專利名稱：提高骨髓單個核細胞心肌細胞保護及遷移能力的處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高骨髓單個核細胞心肌細胞保護能力及遷移能力的預處理方法，可提高其移植治療急性心肌梗死的療效。背景技術(shù)：
目前充血性心力衰竭發(fā)病率逐年升高，全球有1500萬受累者，在美國有500萬患者，每年新發(fā)病例為46. 5萬，是65歲上人群的首位住院原因，也是心血管死亡的最主要原因。細胞移植療法可促進梗死局部血管新生和心肌再生而改善心肌梗死后心功能，已成為目前心血管領(lǐng)域的研究熱點。骨髓單個核干細胞(BMMNCs)是具多分化方向能力的成體干細胞，進行自體移植無排異及來源的限制，也不涉及倫理問題，是細胞移植治療的理想細胞來源。大量的基礎研究和初步的臨床試驗已顯示了骨髓單個核細胞移植治療缺血性心肌病的安全性和可行性。然而隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)干細胞移植治療心力衰竭仍存在一些問題， 主要是移植療效不夠理想。因此，提高移植療效是目前干細胞移植領(lǐng)域亟待解決的問題。
作為臨床應用，經(jīng)靜脈或冠脈注射移植細胞，細胞遷移至局部受損組織是干細胞修復損傷組織的第一步也是最關(guān)鍵的一步。動物研究表明經(jīng)靜脈注射干細胞盡管能遷移到局部損傷區(qū)域，但遷移至局部損傷的細胞數(shù)量是不充分的，它嚴重制約著干細胞修復梗死心肌的能力，也是導致移植療效不夠理想的主要原因之一。因此提高骨髓干細胞的遷移能力及心肌細胞保護能力是確保移植療效的關(guān)鍵，將有助于提高干細胞移植療法在臨床應用中的價值。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種提高骨髓單個核細胞心肌細胞保護能力及遷移能力的預處理方法，從而提高其移植治療急性心肌梗死的療效。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
一種提高骨髓單個核細胞遷移能力及心肌細胞保護能力的預處理方法，所述方法為將新鮮分離的骨髓單個核細胞先以Valsartan溶液培養(yǎng)30分鐘，再以Angiotensin II溶液培養(yǎng)2小時，得到處理后的骨髓單個核細胞用于移植治療急性心肌梗死；所述 Valsartan溶液中Valsartan終濃度為O. 5^2 μ mol/L,溶劑為低糖DMEM培養(yǎng)基；所述 Angiotensin II溶液中Angiotensin II終濃度為50 150nmol/L,溶劑為低糖DMEM培養(yǎng)基。
AngiotensinII為非特異性血管緊張素受體激動劑，可同時激活血管緊張素I型受體(ATlR)和血管緊張素2型受體(AT2R)，是美國Sigma Aldrich公司生產(chǎn)的化學試劑(分子式=C50H71N13O12 ;分子量 1046. 18 ;產(chǎn)品號A9525)。
Valsartan是特異性血管緊張素I型受體(ATlR)激動劑，由北京諾華制藥公司提供(分子式=C24H29N5O3 ;分子量435. 5)。終濃度為I μ mol/L，溶劑為低糖DMEM培養(yǎng)基。
所述培養(yǎng)均在常規(guī)條件下進行，具體于37°C下，在CO2體積濃度5%、空氣體積濃度 95%的混合氣體中進行。
優(yōu)選的，所述Valsartan溶液中Valsartan終濃度為I μ mol/L。
優(yōu)選的,所述Angiotensin II 溶液中 Angiotensin II 終濃度為 100nmol/L。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在通過預處理間接激活骨髓單個核細胞血管緊張素 2型受體AT2R激活的骨髓單個核細胞分泌一氧化氮增加，遷移能力及心肌細胞保護能力增強，一定程度上可提高其移植治療急性心肌梗死的療效。

圖I為利用transwell技術(shù)比較未處理骨髓單個核細胞(A)、CGP42112A預處理骨髓單個核細胞(C)、AngiotensinII與Valsartan聯(lián)合預處理骨髓單個核細胞(B)的體外遷移能力，標尺為100 μ m ；
圖2為利用共培養(yǎng)技術(shù)比較未處理骨髓單個核細胞(B)、CGP42112A預處理骨髓單個核細胞(D)、AngiotensinII與Valsartan聯(lián)合預處理骨髓單個核細胞(C)的體外心肌細胞保護能力，標尺為100 μ m ;箭頭所指為凋亡心肌細胞；圖A為缺氧缺血清直接誘導心肌細胞凋亡，作為陽性對照；
圖3為利用定量PCR技術(shù)比較未處理骨髓單個核細胞、CGP42112A預處理骨髓單個核細胞、AngiotensinII與V alsartan聯(lián)合預處理骨髓單個核細胞移植入大鼠心梗模型后的遷移情況；* P<0. 05 vs未處理骨髓單個核細胞移植組；
圖4為利用經(jīng)胸心臟超聲技術(shù)比較低糖DMEM培養(yǎng)基、未處理骨髓單個核細胞、 CGP42112A預處理骨髓單個核細胞、AngiotensinII與Valsartan聯(lián)合預處理骨髓單個核細胞經(jīng)尾靜脈途徑移植入大鼠心梗模型后心功能改善情況；其中圖A為各組大鼠心臟M型超聲圖(其中a為假手術(shù)組(正常大鼠組)，b為低糖DMEM培養(yǎng)基組，c為未處理骨髓單個核細胞組，d為CGP42112A預處理組，e為AngiotensinII與Valsartan聯(lián)合預處理組)，圖B為各組大鼠左室射血分數(shù)比較柱狀圖，圖C為各組大鼠心臟短軸縮短率比較柱狀圖；* p<0. 05 vs未處理骨髓單個核細胞移植組；
圖5為利用經(jīng)胸心臟超聲技術(shù)比較低糖DMEM培養(yǎng)基、未處理骨髓單個核細胞、 CGP42112A預處理骨髓單個核細胞、AngiotensinII與Valsartan聯(lián)合預處理骨髓單個核細胞經(jīng)心肌途徑移植入大鼠心梗模型后心功能改善情況；其中圖A為各組大鼠心臟M型超聲圖(其中a為假手術(shù)組(正常大鼠組)，b為低糖DMEM培養(yǎng)基組，c為未處理骨髓單個核細胞組，d為CGP42112A預處理組，e為AngiotensinII與Valsartan聯(lián)合預處理組)，圖B為各組大鼠左室射血分數(shù)比較柱狀圖，圖C為各組大鼠心臟短軸縮短率比較柱狀圖；* p〈0. 05 vs未處理骨髓單個核細胞組；
圖4、圖5的B、C中，MI即心梗模型，BMMNCs即骨髓單個核干細胞AngII即 AngiotensinII, Val 即 Valsartan, CGP 即 CGP42112A，“ + ” 表示添加，“一”表示未添加。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此
實施例I :
I.骨髓單個核細胞分離無菌條件下取心梗7天后Sprague Dawley (SD)大鼠的CN 102943063 A書明說3/4頁股骨及脛骨，用注射器沖洗骨髓腔收集骨髓液。將骨髓液置于Ficoll (天津市灝洋生物制品科技有限責任公司)溶液上，1800rpm離心20分鐘后取中間云霧狀細胞層，再以IOOOrpm 離心10分鐘，棄上清，細胞沉淀以低糖DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)重懸。
2.骨髓單個核細胞血管緊張素2型受體(AT2R)激活
(I)直接AT2R激活骨髓單個核細胞以含10nmol/L CGP42112A (美國Sigma Aldrich公司)的低糖DMEM培養(yǎng)基于37°C，含5% CO2飽和濕度(CO2 5%，空氣95%，V /V)的細胞培養(yǎng)箱(Forma 3111,美國Thermo Fisher公司)內(nèi)處理2小時；
(2)間接AT2R激活骨髓單個核細胞先以含I μ mol/L Valsartan (由北京諾華制藥公司提供)的低糖DMEM培養(yǎng)基于37°C，含5% CO2飽和濕度(CO2 5%，空氣95%，V /V)的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)處理半小時，再以100nmol/L的AngiotensinII (美國Sigma Aldrich公司) 于37°C，含5% CO2飽和濕度(CO2 5%，空氣95%，v /v)的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)處理2小時。
3.利用Transwell評價骨髓單個核細胞的體外遷移能力
分別獲得未預處理的骨髓單個核細胞及AT2R激活處理后的骨髓單個核細胞，各采用200ul含1% (v/v)FBS (杭 州四季青生物工程材料有限公司)的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸， 制備成5 X IO5Cel 1/200 μ I的細胞懸液，接種于Transwell小室(美國Costar公司，孔徑為 8 μ m)中，小室外添加500 μ I含20%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37°C，含5% CO2和飽和濕度(CO2 5%，空氣95%，V /v)的細胞培養(yǎng)箱孵育24小時。隨后，取出Transwell小室，用棉簽擦去小室膜上層細胞，PBS輕柔洗滌2次后，置于4% (w/w)多聚甲醛(美國Sigma公司) 內(nèi)，37°C 固定 30 分鐘，PBS 洗滌 2 3 次后，采用 I μ g/ml Hoechst 33258 (美國 Invitrogen 公司)室溫避光染色15分鐘，熒光顯微鏡(日本Olympus公司)拍照記錄，結(jié)果見圖I。
由圖I可見AT2R激活處理后的骨髓單個核細胞(CGP42112A預處理或 Angiotensin II與Valsartan聯(lián)合與處理)遷移至下層小室的能力增強。
4.利用共培養(yǎng)體系評價骨髓單個核細胞的體外心肌細胞保護能力
分別獲得未預處理的骨髓單個核細胞及AT2R激活處理后的骨髓單個核細胞，各采用200ul低糖DMEM培養(yǎng)基重懸，制備成2 X IO5CelΙ/mL的細胞懸液，接種于Transwell體系上層小室(美國Costar公司，孔徑為3 μ m)中，下層小室接種2 X IO5Cell的乳大鼠心肌細胞，置于37°C，含O. 5% O2 (O2 O. 5%，氮氣99. 5%，v /v)的缺氧培養(yǎng)箱中孵育48小時。隨后，取出Transwell小室，下層小室以PBS輕柔洗滌2次后，置于4%多聚甲醛(美國Sigma公司)內(nèi)，室溫固定10分鐘，PBS洗漆2 3次后，米用DeadEnd Fluorometric TUNEL System kit (美國Promega公司)進行TUNEL染色,突光顯微鏡(日本Olympus公司)拍照記錄,結(jié)果見圖2。
由圖2可見與AT2R激活處理過的骨髓單個核細胞共培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞抵抗缺氧缺血清的能力增強。
5.采用大鼠急性心梗模型的體內(nèi)移植來評價骨髓單個核細胞的體內(nèi)遷移能力
雌性Sprague Dawley (SD)大鼠(浙江省醫(yī)學科學院動物中心)經(jīng)水合氯醒麻醉后，氣管插管，小動物呼吸機支持，開胸，用6 — O絲線在左心耳下方結(jié)扎左前降支冠脈，根據(jù)心電圖變化和局部組織顏色變化確定心梗模型制成，關(guān)胸。分別獲得未預處理的雄性SD 大鼠骨髓單個核細胞及AT2R激活處理后的雄性SD大鼠骨髓單個核細胞，各采用Iml低糖 DMEM培養(yǎng)基重懸，制備成IXlO7ceIVmL的細胞懸液，通過尾靜脈注射入雌性SD大鼠心梗5模型中，24小時后，引頸處死大鼠,取出心臟左室,稱重,液氮研磨，采用Universal Genomic DNA Extration Kit Ver. 3. O (日本TAKARA公司)提取基因組DNA，以基因組DNA為模板，采用SYBR Premix Ex Taq kit (日本TAKARA公司)定量PCR檢測SRY基因(特異性表達與Y 染色體，代表雄性移植細胞)表達水平。引物序列Forward Sry CATCGAAGGGTTAAAGTGCCA ； Reverse Sry: ATAGTGTGTAGGTTGTTGTCC。計算公式所取材中的細胞總數(shù)=(實時定量PCR 檢測所得SRY的平均數(shù)X被檢DNA的稀釋倍數(shù))X [原取材質(zhì)量(mg)/用來提取DNA的標本質(zhì)量(mg)]，結(jié)果見圖3。
由圖3可見AT2R激活的骨髓單個核細胞遷移至缺血心肌病變部位的能力增強。
6.采用大鼠急性心梗模型的體內(nèi)移植來評價骨髓單個核細胞移植治療急性心肌梗死療效
雄性Sprague Dawley (SD)大鼠(浙江省醫(yī)學科學院動物中心)經(jīng)水合氯醒麻醉后，氣管插管，小動物呼吸機支持，開胸，用6 - O絲線在左心耳下方結(jié)扎左前降支冠脈，根據(jù)心電圖變化和局部組織顏色變化確定心梗模型制成，關(guān)胸。
(I)分別獲得未預處理的雄性SD大鼠骨髓單個核細胞及AT2R激活處理后的雄性 SD大鼠骨髓單個核細胞，各采用Iml低糖DMEM培養(yǎng)基重懸，制備成I X 107cell/mL的細胞懸液，通過尾靜脈注射入雄性SD大鼠心梗模型中，28天后行經(jīng)胸心臟超聲檢查評價心功能改善狀況；
(2)分別獲得未預處理的雄性SD大鼠骨髓單個核細胞及AT2R激活處理后的雄性 SD大鼠骨髓單個核細胞，各采用150 μ I低糖DMEM培養(yǎng)基重懸，制備成3 X IO6ceIlAiL的細胞懸液，經(jīng)心肌途徑注射入雄性SD大鼠心梗模型中，28天后行經(jīng)胸心臟超聲檢查評價心功能改善狀況，結(jié)果見圖4、圖5。
由圖4、圖5可見AT2R激活的骨髓單個核細胞經(jīng)尾靜脈途徑或經(jīng)心肌途徑移植， 均能改善心梗后心功能狀況。
結(jié)論血管緊張素2型受體(AT2R)激活(CGP42112A預處理或AngiotensinII和 Valsartan聯(lián)合預處理)處理骨髓單個核細胞能提高其體內(nèi)體外的運動遷移能力及心肌保護能力，從而進一步提高其移植治療急性心肌梗死的效果。
權(quán)利要求
1.一種提高骨髓單個核細胞的心肌細胞保護能力及遷移能力的預處理方法，所述方法為將新鮮分離的骨髓單個核細胞先以Valsartan溶液培養(yǎng)30分鐘，再以Angiotensin II 溶液培養(yǎng)2小時，得到處理后的骨髓單個核細胞；所述Valsartan溶液中Valsartan終濃度為O. 5 2 μ mol/L,溶劑為低糖DMEM培養(yǎng)基；所述Angiotensin II溶液中Angiotensin II 終濃度為5(Tl50nmol/L，溶劑為低糖DMEM培養(yǎng)基。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)均在37°C下，在CO2體積濃度5%、 空氣體積濃度95%的混合氣體中進行。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述Valsartan溶液中Valsartan終濃度為 I μ mol/L0
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述AngiotensinII溶液中Angiotensin II終濃度為IOOnmoI/L。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種提高骨髓單個核細胞遷移能力及心肌細胞保護能力的預處理方法，所述方法為將新鮮分離的骨髓單個核細胞先以Valsartan溶液培養(yǎng)30分鐘，再以Angiotensin II溶液培養(yǎng)2小時，得到處理后的骨髓單個核細胞用于移植治療急性心肌梗死；本發(fā)明通過預處理間接激活骨髓單個核細胞血管緊張素2型受體， AT2R激活的骨髓單個核細胞分泌一氧化氮增加，遷移能力及心肌細胞保護能力增強，一定程度上可提高其移植治療急性心肌梗死的療效。
文檔編號C12N5/078GK102943063SQ20121036390
公開日2013年2月27日 申請日期2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月26日
發(fā)明者王建安, 胡新央, 徐銀川 申請人:浙江大學