專利名稱：一種快速分析厭氧氨氧化菌群的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分析厭氧氨氧化菌群的方法。
背景技術(shù)：
厭氧氨氧化菌(ΑΝΑΜΜ0Χ)是最新發(fā)現(xiàn)的浮霉菌門(Planctomycetes)的一員，屬于嚴(yán)格厭氧自養(yǎng)菌，它能以氨氮(NH4+)為電子供體，亞硝氮(NO2-)為電子受體，將氨氮(NH4+)和亞硝氮(NO2-)直接轉(zhuǎn)變成氮?dú)?N2)。厭氧氨氧化菌的發(fā)現(xiàn)，對(duì)于研究地球氮循環(huán)、豐富微生物理論以及開發(fā)新型生物脫氮工藝均具有巨大的推動(dòng)作用。目前，已證明厭氧氨氧化菌廣泛分布于海洋、湖泊、河流底泥、地下水以及許多污水處理裝置中，并在地球氮循環(huán)中起著舉足輕重的作用，據(jù)報(bào)道，其氮?dú)猱a(chǎn)量占海洋氮?dú)猱a(chǎn)量的30%-50% [2’3]。許多水處理專家將其應(yīng)用到污水脫氮工藝中，解決了傳統(tǒng)硝化-反硝化工藝中的不足，有著良好的推廣應(yīng)用前景。
按照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第2版的細(xì)菌分類方法，厭氧氨氧化菌被確定為浮霉菌門(Planctomycetes)的一員。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的厭氧氨氧化菌有五個(gè)屬，分別是 CandidatusKuenenia、CandidatusBrocadia、CandidatusAnammoxoglobus、CandidatusJettenia、CandidatusScalindua。在對(duì)環(huán)境樣品中厭氧氨氧化菌的群落組成分析時(shí)，人們常常通過克隆、測(cè)序構(gòu)建16SrDNA克隆文庫的方法。雖然這種方法避免了對(duì)厭氧氨氧化菌純培養(yǎng)的要求，但是構(gòu)建克隆文庫工作量大，費(fèi)用高，不能實(shí)現(xiàn)厭氧氨氧化菌的快速分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是要解決現(xiàn)有的分析厭氧氨氧化菌群的方法工作量大，費(fèi)用高，不能實(shí)現(xiàn)厭氧氨氧化菌的快速分析的問題，提供一種快速分析厭氧氨氧化菌群的方法。本發(fā)明快速分析厭氧氨氧化菌群的方法，按以下步驟進(jìn)行一、使用試劑盒提取待分析樣品的DNA ；二、特異性PCR擴(kuò)增以樣品的DNA為模板，以Pla46F和630R為引物，進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物A，將擴(kuò)增產(chǎn)物A經(jīng)DNA純化試劑盒純化，獲得純化產(chǎn)物，然后以純化產(chǎn)物為模板，以AMX368F和AMX820R為引物，進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物B ；三、限制性內(nèi)切酶酶切將擴(kuò)增產(chǎn)物B經(jīng)IU的綠豆核酸酶消化30min，消化后的擴(kuò)增產(chǎn)物B采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，然后使用MspI和RsaI對(duì)純化的擴(kuò)增產(chǎn)物B進(jìn)行雙酶切，獲得酶切產(chǎn)物；四、酶切產(chǎn)物純化向酶切產(chǎn)物中加入IyL 3mol/L、pH為5. 2的NaAc溶液和20μ L-20°C、體積濃度為96%的乙醇溶液，然后于IOOOOrpm離心，棄上清，向沉淀中加入體積濃度為70%的乙醇溶液清洗，然后于IOOOOrpm離心，取沉淀，干燥后加入5 μ L滅菌超純水溶解沉淀；五、毛細(xì)管電泳將I μ L步驟四中溶解的沉淀、9 μ L甲酰胺和O. 25 μ L DNA分子量?jī)?nèi)標(biāo)-500混勻后，用DNA測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，電泳程序①變性，90°C，120sec ;②進(jìn)樣，2. 0kV，30sec 分離，5. OkV，60°C，60min，電泳結(jié)果即為酶切后末端片段的長(zhǎng)度；六、毛細(xì)管電泳結(jié)果分析依據(jù)下述對(duì)應(yīng)關(guān)系，
厭氧氨氧化菌屬對(duì)應(yīng)末端片段長(zhǎng)度bp
(\indidaius Brocadia125
(1 JicJaiits A /lammoxoglobus91
(\mdidaius · Jeila α476
(\mdidaius Kaenenia291
(\mdiduius Sccfiindncf355將DNA測(cè)序儀獲得的電泳結(jié)果數(shù)據(jù)采用GeneMapper 4. O進(jìn)行分析，即獲得厭氧氨氧化菌群分析結(jié)果；其中步驟二中引物Pla46F為5’ -GGATTAGGCATGCAAGTC-3’，引物630R為 5，-CAKAAAGGAGGTGATCC-3 ’，引物 AMX368F 為 5，-TTCGCAATGCCCGAAAGG-3 ’，引物 AMX820R為 5， -AAAACCCCTCTACTTAGTGCCC-3，。本發(fā)明通過模擬PCR和模擬酶切，以美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的數(shù)據(jù)庫為對(duì)象，得出了不同厭氧氨氧化菌屬所對(duì)應(yīng)的理論末端片段長(zhǎng)度。本發(fā)明方法無需克隆、測(cè)序，直接通過對(duì)酶切后末端片段長(zhǎng)度(T-RFs)的分析，即可完成對(duì)樣品中厭氧氨氧化菌群的快速分析，減小了工作量，降低了成本。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(I)本發(fā)明避免了通過克隆，測(cè)序建立16S rRNA基因克隆文庫來分析厭氧氨氧化菌群結(jié)構(gòu)的繁瑣步驟，實(shí)現(xiàn)了厭氧氨氧化菌群組成的快速分析。(2)本發(fā)明通過巢式PCR，實(shí)現(xiàn)了對(duì)厭氧氨氧化菌含量很低的環(huán)境樣品中厭氧氨氧化菌群組成的分析。(3)本發(fā)明除了能夠快速分析厭氧氨氧化菌群結(jié)構(gòu)外，還能實(shí)現(xiàn)樣品中各厭氧氨氧化菌屬豐度的相對(duì)定量。本發(fā)明具有高重復(fù)性，高靈敏度，高通量，易于數(shù)字化等特點(diǎn)，適用于大量樣品的快速分析。利用本發(fā)明的方法分析反應(yīng)器中厭氧氨氧化菌群結(jié)構(gòu)，可以闡明厭氧氨氧化菌群與其生境的關(guān)系，揭示系統(tǒng)中厭氧氨氧化菌群的與反應(yīng)器運(yùn)行效果，即脫氮能力的聯(lián)系，從而對(duì)指導(dǎo)厭氧氨氧化菌群的定向調(diào)控有重要意義。反過來，對(duì)于一個(gè)成熟運(yùn)行的厭氧氨氧化反應(yīng)器，通過對(duì)反應(yīng)器內(nèi)厭氧氨氧化菌群結(jié)構(gòu)的解析，能夠?qū)Ψ磻?yīng)器運(yùn)行效果起到指示作用，即判斷反應(yīng)器運(yùn)行是否出現(xiàn)異常，如厭氧氨氧化菌的流失等。另外，通過該方法能夠研究反應(yīng)器運(yùn)行控制參數(shù)，如溫度、PH值、氧化還原電位等，對(duì)反應(yīng)器內(nèi)厭氧氨氧化菌群結(jié)構(gòu)的影響，有利于確定厭氧氨氧化菌群的最適生存條件，從而保證厭氧氨氧化反應(yīng)器的高效運(yùn)行。


圖I為具體實(shí)施方式
五中DNA測(cè)序儀獲得的待分析樣品的T-RFLP圖譜。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式快速分析厭氧氨氧化菌群的方法，按以下步驟進(jìn)行一、使用試劑盒提取待分析樣品的DNA ；
二、特異性PCR擴(kuò)增以樣品的DNA為模板，以Pla46F和630R為引物，進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物A，將擴(kuò)增產(chǎn)物A經(jīng)DNA純化試劑盒純化，獲得純化產(chǎn)物，然后以純化產(chǎn)物為模板，以AMX368F和AMX820R為引物，進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物B ；三、限制性內(nèi)切酶酶切將擴(kuò)增產(chǎn)物B經(jīng)IU的綠豆核酸酶消化30min，消化后的擴(kuò)增產(chǎn)物B采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，然后使用MspI和RsaI對(duì)純化的擴(kuò)增產(chǎn)物B進(jìn)行雙酶切，獲得酶切產(chǎn)物；四、酶切產(chǎn)物純化向酶切產(chǎn)物中加入I μ L 3mol/L、pH為5. 2的NaAc溶液和20μ L-20°C、體積濃度為96%的乙醇溶液，然后于IOOOOrpm離心，棄上清，向沉淀中加入體積濃度為70%的乙醇溶液清洗，然后于IOOOOrpm離心，取沉淀，干燥后加入5 μ L滅菌超純水溶解沉淀；五、毛細(xì)管電泳將I μ L步驟四中溶解的沉淀、9 μ L甲酰胺和O. 25 μ L DNA分子量?jī)?nèi)標(biāo)-500混勻后，用DNA測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，電泳程序①變性，90°C，120sec ;②進(jìn)樣，2. 0kV，30sec 分離，5. OkV，60°C，60min，電泳結(jié)果即為酶切后末端片段的長(zhǎng)度；六、毛細(xì)管電泳結(jié)果分析依據(jù)下述對(duì)應(yīng)關(guān)系，
厭氧氨氧化菌屬對(duì)應(yīng)末端片段長(zhǎng)度bp
(\indidaius Brocadia125
(\uididalns A nammoxoglohas91
(\indidaius Jeticnia476
(\mdidaius Knencnia291
(\indidaius ScuIindua355將DNA測(cè)序儀獲得的電泳結(jié)果數(shù)據(jù)采用GeneMapper 4. O進(jìn)行分析，即獲得厭氧氨氧化菌群分析結(jié)果；其中步驟二中引物Pla46F為5’ -GGATTAGGCATGCAAGTC-3’，引物630R為 5，-CAKAAAGGAGGTGATCC-3 ’，引物 AMX368F 為 5，-TTCGCAATGCCCGAAAGG-3 ’，引物 AMX820R為 5， -AAAACCCCTCTACTTAGTGCCC-3，。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式是對(duì)具體實(shí)施方式
一所述的快速分析厭氧氨氧化菌群的方法步驟二中第一次PCR擴(kuò)增做進(jìn)一步的說明，步驟二中第一次PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50 μ L反應(yīng)體系，由下列成分組成10 50ng樣品的DNA、1 μ L引物Pla46F、l μ L引物630R、5yL 10XBuffer、4 μ L dNTPsU μ L Taq 酶和余量的 ddH20 ;PCR 擴(kuò)增條件為94°C 變性 5min, 94°C變性 30s，60。。退火 30s, 72°C延伸 lmin,共 30 個(gè)循環(huán)，再 72°C延伸 IOmin, 4°C保溫。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式是對(duì)具體實(shí)施方式
一所述的快速分析厭氧氨氧化菌群的方法步驟二中第二次PCR擴(kuò)增做進(jìn)一步的說明，步驟二中第二次PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50 μ L反應(yīng)體系，由下列成分組成10 50ng純化產(chǎn)物、I μ L引物AMX368F、1 μ L引物AMX820R,5y L 10XBuffer、4y L dNTPsU μ L Taq酶和余量的ddH20 ;PCR擴(kuò)增條件為94°C變性5min，94°C變性30s，55。。退火30s，72。。延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)，再72°C延伸IOmin,4°C保溫。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式是對(duì)具體實(shí)施方式
一所述的快速分析厭氧氨氧化菌群的方法步驟三中雙酶切做進(jìn)一步的說明，步驟三中雙酶切反應(yīng)體系為10 μ L，由下列成分組成I μ L MspIUyL RsaIUuL Buffer和7 μ L純化的擴(kuò)增產(chǎn)物B，酶切反應(yīng)條件為37°C反應(yīng)3h，然后置于65°C 20min終止反應(yīng)。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式的待分析樣品為分別取自哈高科大豆廢水處理廠EGSB反應(yīng)器、哈高科大豆廢水處理廠SBR反應(yīng)器、哈爾濱太平污水處理廠A/0工藝和實(shí)驗(yàn)室厭氧氨氧化反應(yīng)器的污泥，本實(shí)施方式快速分析厭氧氨氧化菌群的方法，按以下步驟進(jìn) 行一、使用試劑盒(購買自MOBIO公司的PowerSoil DNAIsolation Kit)提取待分析樣品的DNA ；二、特異性PCR擴(kuò)增以樣品的DNA為模板，以Pla46F和630R為引物，進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物A，將擴(kuò)增產(chǎn)物A經(jīng)DNA純化試劑盒(購買自TaKaRa公司)純化，獲得純化產(chǎn)物，然后以純化產(chǎn)物為模板，以AMX368F和AMX820R為引物，進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物B;三、限制性內(nèi)切酶酶切將擴(kuò)增產(chǎn)物B經(jīng)IU的綠豆核酸酶消化30min，消化后的擴(kuò)增產(chǎn)物B米用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(購買自TransGen公司的EasyPure PCR PurificationKit)純化，然后使用MspI和RsaI對(duì)純化的擴(kuò)增產(chǎn)物B進(jìn)行雙酶切，獲得酶切產(chǎn)物；四、酶切產(chǎn)物純化向酶切產(chǎn)物中加入I μ L 3mol/L、pH為5· 2的NaAc溶液和20μ L-20°C、體積濃度為96%的乙醇溶液，然后于IOOOOrpm離心，棄上清，向沉淀中加入體積濃度為70%的乙醇溶液清洗，然后于IOOOOrpm離心，取沉淀，干燥后加入5 μ L滅菌超純水溶解沉淀；五、毛細(xì)管電泳步驟四中溶解的沉淀、9 μ L甲酰胺和O. 25 μ L DNA分子量?jī)?nèi)標(biāo)-500 (Applied Biosystems, USA)混勻后，用DNA測(cè)序儀(型號(hào)為ABI3130，購買自Applied Biosystems公司)進(jìn)行毛細(xì)管電泳，電泳程序①變性,90 °C, 120sec ;②進(jìn)樣，2. 0kV，30sec 分離，5. OkV，60°C，60min，電泳結(jié)果即為酶切后末端片段的長(zhǎng)度；六、毛細(xì)管電泳結(jié)果分析依據(jù)下述對(duì)應(yīng)關(guān)系，厭氧氨氧化菌屬對(duì)應(yīng)末端片段長(zhǎng)度bp
(\mdidaius Brocadia125
('undidams A nammoxoglobus91
Candidams ,Ieiteiiia476
(\indickitns Knenenia291
(ididaliis Scaiindua355 將DNA測(cè)序儀獲得的電泳結(jié)果數(shù)據(jù)采用GeneMapper 4. O (AppliedBiosystems, USA)進(jìn)行分析，即獲得厭氧氨氧化菌群分析結(jié)果；其中步驟二中引物Pla46F 為 5’ -GGATTAGGCATGCAAGTC-3’，引物 630R 為 5’ -CAKAAAGGAGGTGATCC-3’ (其中 K 為 G 或 T)，引物 AMX368F 為 5’ -TTCGCAATGCCCGAAAGG-3’，引物 AMX820R 為5’ -AAAACCCCTCTACTTAGTGCCC-3’。本實(shí)施方式步驟二中第一次PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50 μ L反應(yīng)體系，由下列成分組成10 50ng 樣品的 DNA、1 μ L 引物 Pla46F、l μ L 引物 630R、5y L 10XBuffer、4 μ LdNTPs、l μ L Taq酶和余量的ddH20 ;PCR擴(kuò)增條件為94°C變性5min，94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)，再72°C延伸10min，4°C保溫。本實(shí)施方式步驟二中第二次PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50 μ L反應(yīng)體系，由下列成分組成10 50ng 純化產(chǎn)物、IyL 引物 AMX368F、I μ L 引物 AMX820R、5 μ L 10 X Buffer,
4μ LdNTPsU μ L Taq酶和余量的ddH20 ;PCR擴(kuò)增條件為94°C變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，72。。延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)，再72°C延伸10min，4°C保溫。本實(shí)施方式步驟三中綠豆核酸酶、MspI和RsaI購買自NEB公司。本實(shí)施方式步驟三中雙酶切反應(yīng)體系為10 μ L，由下列成分組成I μ L MspI,I μ L RsaI、I μ LBuffer和7 μ L純化的擴(kuò)增產(chǎn)物B，酶切反應(yīng)條件為37°C反應(yīng)3h，然后置于65 0C 20min終止反應(yīng)。本實(shí)施方式DNA測(cè)序儀獲得的待分析樣品的T-RFLP圖譜如圖I所示。圖I中Hgkl為哈高科大豆廢水處理廠EGSB反應(yīng)器的顆粒污泥，Hgk2為哈高科大豆廢水處理廠SBR反應(yīng)器的活性污泥，Tp為哈爾濱太平市政污水處理廠A/0工藝活性污泥，Hit為哈爾濱工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室厭氧氨氧化反應(yīng)器的污泥。由圖I可以看出，厭氧氨氧化菌廣泛存在于污水處理廠活性污泥中，但厭氧氨氧化菌的群落組成存在差異。哈高科大豆廢水處理廠EGSB反應(yīng)器的顆粒污泥(Hgkl)中存在大量末端片段長(zhǎng)度(T-RF) 91bp和125bp,分別代表Anammoxoglobus屬和Brocadia屬；哈高科大豆廢水處理廠SBR反應(yīng)器活性污泥(Hgk2)中主要末端片段長(zhǎng)度125bp和355bp，分別代表Brocadia屬和Scalindua屬；哈爾濱太平市政污水處理廠A/0工藝活性污泥(Tp)中存在著91bp, 125bp, 355bp的末端片段長(zhǎng)度，分別代表Anammoxoglobus屬，Brocadia屬和Scalindua屬。從哈爾濱工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室厭氧氨氧化反應(yīng)器污泥(Hit)中厭氧氨氧化菌的群落組成較單一，主要為Brocadia屬。通過該方法，可進(jìn)一步對(duì)污泥樣品中厭氧氨氧化菌的豐度進(jìn)行分析，結(jié)果如表I。樣品Hgkl和Hgk2中優(yōu)勢(shì)厭氧氨氧化菌均為Brocadia屬，相對(duì)豐度分別為61. 7%和86. 5%。樣品Tp中未形成單一的優(yōu)勢(shì)厭氧氨氧化菌,其所含Anammoxoglobus屬,Brocadia屬和Scalindua屬的相對(duì)豐度分別為38. 2%,25. 7%和36. 1%.采用Hgk2為接種污泥的實(shí)驗(yàn)室厭氧氨氧化反應(yīng)器污泥(Hit)中Brocadia屬厭氧氨氧化菌相對(duì)豐度達(dá)到100%。表I污泥樣品中厭氧氨氧化菌群落組成分析
權(quán)利要求
1.ー種快速分析厭氧氨氧化菌群的方法，其特征在于快速分析厭氧氨氧化菌群的方法，按以下步驟進(jìn)行 一、使用試劑盒提取待分析樣品的DNA ； ニ、特異性PCR擴(kuò)增以樣品的DNA為模板，以Pla46F和630R為引物，進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物A，將擴(kuò)增產(chǎn)物A經(jīng)DNA純化試劑盒純化，獲得純化產(chǎn)物，然后以純化產(chǎn)物為模板，以AMX368F和AMX820R為引物，進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物B ； 三、限制性內(nèi)切酶酶切將擴(kuò)增產(chǎn)物B經(jīng)IU的綠豆核酸酶消化30min，消化后的擴(kuò)增產(chǎn)物B采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，然后使用MspI和RsaI對(duì)純化的擴(kuò)增產(chǎn)物B進(jìn)行雙酶切，獲得酶切產(chǎn)物； 四、酶切產(chǎn)物純化向酶切產(chǎn)物中加入IuL3mol/L、pH為5.2的NaAc溶液和20ii L-20°C、體積濃度為96%的こ醇溶液，然后于IOOOOrpm離心，棄上清，向沉淀中加入體積濃度為70%的こ醇溶液清洗，然后于IOOOOrpm離心，取沉淀，干燥后加入5 u L滅菌超純水溶解沉淀； 五、毛細(xì)管電泳將IuL步驟四中溶解的沉淀、9 ii L甲酰胺和0.25 ii L DNA分子量?jī)?nèi)標(biāo)-500混勻后，用DNA測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，電泳程序①變性，90°C，120sec 進(jìn)樣，.2.0kV，30sec 分離，5. OkV，60°C，60min，電泳結(jié)果即為酶切后末端片段的長(zhǎng)度； 六、毛細(xì)管電泳結(jié)果分析依據(jù)下述對(duì)應(yīng)關(guān)系，厭氧氨氧化菌屬對(duì)應(yīng)末端片段長(zhǎng)度bp (^amiickifns Brocadia125 (aiiaidutus Aficfmmoxoghtms91 (\mdidaius Jclicnia476 (\tndidaius Kvcnenia291 (.andiaaius Scalindna355 將DNA測(cè)序儀獲得的電泳結(jié)果數(shù)據(jù)采用GeneMapper 4. 0進(jìn)行分析，即獲得厭氧氨氧化菌群分析結(jié)果；其中步驟ニ中引物Pla46F為5’ -GGATTAGGCATGCAAGTC-3’，引物630R為5，-CAKAAAGGAGGTGATCC-3，，引物 AMX368F 為 5，-TTCGCAATGCCCGAAAGG-3，，引物 AMX820R 為5’ -AAAACCCCTCTACTTAGTGCCC-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種快速分析厭氧氨氧化菌群的方法，其特征在于步驟ニ中第一次PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50 ii L反應(yīng)體系，由下列成分組成10 50ng樣品的DNA、I U L 引物 Pla46F、l ii L 引物 630R、5ii L 10XBuffer,4 u L dNTPsU U L Taq 酶和余量的ddH20 ;PCR 擴(kuò)增條件為94°C變性 5min，94°C變性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 lmin，共 30個(gè)循環(huán)，再72°C延伸10min，4°C保溫。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種快速分析厭氧氨氧化菌群的方法，其特征在于步驟ニ中第二次PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50 ii L反應(yīng)體系，由下列成分組成10 50ng純化產(chǎn)物、I U L 引物 AMX368F、1 ii L 引物 AMX820R、5ii L 10 X Buffer、4 y L dNTPsU U L Taq 酶和余量的ddH20 ;PCR擴(kuò)增條件為94°C變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin,共30個(gè)循環(huán)，再72°C延伸10min，4°C保溫。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種快速分析厭氧氨氧化菌群的方法，其特征在于步驟三中雙酶切反應(yīng)體系為IOy L，由下列成分組成liiL MspIU U L RsaIUuL Buffer和7 y L純化的擴(kuò)增產(chǎn)物B，酶切反應(yīng)條件為37°C反應(yīng)3h，然后置于65°C 20min終止反應(yīng)。
全文摘要
一種快速分析厭氧氨氧化菌群的方法，涉及一種分析厭氧氨氧化菌群的方法。是要解決現(xiàn)有的分析厭氧氨氧化菌群的方法工作量大，費(fèi)用高，不能實(shí)現(xiàn)厭氧氨氧化菌的快速分析的問題。方法一、提取待分析樣品的DNA；二、特異性PCR擴(kuò)增；三、限制性內(nèi)切酶酶切；四、酶切產(chǎn)物純化；五、毛細(xì)管電泳；六、毛細(xì)管電泳結(jié)果分析，即獲得厭氧氨氧化菌群分析結(jié)果。本發(fā)明方法無需克隆、測(cè)序，直接通過對(duì)酶切后末端片段長(zhǎng)度的分析，即可完成對(duì)樣品中厭氧氨氧化菌群的快速分析，減小了工作量，降低了成本。本發(fā)明用于厭氧氨氧化菌群的快速分析。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102864230SQ20121036158
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月25日
發(fā)明者李相昆, 儲(chǔ)昭瑞, 張 杰 申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)