專(zhuān)利名稱(chēng)：小鼠肝臟羧酸酯酶基因克隆表達(dá)的制作方法
小鼠肝臟羧酸酯酶基因克隆表達(dá)技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
羧酸酯酶(Carboxylesterase, EC 3. I. I. I)屬于B-酯酶,能夠催化水解含羧酸酯基的脂肪族和芳烴類(lèi)有機(jī)化合物。羧酸酯酶在生物界分布極廣，從古細(xì)菌和真細(xì)菌、至真核微生物、昆蟲(chóng)乃至哺乳動(dòng)物的各種組織均有活性較高的羧酸酯酶，尤其肝臟中的酶活性最高。羧酸酯酶可以催化酯水解、酯合成、酯交換等具有重要應(yīng)用價(jià)值的反應(yīng)，由于羧酸酯酶在食品、染料、皮革、紙張等工業(yè)中有多樣的應(yīng)用，因此羧酸酯酶在生物技術(shù)領(lǐng)域扮演著極其重要的角色。此外還被應(yīng)用于制藥、染料、殺蟲(chóng)劑和殺菌劑等工農(nóng)業(yè)廢水中含羧酸酯基類(lèi)毒性污染物的降解。
目前已經(jīng)從人、微生物及昆蟲(chóng)中克隆到羧酸酯酶基因，其中從無(wú)色桿菌 (Achromobacter pichaudii)得到259aa的酶,其最高酶活為O. 7U/ml ;從嗜熱脂肪地芽胞桿菌(Geabacillusstearotheromphilus)得到 29KDa 的酶，其最高酶活為 700U/ml ;從嗜熱圓錐網(wǎng)團(tuán)菌(Dictyoglomus turgidum)得到45KDa的酶,其最高酶活為80U/mg ;從棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa armigera)得到IOOKDa的酶，其最高酶活為O. 32mmol/100ul ;從抗性蚊蟲(chóng)(Culex quinquefasciatus)得到60KDa的酶，其最高酶活為135U/mg。此外從斜紋夜蛾(Spodoptera litura)、鉛青鏈霉菌(Deduc Streptomyces lividans)、野山香(Bombyx momdarina M)、銅綠妮(Lucilia cuprina)、稻褐飛風(fēng)(Nilaparvata lugens)、大鼠(rat)以及人胎腦等來(lái)源均克隆得到相應(yīng)的羧酸酯酶。
然而，至今從小鼠肝臟中克隆獲得的羧酸酯酶報(bào)道很少，國(guó)外對(duì)其的研究應(yīng)用還很少(13篇研究論文，NCBI PUBMID數(shù)據(jù)庫(kù)檢索)，國(guó)內(nèi)至今未見(jiàn)研究報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種小鼠肝臟羧酸酯酶基因克隆表達(dá)，它運(yùn)用基因克隆技術(shù)，成功克隆到小鼠肝臟羧酸酯酶(Mceslf )基因，與表達(dá)載體PET_32a連接后在大腸桿菌 BL21中進(jìn)行了該基因的高效表達(dá)。而小鼠肝臟羧酸酯酶(Mceslf)基因?qū)秽?、西維因、 甲基對(duì)硫磷、聯(lián)苯菊酯等農(nóng)藥有降解作用。
本發(fā)明的表達(dá)是I.以小鼠肝臟總RNA為模板，通過(guò)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增了末端含有EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)的DNA片段，對(duì)其進(jìn)行了亞克隆及測(cè)序，用軟件Vector NTI對(duì)所測(cè)定序列與對(duì)應(yīng)的NCBI 序列(GenBank BC013479. I)進(jìn)行比對(duì)分析，確定該基因?yàn)镸ceslf。
—pt EcoR I起始密碼子 GMHEATGTTCCTTAGCACTCTGTTCCTGGTGTCTCTAGCAACCTGTGTGATTTGCGGAAATCCCTCTTCACCACCTGTGGTAGACACTGCTCATGGTAAAGTCCTGGGGAAACACGTGAACGTAGAAGGATTTTCACAGCCTGTGGCCGTCTTCCTGGGAATCCCCTTTGCCAAGCCCCCTCTTGGATCCCTGAGGTTTGCTCCACCACAGCCTGCAGAGCCCTGGAGCTCAGTGAAGAATGCCACCACCTACCCACCTATGTGCTCCCAAGATGCAGCTAGAGGACAGGCGGTCAATGACCTCATAACCAATAGAAAGGAGAAAATCCATCTTGAATTTTCTGAAGATTGCCTGTACCTAAATATTTACACTCCTGCGGACTTTTCAAAGAACAGTAGGCTACCGGTGATGGTGTGGATCCATGGAGGTGGACTGAAGCTGGGTGGGGCATCAAGCTTTGATGGACGGGCTCTCTCTGCATACGAAAATGTGGTGGTGGTGGCCATTCAATATCGCCTGAGTATCTGGGGATTCTTCAGCACAGGGGATGAACACAGTCGGGGAAACTGGGGTCATTTGGACCAAGTGGCTGCTCTGCATTGGGTCCAGGACAACATTGCCAACTTTGGCGGGGACCCAGGCTCTGTGACCATCTTTGGAGAGTCAGCAGGAGGTTACAGTGTCTCAATTCTTATATTGTCCCCATTGTCCAAGAACCTCTTCCACAGTGCCATTTCTGAGAGTGGTGTGGCCTTCATTCCTGGAATGTTTACCAAAGATGTGAGGCCAATTACTGAGCAAATTGCTGTTACTGCTGGCTGTAAGACCACCACGTCTGCCGTCATTGTTCACTGCATGCGCCAGAAGACGGAGGAGGAGCTATTAGAGATCATGCATAAATTGAATCTGTATAAACTGAGTTTACAAGGAGATACCAAAAATAGCGACCAGTTCGTGACAAGTGTGCTTGATGGAGTGGTGCTACCAAAGGACCCCAAAGAGATCCTGGCTGAGAAGAACTTCAACACTGTGCCTTACATTGTGGGAATCAACAAGCAAGAATGTGGCTGGCTTCTGCCAACAATGACGGGATTTCTACCAGCTGATGTAAAATTGGACAAGAAGAAAGCCATTGCACTCCTGGAGCAATTTGCTTCCATGACTGGCATACCAGAGGATATTATTCCAGTTGCTGTTGAGAAGTACACAAAAGGTAGTGATGACCCTGATCAGATCAGAGAGGGAGTTCTCGACGCAATGGGGGATGTGGCATTTGGTGTTCCATCGGTGATTGTGTCCCGTGGCCACAGAGACACTGGAGCTCCCACCTACATGTATGAGTATCAATACTACCCAAGCTTCTCATCACCCCAAAGACCCAAGAATGTAGTAGGAGACCATGCAGATGATGTCTACTCTGTCTTCGGTGCTCCAATTTTAAGAGAGGGTGCCTCCGAAGAGGAGATCAATCTCAGCAAGATGGTGATGAAATCCTGGGCCAACTTTGCTCGGAATGGGAACCCTAATGGCAAAGGGCTGCCTCATTGGCCAAAGTATGATCAGAAAGAAGGATATCTTCATATTGGTGGCACCACCCAGCAAGCCCAGTGACTGAAGGAGGAGGAAGTGACTTTCTGGACACAGTCCCTTGCCAAGAAACAACCCCAGCCATACCACAATGAGCTGTGACTtK^2.通過(guò)EcoR I 和 Xho I 進(jìn)行雙酶切(double digestion),使 Mceslf 基因經(jīng) T4 DNA 連接酶(T4 DNA Iigase)作用連接在大腸桿菌高效表達(dá)載體PET-32a的EcoR I和Xho I 酶切位點(diǎn)上構(gòu)建重組質(zhì)粒PET-32a-Mceslf，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21 (DE3) (Studier F ff, et al. J. Mol. Biol. 1986, 189:113),進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)此酶是由535個(gè)氨基酸殘基組成的(如下所示)，由于選PET-32a作為表達(dá)載體，SDS-PAGE顯示分子量為76. 9KD，跟預(yù)期一樣。
MFLSTLFLVSLATCVICGNPSSPPVVDTAHGKVLGKHVNVEGFSQPVAVFLGIPFAKPPLGSLRFAPPQ PAEPWSSVKNATTYPPMCSQDAARGQAVNDLITNRKEKIHLEFSEDCLYLNIYTPADFSKNSRLPVMVWIHGGGLKL GGASSFDGRALSAYENVVVVAIQYRLSIWGFFSTCDEHSRGNWGHLDQVAALHWVQDNIANFGGDPGSVTIFGESAG GYSVSILILSPLSKNLFHSAISESGVAFIPGMFTKDVRPITEQIAVTAGCKTTTSAVIVHCMRQKTEEELLEIMHKL NLYKLSLQGDTKNSDQFVTSVLDGVVLPKDPKEILAEKNFNTVPYIVGINKQECGWLLPTMTGFLPADVKLDKKKAI ALLEQFASMTGIPEDIIPVAVEKYTKGSDDPDQIREGVLDAMGDVAFGVPSVIVSRGHRDTGAPTYMYEYQYYPSFS SPQRPKNVVGDHADDVYSVFGAPILREGASEEEINLSKMVMKSWANFARNGNPNGKGLPHWPKYDQKEGYLHIGGTT QQAQ3.采用Ni-柱親和層析，對(duì)Mceslf的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了純化，獲得了高純度(90%以上) 的 Mceslf0
4.采用固蘭B鹽法測(cè)得可溶性總蛋白，純化的可溶性重組蛋白，包涵體總復(fù)性蛋白及純化的包涵體復(fù)性重組蛋白對(duì)應(yīng)的酶活力濃度分別為209U/ml、537U/ml、3122U/ml、7727U/ml，酶比活分別為 109. 4U/mg、257. lU/mg、2584. 4U/mg、5396. OU/mg。5.對(duì)大腸桿菌中Mceslf的表達(dá)產(chǎn)物做生物降解的活性測(cè)定。以呋喃丹、西維因、甲基對(duì)硫磷及聯(lián)苯菊酯為底物，以高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行殘留量測(cè)定，研究發(fā)現(xiàn)該酶對(duì)呋喃丹、西維因、甲基對(duì)硫磷及聯(lián)苯菊酯的生物活性都很強(qiáng)。本發(fā)明的有益效果是利用本發(fā)明構(gòu)建的工程菌及其產(chǎn)生的重組酶降解環(huán)境中的農(nóng)藥殘留物，改善環(huán)境，它與其他的降解方法相比酶制作方法簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低且降解效率聞。運(yùn)用基因克隆技術(shù)，成功克隆到小鼠肝臟羧酸酯酶(Mceslf)基因，與表達(dá)載體PET-32a連接后在大腸桿菌BL21中進(jìn)行了該基因的高效表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)此酶是由535個(gè)氨基酸殘基組成的，SDS-PAGE顯示分子量約為76. 9KD，所得酶的最大酶活力濃度為7727U/ml，最大酶比活為5396U/mg，比所有已經(jīng)克隆得到的羧酸酯酶酶活都要高。研究發(fā)現(xiàn)Mceslf對(duì)呋喃丹、西維因、甲基對(duì)硫磷、聯(lián)苯菊酯等農(nóng)藥有降解作用，且降解效率很高。


圖I羧酸酯酶Mceslf基因瓊脂糖鑒定Linel:2000markerLine2 :Mceslf 基因 PCR 產(chǎn)物圖2質(zhì)粒PET-32a-Mceslf的構(gòu)建過(guò)程示意3 SDS-PAGE檢測(cè)Mceslf基因在大腸桿菌中的表達(dá)Linel BL21 (DE3)-pET-32a_Mceslf 菌包涵體總蛋白Line2 BL21 (DE3)-pET-32a_Mceslf 菌可溶性總蛋白Line3 :低分子量蛋白MarkerLine4 BL21 (DE3)含 pET-32a_Meslf 誘導(dǎo)Line5 BL21 (DE3)含 pET-32a_Meslf 未誘導(dǎo)Line6 BL21 (DE3)含 pET_32a:誘導(dǎo)Line7 BL21 (DE3)含 pET_32a 未誘導(dǎo)Line8 BL21 (DE3)誘導(dǎo)Line9 BL21 (DE3)未誘導(dǎo)圖4 SDS-PAGE檢測(cè)Mceslf純化結(jié)果Linel BL21 (DE3)-pET-32a_Mceslf 菌總蛋白Line2 BL21 (DE3)-pET-32a_Mceslf 菌可溶性總蛋白Line3 :鎳柱純化的可溶性MceslfLine4 :低分子量蛋白MarkerLine5 :鎳柱純化的Mceslf包涵體圖5 α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線
圖6 Mceslf降解50mg/L呋喃丹空白組HPLC圖譜圖7 Mceslf降解50mg/L呋喃丹5小時(shí)HPLC圖譜圖8 Mceslf降解50mg/L呋喃丹12小時(shí)HPLC圖譜圖9 Mceslf降解50mg/L呋喃丹24小時(shí)HPLC圖譜圖10 Mceslf降解50mg/L西維因空白組HPLC圖譜圖11 Mceslf降解50mg/L西維因5小時(shí)HPLC圖譜圖12 Mceslf降解50mg/L西維因12小時(shí)HPLC圖譜圖13 Mceslf降解50mg/L西維因24小時(shí)HPLC圖譜圖14 Mceslf降解10mg/L甲基對(duì)硫磷空白組HPLC圖譜圖15 Mceslf降解10mg/L甲基對(duì)硫磷5小時(shí)HPLC圖譜圖16 Mceslf降解10mg/L甲基對(duì)硫磷12小時(shí)HPLC圖譜圖17 Mceslf降解10mg/L甲基對(duì)硫磷24小時(shí)HPLC圖譜圖18 Mceslf降解10mg/L甲基對(duì)硫磷48小時(shí)HPLC圖譜圖19 Mceslf降解10mg/L聯(lián)苯菊酯空白組HPLC圖譜圖20 Mceslf降解10mg/L聯(lián)苯菊酯5小時(shí)HPLC圖譜圖21 Mceslf降解10mg/L聯(lián)苯菊酯12小時(shí)HPLC圖譜圖22 Mceslf降解10mg/L聯(lián)苯菊酯24小時(shí)HPLC圖譜
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l.Mceslf基因的克隆及表達(dá)
l.Mceslf基因的克隆
I. I小鼠肝臟總RNA的提取
采用TIAN GEN RNAprep pure動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒提取小鼠肝臟總RNA。I. 2 通過(guò) RT-PCR 擴(kuò)增 Mceslf 基因I. 2. IcDNA第一鏈合成
利用TINA GEN TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA第一鏈，具體步驟如下
1)在冰浴的無(wú)核酸酶的離心管中加入如下反應(yīng)混合物
10. 5ul總RNA提取液；
2ul oligo (dT)15 ；
2ul dNTP (2. 5mM each)；
2)70°C加熱5min后迅速在冰上冷卻2min。簡(jiǎn)短離心收集反應(yīng)液后加入以下各組分
4ul 5XFirst-Strand Buffer (含有 DTT) ;0· 5ulRNasin ;
3)加Iul (200U) TIANScript M-MLV，輕輕用移液器混勻；
4)42°C溫浴 50min;
5)95°C加熱5min終止反應(yīng);
6)用RNase-free_ddH20將反應(yīng)體系稀釋到50ul，此即為cDNA第一鏈。L 2. 2Mceslf基因片段的PCR擴(kuò)增
以 5 ' - GGAATTCATGTTCCTTAGCACTCTGTTCCT -3 ; 和 5 '-CTCGAGTCACAGCTCATTGTGGTATGG-3 ;為引物(引物由上海生工合成)，以I. 2. I合成的cDNA第一鏈為模板，在以下條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增
反應(yīng)體系
模板 2ul，引物 I Iul，引物 2 Iul，10X PCR buffer 5ul，Taq 聚合酶 Iul，dNTP 4ul，雙蒸水36ul。PCR擴(kuò)增條件
a.94°C 變性 5min ；b.940C變性45s，54°C退火2min，72°C延伸2min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；
c.72°C 延伸 IOmin ；
d.40C保存，放置至室溫，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。1.2.3 Mceslf基因的序列測(cè)定及分析
將1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到的大小合適的片段，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(上海生工)進(jìn)行目的片段的回收，經(jīng)O. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收片段的濃度及純度(如圖1)，之后在T4 DNA連接酶的作用下，與pUCm-T載體(上海生工)，22°C連接16h，構(gòu)建重組質(zhì)粒PUCm-T-Mceslf0采用CaCl2轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 a (TaKaBa)，進(jìn)行氨芐青霉素抗性篩選，挑取平板上的單菌落進(jìn)行PCR及雙酶切鑒定，將初步鑒定正確的亞克隆，送往上海生工進(jìn)行DNA測(cè)序。測(cè)序結(jié)果出來(lái)后，利用Vector nti 11. 5. I軟件對(duì)所測(cè)定序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)所克隆的DNA片段為一完整的開(kāi)放閱讀框，其基因全長(zhǎng)1686bp，由于突變導(dǎo)致提取終止，最終編碼535個(gè)氨基酸殘基。I. 3 Mceslf的表達(dá)與純化
I. 3. I重組質(zhì)粒PET-32a-Mceslf的構(gòu)建(如圖2)
質(zhì)粒pUCm-T-Mceslf以EcoR I和Xho I酶切，回收1698bp的小片段，連接到經(jīng)EcoRI和Xho I酶切的質(zhì)粒pET_32a (Novagen)上，得到了正確的重組質(zhì)粒，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌BL21 (DE3)。1.3.2 Mceslf基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)
將含有質(zhì)粒PET-32a-MCeslf的BL21 (DE3)菌株按照I :50的比例接種在LB液體培養(yǎng)基中(含有終濃度為100ug/ml氨芐青霉素)，37°C恒溫震蕩搖床培養(yǎng)過(guò)夜(180rpm)，作為種子液使用。將種子液按照I :20的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中(含有終濃度為100ug/ml氨芐青霉素)，37攝氏度，180rpm搖床培養(yǎng)2_3h。加入IPTG (終濃度ImM)，繼續(xù)搖床培養(yǎng)5h。于IOOOOrpm下離心lOmin，取沉淀(菌體)，加入Iml 8M尿素重懸，4°C冰箱過(guò)夜，取IOml進(jìn)行12%SDS_PAGE凝膠電泳檢測(cè)目的蛋白帶的表達(dá)。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果(圖3)表明在76. 9KD附近有一條目的蛋白帶，與預(yù)期大
小一致。I. 3. 3 Mceslf 的分離純化
采用I. 2. 5的方法誘導(dǎo)表達(dá)工程菌，在4°C條件下，IOOOOrpm, IOmin離心收集菌體；菌體沉淀用O. 2M磷酸緩沖液(pH7. O)懸浮，加入溶菌酶(100ug/ml)進(jìn)行細(xì)胞超聲波破碎(功率300W，超聲5秒，間隔9秒，重復(fù)30次)，lOOOOrpm，離心15min，取上清，得到酶儲(chǔ)備液。酶儲(chǔ)備液進(jìn)行Ni-柱親和層析。分別以10倍柱體積的ImM和20mM的咪唑進(jìn)行洗滌，最后用200mM的咪唑洗脫，洗脫液先用0. 2M磷酸緩沖液(pH7. 0)透析，再用蔗糖進(jìn)行濃縮，以SDS-PAGE檢測(cè)純度。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)以上純化過(guò)程，獲得了純度高(90%)的Mceslf目的蛋白(如圖4)。米用固蘭B 鹽法(A study of Housefly esterases by means of a sensitivecolorimeteric menthod
K. VAN ASPEREN 1962)測(cè) Mceslf 的酶活性。
8
2. I所需試劑
O. 03M磷酸鹽緩沖液(PH7. O) =Na2HPO4 5. 373g，NaH2PO4 2. 340g,分別溶解并定容至500ml，混合后調(diào)PH到7.0 ；
IOmM α -萘酚標(biāo)準(zhǔn)溶液稱(chēng)I. 441g α -萘酚溶于無(wú)水乙醇中，并定容至IOOml ；
0.03Μ α -乙酸萘酯溶液稱(chēng)O. 2793g α -乙酸萘酯溶于無(wú)水乙醇中，并定容至50ml ;DBLS (固蘭B鹽顯色劑)Ig固蘭B鹽溶于IOOml雙重水，12. 5g SDS溶于250ml雙重水，將兩種溶液混合后過(guò)濾待用；
Na2HPO4、似& 04和α-萘酚均為分析純，α -乙酸萘酯購(gòu)自阿拉丁，固蘭B鹽購(gòu)自O(shè)urchem02. 3 α -萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
先將IOmM的α -萘酚標(biāo)準(zhǔn)溶液用O. 03Μ磷酸鹽緩沖液稀釋為不同濃度梯度，與500ulDBLS混合后27°C水浴10分鐘，于600nm下比色，記錄個(gè)濃度梯度下的0D600值，然后以α -萘酚濃度為橫坐標(biāo)，以0D600值為縱坐標(biāo)作出α -萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖5)。2. 3 Mceslf酶活性測(cè)定
采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得Mceslf可溶性總蛋白，純化的可溶性目的蛋白，包涵體總復(fù)性蛋白，純化的包涵體復(fù)性目的蛋白的蛋白濃度分別為1.911 mg/ml,2. 089 mg/mlU. 208mg/ml、L 432mg/ml。采用固蘭B鹽法測(cè)以上四種蛋白的酶活，具體做法為2.5mla-乙酸萘酯(含O. 0003Μα-乙酸萘酯)與500ul蛋白溶液混合后27°C反應(yīng)半小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后加500ulDBLS并置于27°C反應(yīng)10分鐘后測(cè)600nm下比色。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出對(duì)應(yīng)的α _萘酚產(chǎn)量。酶活性單位定義單位時(shí)間內(nèi)催化產(chǎn)生I μΜ α-萘酚所需酶量定義為一個(gè)酶活單位，即 1 U=1 mmol *T,_1 miη~1 η酶活性濃度定義單位體積所含的酶活力單位數(shù)，即1U*L_1酶比活力定義單位mg酶所具有的酶活力單位數(shù),即lU*mg-l。經(jīng)計(jì)算得出四中蛋白對(duì)應(yīng)的生成α - 丁萘酚的量分別為O. 126 μ mol/L、O. 321 μ mol/L、I. 873 μ mol/L,4. 637 μ mol/L ;對(duì)應(yīng)的酶活力濃度為 209U/ml、537U/ml、3122U/ml、7727U/ml ;酶比活分別為 109. 4U/mg、257. lU/mg、2584. 4U/mg、5396. 0U/mg。Mceslf的獲得及其用于對(duì)呋喃丹、西維因、甲基對(duì)硫磷和聯(lián)苯菊酯等農(nóng)藥的降解3. I Mceslf的獲得參照實(shí)施例I. 3. 3所制備的酶儲(chǔ)備液。3. 2所需試劑
咲喃丹標(biāo)品母液lg/L ;西維因標(biāo)品母液4 g/L ;甲基對(duì)硫憐標(biāo)品母液I g/L ;聯(lián)苯菊酷標(biāo)品母液I g/L ；
其中呋喃丹、西維因、甲基對(duì)硫磷購(gòu)自中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，均為標(biāo)品(純度在96%以上)。聯(lián)苯菊酯購(gòu)自上海市農(nóng)藥研究所，為標(biāo)品(純度為96. 6%)。3.3 Mceslf對(duì)呋喃丹、西維因、甲基對(duì)硫磷和聯(lián)苯菊酯等農(nóng)藥的降解作用3. 3. I Mceslf對(duì)呋喃丹的降解作用
2ml的酶液與IOml呋喃丹(50mg/L)混合后置于27°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，200rpm反應(yīng)5小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)，以2ml 0· 03M磷酸鹽緩沖液(PH7. O)做為空白對(duì)照，然后將四個(gè)反應(yīng)液經(jīng)0. 22um濾器過(guò)濾后用HPLC (色譜柱為C18反相色譜柱；流動(dòng)相為甲醇/水=70/30 ；流速為I. Oml/mim;檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm ;進(jìn)樣量為IOul ;柱溫為30°C )檢測(cè)呋喃丹殘留量，結(jié)果(如圖6-圖9)顯示Mceslf對(duì)呋喃丹具有降解作用，O小時(shí)空白組保留時(shí)間為3. 588，峰面積為3053185 ；5小時(shí)保留時(shí)間為3. 570，峰面積為2384557，降解率為21. 90% ；12小時(shí)保留時(shí)間為3. 575，峰面積為2223100，降解率為27. 19% ；24小時(shí)保留時(shí)間為3. 577，峰面積為2164976，降解率為 29. 09%。3. 3. 2 Mceslf對(duì)西維因的降解作用
2ml的酶液與IOml西維因(50mg/L)混合后置于27°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，200rpm反應(yīng)5小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)，以2ml O. 03M磷酸鹽緩沖液(PH7. O)做為空白對(duì)照，然后將四個(gè)反應(yīng)液經(jīng)O. 22um濾器過(guò)濾后用HPLC (色譜柱為C18反相色譜柱；流動(dòng)相為甲醇/水=60/40 ；流速為I. Oml/mim;檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm ;進(jìn)樣量為IOul ;柱溫為30°C )檢測(cè)西維因殘留量,結(jié)果(如圖10-圖13)顯示Mceslf對(duì)西維因具有降解作用，O小時(shí)空白組保留時(shí)間為6. 156，峰面積為8795249 ；5小時(shí)保留時(shí)間為6. 155，峰面積為7769906，降解率為11. 66% ；12小時(shí)保留時(shí)間為6. 160，峰面積為6593095，降解率為25. 04% ；24小時(shí)保留時(shí)間為6. 148，峰面積為6270043，降解率為28. 71%。3. 3. 3 Mceslf對(duì)甲基對(duì)硫磷的降解作用
2ml的酶液與IOml甲基對(duì)硫磷(10mg/L)混合后置于27°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，200rpm反應(yīng)5小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)及48小時(shí)，以2ml O. 03M磷酸鹽緩沖液(PH7. O)做為空白對(duì)照，然后將四個(gè)反應(yīng)液經(jīng)O. 22um濾器過(guò)濾后用HPLC (色譜柱為C18反相色譜柱；流動(dòng)相為甲醇/水=60/40 ;流速為O. 6ml/mim;檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm ;進(jìn)樣量為50ul ;柱溫為30。。)檢測(cè)甲基對(duì)硫磷殘留量，結(jié)果(如圖14-圖18)顯示Mceslf對(duì)甲基對(duì)硫磷具有降解作用，O小時(shí)空白組保留時(shí)間為6. 297，峰面積為785679 ；5小時(shí)保留時(shí)間為6. 184，峰面積為765334，降解率為2. 59% ；12小時(shí)保留時(shí)間為6. 199，峰面積為756590，降解率為3. 70% ；24小時(shí)保留時(shí)間為6. 196，峰面積為419315，降解率為46. 6% ；48小時(shí)保留時(shí)間為6. 200，峰面積為228778，降解率為 70. 88%。3.3.4 Mceslf對(duì)聯(lián)苯菊酯的降解作用
2ml的酶液與IOml聯(lián)苯菊酯(10mg/L)混合后置于27°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，200rpm反應(yīng)5小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)，以2ml O. 03M磷酸鹽緩沖液(PH7. O)做為空白對(duì)照，然后將四個(gè)反應(yīng)液經(jīng)O. 22um濾器過(guò)濾后用HPLC(色譜柱為C18反相色譜柱；流動(dòng)相為甲醇/水=80/20 ；流速為O. 6ml/mim;檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm ;進(jìn)樣量為IOul ;柱溫為30°C)檢測(cè)聯(lián)苯菊酯殘留量，結(jié)果(如圖19-圖22)顯示Mceslf對(duì)聯(lián)苯菊酯具有降解作用，O小時(shí)空白組保留時(shí)間為3. 350，峰面積為2960930 ；5小時(shí)保留時(shí)間為3. 340，峰面積為2733521，降解率為7. 68% ；12小時(shí)保留時(shí)間為3. 340，峰面積為1553286，降解率為47. 54% ；24小時(shí)保留時(shí)間為3. 360，峰面積為656201，降解率為77. 84%。
權(quán)利要求
1. 一種小鼠肝臟羧酸酯酶基因克隆表達(dá)，其表達(dá)是(O.以小鼠肝臟總RNA為模板，通過(guò)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增了末端含有EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)的DNA片段，對(duì)其進(jìn)行了亞克隆及測(cè)序，用軟件Vector NTI對(duì)所測(cè)定序列與對(duì)應(yīng)的NCBI序列進(jìn)行比對(duì)分析，確定該基因?yàn)镸ceslf ；EcoR I起始 碼子GMHEATGTTCCTTAGCACTCTGTTCCTGGTGTCTCTAGCAACCTGTGTGATTTGCGGAAATCCCTCTTCACCACCTGTGGTAGACACTGCTCATGGTAAAGTCCTGGGGAAACACGTGAACGTAGAAGGATTTTCACAGCCTGTGGCCGTCTTCCTGGGAATCCCCTTTGCCAAGCCCCCTCTTGGATCCCTGAGGTTTGCTCCACCACAGCCTGCAGAGCCCTGGAGCTCAGTGAAGAATGCCACCACCTACCCACCTATGTGCTCCCAAGATGCAGCTAGAGGACAGGCGGTCAATGACCTCATAACCAATAGAAAGGAGAAAATCCATCTTGAATTTTCTGAAGATTGCCTGTACCTAAATATTTACACTCCTGCGGACTTTTCAAAGAACAGTAGGCTACCGGTGATGGTGTGGATCCATGGAGGTGGACTGAAGCTGGGTGGGGCATCAAGCTTTGATGGACGGGCTCTCTCTGCATACGAAAATGTGGTGGTGGTGGCCATTCAATATCGCCTGAGTATCTGGGGATTCTTCAGCACAGGGGATGAACACAGTCGGGGAAACTGGGGTCATTTGGACCAAGTGGCTGCTCTGCATTGGGTCCAGGACAACATTGCCAACTTTGGCGGGGACCCAGGCTCTGTGACCATCTTTGGAGAGTCAGCAGGAGGTTACAGTGTCTCAATTCTTATATTGTCCCCATTGTCCAAGAACCTCTTCCACAGTGCCATTTCTGAGAGTGGTGTGGCCTTCATTCCTGGAATGTTTACCAAAGATGTGAGGCCAATTACTGAGCAAATTGCTGTTACTGCTGGCTGTAAGACCACCACGTCTGCCGTCATTGTTCACTGCATGCGCCAGAAGACGGAGGAGGAGCTATTAGAGATCATGCATAAATTGAATCTGTATAAACTGAGTTTACAAGGAGATACCAAAAATAGCGACCAGTTCGTGACAAGTGTGCTTGATGGAGTGGTGCTACCAAAGGACCCCAAAGAGATCCTGGCTGAGAAGAACTTCAACACTGTGCCTTACATTGTGGGAATCAACAAGCAAGAATGTGGCTGGCTTCTGCCAACAATGACGGGATTTCTACCAGCTGATGTAAAATTGGACAAGAAGAAAGCCATTGCACTCCTGGAGCAATTTGCTTCCATGACTGGCATACCAGAGGATATTATTCCAGTTGCTGTTGAGAAGTACACAAAAGGTAGTGATGACCCTGATCAGATCAGAGAGGGAGTTCTCGACGCAATGGGGGATGTGGCATTTGGTGTTCCATCGGTGATTGTGTCCCGTGGCCACAGAGACACTGGAGCTCCCACCTACATGTATGAGTATCAATACTACCCAAGCTTCTCATCACCCCAAAGACCCAAGAATGTAGTAGGAGACCATGCAGATGATGTCTACTCTGTCTTCGGTGCTCCAATTTTAAGAGAGGGTGCCTCCGAAGAGGAGATCAATCTCAGCAAGATGGTGATGAAATCCTGGGCCAACTTTGCTCGGAATGGGAACCCTAATGGCAAAGGGCTGCCTCATTGGCCAAAGTATGATCAGAAAGAAGGATATCTTCATATTGGTGGCACCACCCAGCAAGCCCAGTGACTGAAGGAGGAGGAAGTGACTTTCTGGACACAGTCCCTTGCCAAGAAACAACCCCAGCCATACCACAATGAGCTGTGACTtK^^ I I * tti 石I(2).通過(guò)EcoR I和Xho I進(jìn)行雙酶切，使Mceslf基因經(jīng)T4 DNA連接酶作用連接在大腸桿菌高效表達(dá)載體PET-32a的EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)上構(gòu)建重組質(zhì)粒PET-32a-Mceslf，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；此酶是由535個(gè)氨基酸殘基組成的，由于選PET-32a作為表達(dá)載體，SDS-PAGE顯示分子量為76. 9KD，跟預(yù)期一樣；MFLSTLFLVSLATCVICGNPSSPPVVDTAHGKVLGKHVNVEGFSQPVAVFLGIPFAKPPLGSLRFAPPQPAEPWSSVKNATTYPPMCSQDAARGQAVNDLITNRKEKIHLEFSEDCLYLNIYTPADFSKNSRLPVMVWIHGGGLKLGGASSFDGRALSAYENVVVVAIQYRLSIWGFFSTGDEHSRGNWGHLDQVAALHWVQDNIANFGGDPGSVTIFGESAGGYSVSILILSPLSKNLFHSAISESGVAFIPGMFTKDVRPITEQIAVTAGCKTTTSAVIVHCMRQKTEEELLEIMHKLNLYKLSLQGDTKNSDQFVTSVLDGVVLPKDPKEILAEKNFNTVPYIVGINKQECGWLLPTMTGFLPADVKLDKKKAIALLEQFASMTGIPEDIIPVAVEKYTKGSDDPDQIREGVLDAMGDVAFGVPSVIVSRGHRDTGAPTYMYEYQYYPSFSSPQRPKNVVGDHADDVYSVFGAPILREGASEEEINLSKMVMKSWANFARNGNPNGKGLPHWPKYDQKEGYLHIGGTTQQAQ采用Ni-柱親和層析，對(duì)Mceslf的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了純化，獲得了高純度90%以上的Mceslf。
2.如權(quán)利要求I所述的一種小鼠肝臟羧酸酯酶基因克隆表達(dá)，其特征是有535個(gè)氨基酸組成的蛋白，是一種B-酯酶，能夠催化水解含羧酸酯基的脂肪族和芳烴類(lèi)有機(jī)化合物。
3.如權(quán)利要求I所述的一種小鼠肝臟羧酸酯酶基因克隆表達(dá)，其特征是重組質(zhì)粒PET-32a-Mceslfο
4.如權(quán)利要求I所述的一種小鼠肝臟羧酸酯酶基因克隆表達(dá)，其特征是重組微生物是大腸桿菌BL21。
全文摘要
一種小鼠肝臟羧酸酯酶基因克隆表達(dá)，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，其表達(dá)是以小鼠肝臟總RNA為模板，通過(guò)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增了末端含有EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)的DNA片段，對(duì)其進(jìn)行了亞克隆及測(cè)序，用軟件VectorNTI對(duì)所測(cè)定序列與對(duì)應(yīng)的NCBI序列進(jìn)行比對(duì)分析，確定該基因?yàn)镸ces1f。通過(guò)EcoRI和XhoI進(jìn)行雙酶切，使Mces1f基因經(jīng)T4DNA連接酶作用連接在大腸桿菌高效表達(dá)載體酶切位點(diǎn)上構(gòu)建重組質(zhì)粒PET-32a-Mces1f。有益效果是利用本發(fā)明構(gòu)建的工程菌及其產(chǎn)生的重組酶降解環(huán)境中的農(nóng)藥殘留物，改善環(huán)境，它與其他的降解方法相比酶制作方法簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低且降解效率高。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102925468SQ20121036672
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月28日
發(fā)明者于源華, 周帥, 喬玉龍, 王保學(xué), 張昊, 姚健, 王巖, 王維, 鄔磊 申請(qǐng)人:長(zhǎng)春長(zhǎng)理康源生物技術(shù)有限公司