專利名稱：一種微生物培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，尤其涉及一種微生物培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids PUFA)是指含有兩個或兩個以上雙鍵，且碳鏈長為16 22個碳原子的直鏈脂肪酸，是細胞和有機體生物膜的重要組成成分，可調(diào)節(jié)細胞構(gòu)型、動態(tài)平衡，保持細胞膜的相對流動性，以保持細胞的正常生理功能，因此可影響細胞的化學(xué)組成、信號傳遞、免疫等功能，從而與相關(guān)疾病的發(fā)生關(guān)系重大，PUFA在人體內(nèi)具有重要的生理調(diào)節(jié)功能，包括使膽固醇酯化，降低血中膽固醇和甘油三酯，降低血液粘度，改善血液微循環(huán)，提高腦細胞的活性，增強記憶力和思維能力等。多不飽和脂肪酸主要包括二十碳五烯酸(EPA)，二十二碳六烯酸(DHA)等，DHA具有預(yù)防和治療心血管疾病、改善血液粘度和提高紅細胞變形能力、預(yù)防和治療癌癥、抗血栓、抗炎等作用，DHA是人 腦的主要組成物質(zhì)之一，對嬰兒大腦的正常發(fā)育以及成人大腦功能的正常發(fā)揮有著非常重要的作用，研究證明DHA的缺乏會導(dǎo)致大腦功能降低，因此專家建議成年人及孕婦和需要補充富含PUFA的食物，如海魚等用以適量補充，DHA是很好的醫(yī)藥和營養(yǎng)食品成分。鑒于PUFA的重要功能與作用，目前廣泛受到醫(yī)療界和食品界的關(guān)注。傳統(tǒng)制備PUFA的商業(yè)來源是從魚油中進行分離，但從魚油中提取PUFA含有強烈的魚腥味，而且資源有限，產(chǎn)量不穩(wěn)定，魚油中W-3多不飽和脂肪酸的含量因魚的種類、捕撈的季節(jié)、氣候和地點的不同而存在著差異，魚油產(chǎn)量波動很大，且純化工藝復(fù)雜，產(chǎn)品得率低，同時產(chǎn)品需求量大導(dǎo)致的某些為了商業(yè)利益而不計后果的過量捕撈行為的出現(xiàn)，給環(huán)境資源保護帶來了不利影響，因此傳統(tǒng)的魚油制備法不能滿足社會的需求。目前已發(fā)現(xiàn)可以利用微生物來生產(chǎn)PUFA，且已有諸多研究報道，特別是利用藻類發(fā)酵法生產(chǎn)DHA等多不飽和脂肪酸已成為目前學(xué)者的研究熱點，該方法不受季節(jié)、地域等條件限制，脂肪酸含量高且組分單一，大大簡化了純化工藝并降低了精制難度，培養(yǎng)條件比較容易控制，進而為控制脂質(zhì)含量和組成提供了可能，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)DHA等多不飽和脂肪酸還可以減少因市場需求而大量捕撈帶來的對環(huán)境資源的影響，對環(huán)境資源的保護也具有重要的意義。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)多不飽和脂肪酸可以實現(xiàn)對培養(yǎng)條件，如溫度、溶氧、pH等的操作控制，從而更易實現(xiàn)培養(yǎng)過程及產(chǎn)品品質(zhì)的可控性和穩(wěn)定性。在發(fā)酵過程中經(jīng)常出現(xiàn)的問題是，由于代謝產(chǎn)物的出現(xiàn)和/或某種培養(yǎng)基成分被消耗，發(fā)酵培養(yǎng)過程中PH會出現(xiàn)劇烈的波動，在這樣的情況下，而如果在微生物發(fā)酵過程中不對pH進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)控，細胞代謝速率及生長狀況就會受到影響，甚至停止生長，因此，微生物的發(fā)酵培養(yǎng)需要調(diào)節(jié)pH。目前研究成果中，微生物發(fā)酵生產(chǎn)多不飽和脂肪酸發(fā)酵過程pH調(diào)控方法普遍為采用外部設(shè)備向發(fā)酵體系中補充酸堿液來進行調(diào)節(jié)，此方法雖在一定程度上可以將發(fā)酵PH控制在恒定范圍，但也存在一定問題，例如增加發(fā)酵過程設(shè)備投入，滅菌過程及人工能耗，而最為嚴(yán)重的是增加了可能帶入其他微生物導(dǎo)致發(fā)酵過程染菌的隱患，在微生物發(fā)酵培養(yǎng)中，一旦染菌，將對產(chǎn)品穩(wěn)定生產(chǎn)造成巨大影響和經(jīng)濟損失。除了采用外部設(shè)備之外，近些年來，通過對培養(yǎng)基成分進行調(diào)整使其自身具備一定的PH調(diào)節(jié)能力也成為了微生物發(fā)酵中的對pH進行調(diào)控一個研究方向和有效手段。這些方法主要可分為以下幾類(I)在培養(yǎng)基中加入強堿弱酸鹽。CN101538592B公開了一種用寇氏隱甲藻工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法，其在培養(yǎng)基中添加谷氨酸鈉，在發(fā)酵過程中不調(diào)節(jié)pH ；CN101519676B公開了一種用寇氏隱甲藻工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法，其在培養(yǎng)基中添加谷氨酸鈉，并且在發(fā)酵過程中還補充檸檬酸以調(diào)節(jié)pH ；CN1218035C公開了一種利用海洋微藻異養(yǎng)培養(yǎng)生產(chǎn)長鏈多不飽和脂肪酸，其在培養(yǎng)基中添加谷氨酸鈉，在發(fā)酵過程中不調(diào)節(jié)pH ；CN101591617B公開了一種二十二碳六烯酸生產(chǎn)菌株及其誘變篩選方法和其應(yīng)用，其在培養(yǎng)基中添加谷氨酸鈉與碳酸氫鈉，在發(fā)酵過程中不調(diào)節(jié)pH。在這些采用培養(yǎng)基中氮源添加谷氨酸鈉等強堿弱酸鹽的方法中，強堿弱酸鹽在被細胞消耗后導(dǎo)致發(fā)酵過程 PH出現(xiàn)顯著上升，而pH過高時會嚴(yán)重影響和改變細胞代謝過程，進而導(dǎo)致發(fā)酵過程減產(chǎn)，而當(dāng)需要外部設(shè)備補充酸液調(diào)節(jié)PH時，不但增加設(shè)備投入，同時還存在染菌風(fēng)險。(2)在培養(yǎng)基中加入添加無機銨鹽等強酸弱堿鹽。CN 101528939B公開了使用改良的培養(yǎng)基從破囊壺菌目菌群生產(chǎn)ω-3脂肪酸，在發(fā)酵過程中補加氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH;CN101812484A公開了一種高密度培養(yǎng)裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法，在發(fā)酵過程中補充氨水調(diào)節(jié)pH ;Richard B. Bailey等人的一系列專利分別公開了通過在發(fā)酵罐中高密度培養(yǎng)真核微生物來增加含有多烯脂肪酸的脂質(zhì)的產(chǎn)生的方法，在發(fā)酵過程中，補充氨水調(diào)節(jié)pH。在這些采用培養(yǎng)基中氮源添加無機銨鹽等強酸弱堿鹽的方法中，強酸弱堿鹽消耗后導(dǎo)致發(fā)酵過程PH出現(xiàn)顯著下降。pH過低時將導(dǎo)致發(fā)酵體系酸敗，可嚴(yán)重影響和改變細胞代謝過程，進而導(dǎo)致發(fā)酵過程減產(chǎn)，同時強酸環(huán)境對發(fā)酵設(shè)備損害嚴(yán)重，不利于利用微生物大規(guī)模和長期穩(wěn)定生產(chǎn)不飽和脂肪酸。若在發(fā)酵過程中補加堿液或其他高PH溶液來調(diào)節(jié)，則增加了設(shè)備投入，并且存在染菌風(fēng)險。此外，CN1914327A公開了一種培養(yǎng)THRAUSTOCHYTRIALES屬微生物的方法，其采用在培養(yǎng)基中添加碳酸鈣來調(diào)控和穩(wěn)定發(fā)酵過程pH。但是由于碳酸鈣在發(fā)酵過程中形成的二氧化碳在水中只有有限的溶解度，從而導(dǎo)致該緩沖體系在發(fā)酵過程中緩沖能力的降低。因此本領(lǐng)域需要新的培養(yǎng)基方案以實現(xiàn)發(fā)酵過程中pH的高效穩(wěn)定控制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種微生物培養(yǎng)基方案，用以解決發(fā)酵培養(yǎng)過程pH升高或下降波動對細胞生長的影響，減少或消除了發(fā)酵培養(yǎng)過程通過外部設(shè)備進行酸堿調(diào)節(jié)的操作，以及由此帶來的發(fā)酵過程染菌隱患，此培養(yǎng)基方案通過營養(yǎng)物質(zhì)的組合將培養(yǎng)過程PH控制在恒定范圍內(nèi)，實現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)過程pH的簡便和高效調(diào)控，對微生物發(fā)酵生產(chǎn)不飽和脂肪酸規(guī)?；a(chǎn)意義重大。為達此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案在第一方面，本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基中包含強酸弱堿鹽與弱酸強堿鹽的組合以在發(fā)酵過程中控制PH，其中，所述強酸弱堿鹽為有機及無機強酸銨鹽，優(yōu)選地為硝酸銨或硫酸銨，氯化銨，草酸銨，更優(yōu)選地為硫酸銨，所述弱酸強堿鹽為碳酸或氨基酸的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，所述強酸弱堿鹽與弱酸強堿鹽的組合可以用于將所述培養(yǎng)基的pH控制為4. 0-9. 0，優(yōu)選地5. 0-8. 0，最優(yōu)選地6. 0-7. O。在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，所述氨基酸的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽可以是谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或蛋氨酸的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽或者其至少2種的混合物。在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，所述弱酸強堿鹽可以為谷氨酸鈉。在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，谷氨酸鈉的含量可以為l_20g/L，優(yōu)選為5_15g/L，更優(yōu)選為8-12g/L，最優(yōu)選為10g/L。
在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，硫酸銨的含量可以為O. 5_5g/L，優(yōu)選為l_4g/L，更優(yōu)選為2-3. 5g/L，最優(yōu)選為 3g/L。本發(fā)明的培養(yǎng)基還可以包含其他氮源、碳源、無機鹽和微量元素；優(yōu)選的，所述碳源為廢糖蜜、甘蔗汁、玉米粉、蔗糖、果糖、葡萄糖、可溶性淀粉、二氧化碳或其至少2種的混合物；優(yōu)選的，所述氮源為有機氮化合物、無機氮化合物或其混合物；優(yōu)選的，所述無機鹽包括鈉鹽、鎂鹽、鉀鹽、鐵鹽、鈣鹽、硫酸鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽、乙酸鹽或其至少2種的混合物；和/或，優(yōu)選的，所述微量元素包括維生素BI、維生素B6、維生素B12、維生素H、6_芐氨基腺嘌呤(6-BA)或其至少2種的混合物。在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，所述有機氮化合物包括酵母提取物、酵母膏、玉米漿、蛋白胨、氨基酸、谷氨酸鈉或其至少2種的混合物。在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，所述無機氮化合物包括尿素、亞硝酸鹽、硝酸鹽、無機銨鹽或其至少2種的混合物。本發(fā)明的培養(yǎng)基可以包含葡萄糖10_200g/L，谷氨酸鈉l_20g/L，硫酸銨O. 5_5g/L，酵母膏濃度為碳源濃度的1/2-1/10，優(yōu)選地5-20g/L，所述無機鹽，以鈉鹽為標(biāo)準(zhǔn)，
O.l_35g/L，所述微量元素中維生素BI濃度10-30ppm，維生素B6濃度5_15ppm，維生素B12濃度l-5ppm,維生素H濃度l_5ppm, 6-BA濃度3_15ppm。本發(fā)明的培養(yǎng)基的pH 可以為 4. 0,4. 5,5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. 0,8. 5 或
9.O ο本發(fā)明的培養(yǎng)基中谷氨酸鈉含量可以為lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、llg/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L 或 20g/L0本發(fā)明的培養(yǎng)基中硫酸銨的含量可以為O. 5g/L、l. Og/LU. 5g/L、2. 0g/L、2. 5g/L、
3.0g/L、3. 5g/L、4. 0g/L、4. 5g/L 或 5. Og/L。本發(fā)明的培養(yǎng)基中葡萄糖的含量可以為10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、I10g/L、120g/L、130g/L、140g/L、150g/L、160g/L、170g/L、180g/L、190g/L 或 200g/L。本發(fā)明的培養(yǎng)基中酵母膏的含量可以為lg/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、95g/L 或 100g/L。本發(fā)明的培養(yǎng)基中無機鹽的含量(以鈉鹽為標(biāo)準(zhǔn))可以為O. lg/L,O. 5g/L、lg/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L 或 35g/L。本發(fā)明的培養(yǎng)基中維生素BI的濃度可以為lOppm、15ppm、20ppm、25ppm、或30ppm。本發(fā)明的培養(yǎng)基中維生素B6的濃度可以為5ppm、8ppm、lOppm、12ppm、或15ppm。本發(fā)明的培養(yǎng)基中維生素B12的濃度可以為lppm、2ppm、3ppm、4ppm、*5ppm。本發(fā)明的培養(yǎng)基中維生素H的濃度可以為lppm、2ppm、3ppm、4ppm、*5ppm。本發(fā)明的培養(yǎng)基中維生素6-BA的濃度可以為3ppm、6ppm、9ppm、12ppm、或15ppm。 在另一個方面,本發(fā)明提供了一種在微生物的培養(yǎng)方法,所述方法包括在發(fā)酵過程中采用如第一方面所述的培養(yǎng)基。在本發(fā)明的培養(yǎng)方法中，所述微生物為微藻。本發(fā)明的培養(yǎng)方法可包括在搖瓶預(yù)培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)和/或三級發(fā)酵培養(yǎng)中采用第一方面所述的培養(yǎng)基。本發(fā)明的培養(yǎng)方法可包括a)活化培養(yǎng)，將藻種采用斜面或平板劃線，于25°C恒溫培養(yǎng)3_5天，挑取形態(tài)飽滿、生長旺盛的藻落，再次進行斜面或平板劃線，于25°C恒溫培養(yǎng)3-5天；b)搖瓶預(yù)培養(yǎng)，挑取活化的藻落接種于潔凈搖瓶中，25°C，150_300rpm，優(yōu)選150-250rpm,最優(yōu)選200rpm下振蕩培養(yǎng)；c)發(fā)酵放大培養(yǎng)，其中將搖瓶預(yù)培養(yǎng)獲得的藻種接入一級種子罐，接種量2%_10%，優(yōu)選4%-8%，最優(yōu)選6%，通入無菌空氣并攪拌，通氣量O. 4-1. Ovvm,優(yōu)選O. 5-0. 8vvm,最優(yōu)選
O.7vvm,攪拌速度100-300rpm，優(yōu)選150_250rpm，最優(yōu)選200rpm，控制培養(yǎng)溫度在24_28°C，優(yōu)選25-27°C，最優(yōu)選26°C，進行一級種子培養(yǎng)；將一級種子罐內(nèi)發(fā)酵種子液接種至二級種子罐，接種量5%-15%，優(yōu)選7%-13%，最優(yōu)選10%，通入無菌空氣并攪拌，通氣量O. 4-1. Ovvm,優(yōu)選 O. 5-0. 8vvm,最優(yōu)選 O. 7vvm,攪拌速度 100-300rpm,優(yōu)選 150-250rpm,最優(yōu)選 200rpm,控制培養(yǎng)溫度在24-28°C，優(yōu)選25-27°C，最優(yōu)選25°C，進行二級種子培養(yǎng)；將二級種子罐內(nèi)發(fā)酵種子液接種三級發(fā)酵罐內(nèi)進行發(fā)酵培養(yǎng)，接種量優(yōu)選7%-13%，最優(yōu)選10%，過程中連續(xù)通加無菌空氣，通氣量O. 4-1. Ovvm,通氣量O. 4-1. Ovvm,優(yōu)選O. 5-0. 8vvm,最優(yōu)選O. 7vvm,攪拌速度100-200rpm，優(yōu)選120_180rpm，最優(yōu)選150rpm，控制培養(yǎng)溫度在24-28 °C，優(yōu)選25-27 0C，最優(yōu)選26 °C，進行發(fā)酵培養(yǎng)；其中步驟b)和c)中所采用的培養(yǎng)基均為如第一方面所述的培養(yǎng)基。本發(fā)明的有益效果( I)本發(fā)明通過發(fā)酵培養(yǎng)基組成設(shè)計，采用營養(yǎng)成分組合來高效控制發(fā)酵過程pH波動，使PH控制在恒定且適宜范圍內(nèi)，減少或減除了通過外部設(shè)備補充酸堿來調(diào)節(jié)發(fā)酵PH的操作步驟，以及由此帶來的染菌隱患，大大提高發(fā)酵過程可控性和穩(wěn)定性；(2)本發(fā)明的方法采用的銨鹽可以作為氮源替代部分酵母膏，實現(xiàn)高價氮源的減量，可大大降低培養(yǎng)基成本。


圖I是本發(fā)明的培養(yǎng)方法的流程示意圖。
具體實施例方式下面通過具體實施方式
來進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。實施例I采用本發(fā)明的培養(yǎng)基(具體成分見表1)，按照下列步驟進行藻種的500L、6立方、60立方三級放大培養(yǎng),藻種屬于海洋破囊壺菌(Thraustochytrids)類首先，對藻種進行活化，采用斜面或平板劃線，于25°C恒溫培養(yǎng)3-5天，挑取形態(tài)飽滿、生長旺盛的藻落，再次進行斜面或平板劃線，于25°C恒溫培養(yǎng)3-5天后作為搖瓶預(yù)培養(yǎng)藻種，保存方法采用低溫冷凍。其次，搖瓶預(yù)培養(yǎng)，挑取藻落接種于含有無菌的上述培養(yǎng)基的潔凈搖瓶中，25°C， 150-300rpm下振蕩培養(yǎng)，此步驟可包括2_3級體積放大預(yù)培養(yǎng)，完成種子預(yù)培養(yǎng)后，將搖瓶種子合并至無菌容器內(nèi)，此步驟為種子預(yù)培養(yǎng)階段。再次是發(fā)酵放大培養(yǎng)，包括一級、二級與三級放大發(fā)酵培養(yǎng)，將搖瓶種子接種采用火焰或壓差接種法接入一級種子罐，接種量2%-10%，通入無菌空氣并攪拌，通氣量
O.4-1. Ovvm, 100-300rpm,控制培養(yǎng)溫度在24-28 °C，最優(yōu)25 °C，進行一級種子培養(yǎng)。一級種子培養(yǎng)至一定階段后將一級種子罐內(nèi)發(fā)酵種子液采用壓差法接種至含有上述無菌培養(yǎng)基的二級種子罐，接種量5%-15%，二級種子罐完成接種后，通入無菌空氣并攪拌,通氣量O. 4-1. Ovvm, 100-300rpm，控制培養(yǎng)溫度在24-28°C，最優(yōu)25°C，進行二級種子培養(yǎng)。二級種子培養(yǎng)至一定階段后將二級種子罐內(nèi)發(fā)酵種子液采用壓差法接種至含有上述無菌培養(yǎng)基的三級發(fā)酵罐內(nèi)進行發(fā)酵培養(yǎng)，接種量5-15%，過程中連續(xù)通加無菌空氣，通氣量
O.4-1. Ovvm, 100-200rpm,控制培養(yǎng)溫度在24_28°C，最優(yōu)25°C，進行發(fā)酵培養(yǎng)。最后，當(dāng)細胞干重增加至平臺期或細胞不適宜繼續(xù)培養(yǎng)等情況出現(xiàn)時，停止發(fā)酵培養(yǎng)，放罐，將發(fā)酵液儲存于儲藏罐內(nèi)，通入離心機進行發(fā)酵液濃縮收集，獲得濃縮液后，通入噴霧干燥塔內(nèi)獲得產(chǎn)品。二者在細胞代謝過程中被消耗，對發(fā)酵pH產(chǎn)生升高和降低的影響，作用相互抵消，實現(xiàn)發(fā)酵過程PH的穩(wěn)定和高效控制。表I:培養(yǎng)基組成
組分含量(g/L) 組分含量(ppm)
葡萄糖30維生素BI30
酵母膏15B65
谷氨酸納 B12
硫酸銨維生素H I
氯化納12^rBA權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基中包含強酸弱堿鹽與弱酸強堿鹽的組合，其中，所述強酸弱堿鹽為有機及無機強酸銨鹽，優(yōu)選地為硝酸銨、硫酸銨，氯化銨、草酸銨或其中至少兩種的混合物，更優(yōu)選地為硫酸銨，所述弱酸強堿鹽為碳酸或氨基酸的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽或其中至少兩種的混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述強酸弱堿鹽與弱酸強堿鹽的組合將所述培養(yǎng)基的PH控制為4. 0-9. 0，優(yōu)選地5. 0-8. O，最優(yōu)選地6. 0-7. O。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述氨基酸的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽為谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或蛋氨酸的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽或者其至少2種的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述弱酸強堿鹽為谷氨酸鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基中谷氨酸鈉的含量為l-20g/L，優(yōu)選為5-15g/L，更優(yōu)選為8-12g/L，最優(yōu)選為10g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的培養(yǎng)基，其特征在于，硫酸銨的含量為O.5-5g/L，優(yōu)選為l_4g/L，更優(yōu)選為2-3. 5g/L，最優(yōu)選為3g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基中還包含其他氮源、碳源、無機鹽和微量元素； 優(yōu)選的，所述碳源為廢糖蜜、甘蔗汁、玉米粉、蔗糖、果糖、葡萄糖、可溶性淀粉、二氧化碳或其至少2種的混合物； 優(yōu)選的，所述氮源為有機氮化合物、無機氮化合物或其混合物； 優(yōu)選的，所述無機鹽包括鈉鹽、鎂鹽、鉀鹽、鐵鹽、鈣鹽、硫酸鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽、乙酸鹽或其至少2種的混合物；和/或， 優(yōu)選的，所述微量元素包括維生素BI、維生素B6、維生素B12、維生素H、6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)或其至少2種的混合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述有機氮化合物包括酵母提取物、酵母膏、玉米漿、蛋白胨、氨基酸、谷氨酸鈉或其至少2種的混合物；和/或， 所述無機氮化合物包括尿素、亞硝酸鹽、硝酸鹽、無機銨鹽或其至少2種的混合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基包含葡萄糖10-200g/L，谷氨酸鈉l_20g/L，硫酸銨O. 5-5g/L，酵母膏濃度為碳源濃度的1/2-1/10，所述無機鹽，以鈉鹽為標(biāo)準(zhǔn)，O. l_35g/L，所述微量元素中維生素BI濃度10-30ppm，維生素B6濃度5_15ppm，維生素B12濃度l_5ppm,維生素H濃度l_5ppm, 6-BA濃度3_15ppm。
10.一種微生物的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述方法包括在發(fā)酵過程中采用如權(quán)利要求1-9中任一項所述的培養(yǎng)基。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述微生物為微藻。
12.如權(quán)利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述方法包括在搖瓶預(yù)培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)和/或三級發(fā)酵培養(yǎng)中采用如權(quán)利要求1-9中任一項所述的培養(yǎng)基。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，所述方法包括 a)活化培養(yǎng)，將藻種采用斜面或平板劃線，于25°C恒溫培養(yǎng)3-5天，挑取形態(tài)飽滿、生長旺盛的藻落，再次進行斜面或平板劃線，于25°C恒溫培養(yǎng)3-5天；b)搖瓶預(yù)培養(yǎng)，挑取活化的藻落接種于潔凈搖瓶中，25°C，150-300rpm,優(yōu)選150-250rpm,最優(yōu)選200rpm下振蕩培養(yǎng)； c)發(fā)酵放大培養(yǎng)，其中將搖瓶預(yù)培養(yǎng)獲得的藻種接入一級種子罐，接種量2%-10%，優(yōu)選4%-8%，最優(yōu)選6%，通入無菌空氣并攪拌，通氣量O. 4-1. Ovvm,優(yōu)選O. 5-0. 8vvm,最優(yōu)選O. 7vvm,攪拌速度100-300rpm，優(yōu)選150_250rpm，最優(yōu)選200rpm，控制培養(yǎng)溫度在24_28°C，優(yōu)選25-27°C，最優(yōu)選26°C，進行一級種子培養(yǎng)；將一級種子罐內(nèi)發(fā)酵種子液接種至二級種子罐，接種量5%-15%，優(yōu)選7%-13%，最優(yōu)選10%，通入無菌空氣并攪拌，通氣量O. 4-1. Ovvm,優(yōu)選 O. 5-0. 8vvm,最優(yōu)選 O. 7vvm,攪拌速度 100-300rpm,優(yōu)選 150-250rpm,最優(yōu)選 200rpm,控制培養(yǎng)溫度在24-28°C，優(yōu)選25-27°C，最優(yōu)選25°C，進行二級種子培養(yǎng)；將二級種子罐內(nèi)發(fā)酵種子液接種三級發(fā)酵罐內(nèi)進行發(fā)酵培養(yǎng)，接種量優(yōu)選7%-13%，最優(yōu)選10%，過程中連續(xù)通加無菌空氣，通氣量O. 4-1. Ovvm,通氣量O. 4-1. Ovvm,優(yōu)選O. 5-0. 8vvm,最優(yōu)選O. 7vvm,攪拌速度100-200rpm，優(yōu)選120_180rpm，最優(yōu)選150rpm，控制培養(yǎng)溫度在24-28 °C，優(yōu)選25-27 0C，最優(yōu)選26 °C，進行發(fā)酵培養(yǎng)； 其中步驟b)和c)中所采用的培養(yǎng)基均為如權(quán)利要求1-9中任一項所述的培養(yǎng)基?！?br> 全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。所述培養(yǎng)基包含強酸弱堿鹽與弱酸強堿鹽的組合，從而使其自身具有了一定的pH調(diào)控能力，可以在培養(yǎng)過程中將pH控制在恒定且適宜范圍內(nèi)，減少或減除了通過外部設(shè)備補充酸堿來調(diào)節(jié)發(fā)酵pH的操作步驟，以及由此帶來的染菌隱患，大大提高發(fā)酵過程可控性和穩(wěn)定性；同時作為強酸弱堿鹽的銨鹽可以作為氮源替代部分酵母膏，實現(xiàn)高價氮源的減量，可大大降低培養(yǎng)基成本。
文檔編號C12N1/12GK102911868SQ20121036978
公開日2013年2月6日 申請日期2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月28日
發(fā)明者劉敏勝, 馮倩, 蔡忠貞, 王琳 申請人:新奧科技發(fā)展有限公司