后，進行噴霧干燥處理獲得ε -聚-L-賴氨酸產品， 產品純度可達到98.6%，收率可達到75.2%。
權利要求
1.一種發(fā)酵法制備ε-聚-L-賴氨酸的方法，其特征是發(fā)酵菌株為白色鏈霉菌(Streptomyces albus) CQ0723，其菌種保藏編號為 CGMCC N0.6409。
2.一種發(fā)酵法制備ε-聚-L-賴氨酸的方法，其特征在于菌株CQ0723發(fā)酵獲得發(fā)酵液，后預處理、離子交換層析、脫色、超濾、乙醇沉淀等技術制備獲得高質量e-聚-L-賴氨酸成品。
3.如權利要求2所述的一種發(fā)酵法制備聚-L-賴氨酸的方法，其特征在于菌株發(fā)酵相關培養(yǎng)基如下: 平板和斜面培養(yǎng)基):葡萄糖1.0-2.0 (g/L)，蛋白胨0.2-0.5 (g/L)，酵母抽提物0.1-0.3 (g/L)，Agarl.5 (g/L)。用 2molL NaOH 溶液調 pH 至 7.5，120。。，滅菌 20min。
種子培養(yǎng)基):葡萄糖 5.0-8.0 (g/L)，酵母膏 0.5-1.0 (g/L)，(NH4)2SO4L 00 (g/L)，KH2PO40.6 (g/L)，K2HPO40.8 (g/L)，MgSO4.7Η200.02 (g/L)，F(xiàn)eSO4.7Η200.02 (g/L)，pH 值 6.8，120°C，滅菌 20min。。發(fā)酵培養(yǎng)基(％):葡萄糖 3.0-5.0 (g/L)，酵母膏 0.5-1.0 (g/L)，(NH4) 2S041.0-1.2 (g/L)，MgSO4.7H200.05 (g/L)，KH2PO40.20 (g/L)，K2HPO40.12 (g/L)，F(xiàn)eSO4.7H200.003 (g/L)，ZnSO4.7H200.008 (g/L)，pH6.5，120。。，滅菌 20min。
補料培養(yǎng)基(% ):葡萄糖 80-100 (g/L)，(NH4) 2S048.0-10.0 (g/L)，二者分別于 120。。滅菌20min后,無菌條件下混合備用。
4.如權利要求2所述的一種發(fā)酵法制備ε-聚-L-賴氨酸的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)工藝為:裝液量為40% 60% (L/L)，接種體積為2% 5% (L/L)，空氣通氣量1000 1200L/h，初始pH為6.5，在發(fā)酵的前期，攪拌轉速為200r/min，發(fā)酵后期攪拌轉速為300r/min，通氣量1200L/h，將pH控制在4.0左右，培養(yǎng)8 IOd0
5.如權利要求2所述的一種發(fā)酵法制備聚-L-賴氨酸的方法，其特征在于預處理過程中粗提液內加入lmol/L的鹽酸，調節(jié)pH值至3.0-4.0，加熱至85_90°C后冷卻至室溫，離心去沉淀。
6.如權利要求2所述的一種發(fā)酵法制備聚-L-賴氨酸的方法，其特征在于離子交換層析過程中使用的離子交換樹脂可以為HD-2，HZD-5、D113。
7.如權利要求2所述的一種發(fā)酵法制備聚-L-賴氨酸的方法，其特征在于活性炭脫色過程中，洗脫液中活性炭加入的比列為5-10% (Μ/V)。
8.如權利要求2所述的一種發(fā)酵法制備聚-L-賴氨酸的方法，其特征在于超濾過程中使用的超濾膜為聚砜超濾膜，截留分子量為4000-6000Da。
9.如權利要求2所述的一種發(fā)酵法制備聚-L-賴氨酸的方法，其特征在于采用噴霧干燥最終制備獲得的ε -聚-L-賴氨酸產品，產品純度可達到98%以上，收率可達到75%以上。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種發(fā)酵法制備ε-聚-L-賴氨酸的方法，屬于生物技術領域。本方法的主要步驟為菌株發(fā)酵獲得粗提液，后采用離子交換層析、脫色、超濾、乙醇沉淀等技術制備獲得ε-聚-L-賴氨酸成品，經檢測其純度達到98％以上，產品收率高于75％。本發(fā)明采用微生物發(fā)酵法制備ε-聚-L-賴氨酸的工藝，具有能耗低、設備結構簡潔緊湊、方法易行、操作安全方便等特點，易于進行產業(yè)化推廣。
文檔編號C12R1/47GK103194500SQ201210361520
公開日2013年7月10日 申請日期2012年9月26日 優(yōu)先權日2012年9月26日
發(fā)明者王秀英 申請人:四川金稞生物科技有限公司