專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)m BCR融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域的熒光定量PCR技術(shù)，具體涉及一種檢測(cè)m BCR融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒。
背景技術(shù)：
急性淋巴細(xì)胞性白血病(Acute lymphoblastic leukemia, ALL)是一種淋巴細(xì)胞系造血干細(xì)胞增殖異常的惡性疾病。在ALL中，Ph染色體可在20°/Γ40%成年患者和2 5%兒童患者中被檢測(cè)到，該染色體是由9號(hào)染色體ABL基因5’端和22號(hào)染色體BCR基因3’端相互易位后融合形成。ALL患者BCR基因中的斷裂點(diǎn)主要集中于BCR基因5’端上游約30kb處，即第一內(nèi)含子3’端序列上，這一區(qū)域確定為兩個(gè)片段一bcr2和bcr3，統(tǒng)稱(chēng)為mBCR融合基因，融合方式為ela2連接，轉(zhuǎn)錄成7. 5kb或7. Okb的mRNA，翻譯成一種嵌合蛋白 P190。該蛋白具有較高的酪氨酸蛋白激酶活性，可以使一系列底物蛋白發(fā)生磷酸化后激活多條信號(hào)傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致細(xì)胞在無(wú)細(xì)胞因子的情況下發(fā)生過(guò)度增殖、分化和凋亡異常。ALL患者在急性起病初期，體內(nèi)白血病細(xì)胞總數(shù)可達(dá)IO12以上，化療后大部分成年患者可得到完全緩解，但在緩解初期，骨髓及外周血中均探查不到明顯白細(xì)胞的存在，此時(shí)體內(nèi)白血病細(xì)胞總數(shù)仍有IO7 IO9個(gè)，我們將其稱(chēng)為MRD (Minimal Residual Desease，微小殘留病灶)。若這些MRD不能被完全清除，最終將導(dǎo)致白血病的復(fù)發(fā)，這也是白血病復(fù)發(fā)的根源。因此，MRD水平是判斷治療效果的關(guān)鍵指標(biāo)，該指標(biāo)的升高可作為提前預(yù)示惡性血液疾病的全面復(fù)發(fā)。過(guò)去，對(duì)ALL患者的診斷完全依賴(lài)于形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，但由于細(xì)胞涂片和染色技術(shù)的優(yōu)劣會(huì)直接影響對(duì)其形態(tài)的觀察，觀察時(shí)使用鏡頭倍率對(duì)細(xì)胞形態(tài)的判斷也存在很大影響，而且檢驗(yàn)人員的水平受限于經(jīng)驗(yàn)，不可能對(duì)正常和異常細(xì)胞作出完全準(zhǔn)確的判斷，這不可避免的造成了實(shí)驗(yàn)室漏檢、誤檢，因此近來(lái)已逐漸演變?yōu)橐揽糠肿铀椒椒▽W(xué)技術(shù)作出判斷。雖然采用RT-PCR (Real Time PCR，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))檢測(cè)m BCR融合基因能更靈敏、更特異地輔助我們做出判斷，但是目前尚未有關(guān)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)m BCR融合基因的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)m BCR融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒。所述技術(shù)方案如下本發(fā)明實(shí)施例提供了一種檢測(cè)m BCR融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒，包括檢測(cè)用引物、熒光探針、cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，所述檢測(cè)用引物、熒光探針包括m BCR融合基因引物、內(nèi)參基因ABL引物及Taqman熒光探針，其中m BCR融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示；m BCR融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:2所示；
m BCR融合基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO: 3所示；ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所示；ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:5所不；ABL基因Taqman突光探針如序列表中SEQ ID NO:6所示；所述cDNA第一鏈合成試劑含有MgCl2、逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑、Oligo (dT) 15、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和無(wú)RNase去離子水；所述熒光定量PCR混合液含有PCR預(yù)混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和無(wú) RNase 去離子水。進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括內(nèi)部陽(yáng)性控制序列、內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的引物和Taqman熒光探針，其中內(nèi)部陽(yáng)性控制序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示；內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的下游引物如序列表中SEQIDNO:9所示；內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的Taqman突光探針如序列表中SEQ ID NO: 10所示。 進(jìn)一步地，所述m BCR融合基因的Taqman熒光探針和ABL基因的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)TET，3’端連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。具體地，所述內(nèi)參基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示。具體地，所述陰性對(duì)照為去離子水；所述陽(yáng)性對(duì)照為含有m BCR融合基因的總RNA樣品。具體地，所述cDNA第一鏈合成試劑為25mmol/L MgCl24yL, IOX逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液2μ L, IOmmoI/L dNTP2 μ L，RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L，Oligo (dT) 150· 5 μ g，AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 I. 5U 和無(wú)RNase去離子水,總體積11 μ L。具體地，所述熒光定量PCR的混合液(以反應(yīng)體系終濃度表示)為1Χ的PCR預(yù)混合液(原液為 2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、
O.2U/ μ L的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶以及無(wú)RNase去離子水。本發(fā)明試劑盒的優(yōu)點(diǎn)和效果如下(I)敏感性高可重復(fù)敏感度為O. 01%，即10000個(gè)細(xì)胞中有一個(gè)含m BCR融合基因就可以被檢測(cè)出。(2)特異性強(qiáng)使用特異性探針對(duì)定量分子進(jìn)行識(shí)別，準(zhǔn)確性高，同時(shí)，靶序列由引物和探針雙重控制，特異性好且假陽(yáng)性低。(3)簡(jiǎn)便安全操作簡(jiǎn)單、安全、自動(dòng)化程度高而且防止污染。擴(kuò)增和檢測(cè)可以在同一管內(nèi)檢測(cè)，不需要開(kāi)蓋，不易被污染，同時(shí)擴(kuò)增和檢測(cè)一步完成，不需要后期處理，無(wú)需要擔(dān)心放射性污染。(4)全程監(jiān)控本發(fā)明實(shí)施例提供的試劑盒引入了內(nèi)部陽(yáng)性控制質(zhì)量控制體系，對(duì)檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行全程質(zhì)量監(jiān)控，有效避免假陽(yáng)性或者假陰性。(5)快速速度快并且高通量，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)可在3-4小時(shí)完成。本發(fā)明的試劑盒能快速、準(zhǔn)確的定量檢測(cè)m BCR融合基因mRNA水平，有效杜絕了假陽(yáng)性和假陰性的發(fā)生，用于急性淋巴細(xì)胞性白血病的診斷及治療過(guò)程中微小殘留病的監(jiān)測(cè)，為急性淋巴細(xì)胞性白血病的診斷、制定治療方案及療效評(píng)價(jià)和預(yù)后提供了重要的檢測(cè)手段。


為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖IA是本發(fā)明實(shí)施例2提供的試劑盒的熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增I. OxlO6-L OxlO3拷貝的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品的熒光曲線圖；圖IB是由本發(fā)明實(shí)施例2提供的試劑盒的熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增I. OxlO6-L OxlO3拷貝的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品的熒光曲線圖得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖2A是本發(fā)明實(shí)施例2提供的試劑盒的熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增I. OxlO6-L OxlO3拷貝的ABL標(biāo)準(zhǔn)品的熒光曲線圖； 圖2B是由本發(fā)明實(shí)施例2提供的試劑盒的熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增
I.OxlO6-L OxlO3拷貝的ABL標(biāo)準(zhǔn)品熒光曲線圖得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。實(shí)施例I.本發(fā)明試劑盒的制備I、特異性的引物和熒光探針的設(shè)計(jì)根據(jù)基因序列(ABL基因序列、BCR基因序列來(lái)源于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心核酸數(shù)據(jù)庫(kù)，其中ABL基因ID分別為25，參考序列號(hào)為NM005157. 4 ;BCR基因ID分別為613，參考序列號(hào)為NG009244. I)分別設(shè)計(jì)對(duì)上述各基因序列特異的引物和熒光探針。2、按照下列試劑盒的組成配制試劑盒的各組分本發(fā)明試劑盒組成如下①RNA 提取試劑Trizol 試劑(Invitrogen 公司，產(chǎn)品貨號(hào)15596_026/100ml)，每Iml骨髓組織加入ImlTrizol快速提取白血病患者骨髓組織RNA。②cDNA 第一鏈合成試劑盒(RT-PCR)(Fermentas 公司，產(chǎn)品貨號(hào)K1622):25mmol/LMgCl24 μ L，IOX 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2 μ L，IOmmoI/L dNTP2 μ L, RNA 酶抑制劑(RNasin，一種酸性糖蛋白)O. 5 μ L, Oligo (dT) 150. 5 μ g, AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U和無(wú)RNase去離子水,總體積11 μ Lo③引物、探針和標(biāo)準(zhǔn)品包括m BCR融合基因引物、內(nèi)部陽(yáng)性控制序列引物、內(nèi)參基因ABL引物以及與引物對(duì)應(yīng)的Taqman熒光探針，具體如下m BCR融合基因上游引物序列為5’ -CGCAAGACCGGGCAGAT-3’(序列表中序列I)；mBCR融合基因下游引物序列為5’ -AACGAGCGGCTTCACTCAGA-3’(序列表中序列2)；m BCR 融合基因 Taqman 熒光探針FAM5’ -ACGATGGCGAGGGC-TAMRA3’ TAMRA (序列表中序列3)；內(nèi)部陽(yáng)性控制序列為5’ -CGCAAGACCGGGGACAUCUGGCCCAACGAUGCGGAGGGCGCCUUCCAUGGAGACGCAGAAGCCCUUCAGCGGCCAGUAGCAUCUGACUUUGAGCCUCAGG ⑶⑶ CA ⑶ GAAGCCGCUC ⑶ U-3’(序列表中序列7)；內(nèi)部陽(yáng)性控制序列上游引物序列為5’ -CGCAAGACCGGGGACAT-3’(序列表中序列8)；內(nèi)部陽(yáng)性控制序列下游引物序列為5’ -AACGAGCGGCTTCACTGACA-3’(序列表中序列9)；內(nèi)部陽(yáng)性控制序列Taqman熒光探針TET5’ -ACGATGCGGAGGGC-3’ TAMRA (序列表中序列10)；ABL 基因序列為5，-CAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGGAGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCC CGCAATGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGGC-3’(序列表中序列11);ABL基因上游引物序列為5’ -CCGGGTCTTAGGCTATAATCACA-3，(序列表中序列4)；ABL基因下游引物序列為5’ -GCCTTGGCCATTTTTGGTT-3’(序列表中序列5)；ABL 基因 Taqman 熒光探針FAM5’ -TGGTGTGAAGCCC-3’ TAMRA (序列表中序列 6)；其中，內(nèi)部陽(yáng)性控制序列為人工合成序列，包含一部分已知的mBCR融合基因序列和一部分人工合成序列；內(nèi)部陽(yáng)性控制序列和ABL基因序列分別用作標(biāo)準(zhǔn)品。上述引物序列、控制序列、基因序列和Taqman熒光探針序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。④陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照以去離子水為陰性對(duì)照，以含有mBCR融合基因的總RNA樣品為陽(yáng)性對(duì)照，采用上述實(shí)施例I中提供的本發(fā)明試劑盒組成①RNA提取試劑=Trizol試劑(Invitrogen公司，產(chǎn)品貨號(hào)15596-026/100ml),按每Iml骨髓組織加入Iml Trizol試劑的比例，快速提取已經(jīng)確診的含有m BCR融合基因的急性淋巴細(xì)胞性白血病患者的骨髓組織RNA，作為陽(yáng)性對(duì)照。⑤m BCR融合基因熒光定量PCR反應(yīng)液由熒光定量PCR混合液和檢測(cè)m BCR融合基因的引物、探針組成I X的PCR預(yù)混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號(hào)210212，2 XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/μ L的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/μ L的m BCR融合基因上游引物(序列表中序列1)、0· 25pmol/y L的m BCR融合基因下游引物(序列表中序列2)、0· 3pmol/y L的m BCR融合基因Taqman熒光探針(序列表中序列3)、0. 25pmol/yL的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列上游引物(序列表中序列8)、0. 25pmol/yL的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列下游引物(序列表中序列9)、O. 3pmol/yL的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列10)(以上所有的濃度都是指PCR反應(yīng)體系的終濃度)。通常取1-2 μ L的模板(包括被測(cè)樣品RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA和內(nèi)部陽(yáng)性控制序列RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA)，其余為無(wú)RNase去離子水，反應(yīng)總體積通常為20 μ L0⑥ABL內(nèi)參基因熒光定量PCR反應(yīng)液由熒光定量PCR混合液和檢測(cè)ABL內(nèi)參基因的引物、探針組成=IX的PCR預(yù)混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號(hào)210212, 2XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/μ L 的 Taq 酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/y L的ABL內(nèi)參基因上游引物(序列表中序列4)、O. 25pmol/ μ L的ABL內(nèi)參基因下游引物(序列表中序列5)、0· 3pmol/ μ L的ABL基因Taqman熒光探針(序列表中序列6)(以上所有的濃度都是指PCR反應(yīng)體系的終濃度)。檢測(cè)時(shí)，力口入ABL基因標(biāo)準(zhǔn)品模板2 μ L,其余為無(wú)RNase去離子水,反應(yīng)總體積通常為20 μ L。⑦內(nèi)部陽(yáng)性控制序列熒光定量PCR反應(yīng)液由熒光定量PCR混合液和檢測(cè)內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的引物、探針組成ix的PCR預(yù)混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號(hào)=210212,2 XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/yL的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列上游引物(序列表中序列8)、0· 25pmol/yL的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列下游引物(序列表中序列9)、0· 3pmol/yL的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列10)(以上所有的濃度都是指PCR反應(yīng)體系的終濃度)。檢測(cè)時(shí)，通常取1-2 μ L的模板(內(nèi)部陽(yáng)性控制序列RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA)，其余為無(wú)RNase去離子水,反應(yīng)總體積通常為20 μ L。3、PCR擴(kuò)增程序的設(shè)定在Iightcycler儀器上先經(jīng)過(guò)50°C 10s, 95°C IOmin,然后再經(jīng)過(guò)95°C 15s，60°C lmin，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)施例2.用實(shí)施例I制備的試劑盒檢測(cè)m BCR融合基因mRNA的表達(dá)量以檢測(cè)30例急性淋巴細(xì)胞性白血病患者骨髓組織標(biāo)本結(jié)果為例。用實(shí)施例I提供的本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)m BCR融合基因mRNA表達(dá)量的檢測(cè)流程為首先根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性的引物和熒光探針。其次獲取臨床白血病患者骨髓組織樣本，快速提取組織RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR合成cDNA第一鏈；先配制ABL內(nèi)參基因和內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的熒光定量PCR反應(yīng)液，將內(nèi)部陽(yáng)性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品和ABL標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至拷貝數(shù)/mL為I. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和I. OxlO6，分別制作內(nèi)部陽(yáng)性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖IA和圖IB所不)和ABL基因標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖2A和圖2B所不)，然后再配制m BCR融合基因熒光定量PCR反應(yīng)液，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)樣品，在熒光定量PCR儀數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)中讀出CT值結(jié)果。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，首先分析內(nèi)部陽(yáng)性控制序列擴(kuò)增結(jié)果，如果其Ct值小于33，提示整個(gè)檢測(cè)過(guò)程有效，如果其Ct值大于35，提示檢測(cè)失敗，則需要重新進(jìn)行檢測(cè)，如果其Ct值位于33 35之間，需要重復(fù)檢測(cè)。當(dāng)內(nèi)部陽(yáng)性控制序列Ct值小于33時(shí)，將實(shí)時(shí)熒光定量PCR所得數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，分別計(jì)算m BCR融合基因及ABL基因的Ct值，兩者之差即為ACt值。最后，熒光定量PCR結(jié)果采用軟件分析，并標(biāo)化計(jì)算樣本數(shù)據(jù)。具體步驟如下·
①急性淋巴細(xì)胞性白血病骨髓組織總RNA的抽提按RNA抽提純化的方法抽提急性淋巴細(xì)胞性白血病骨髓組織樣品的總RNA。提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm與280nm光密度值計(jì)算RNA的純度與濃度，用O. 1% DEPC處理的水調(diào)節(jié)抽提的各樣品RNA至相同濃度。②反轉(zhuǎn)錄合成cDNA :取2 μ L上述RNA提取液，在70°C保溫lOmin，隨后加入實(shí)施例I提供的本發(fā)明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/L MgCl24yL, IOX逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2 μ L，IOmmoI/L dNTPs2 μ L, RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L, Oligo (dT) 150· 5 μ g 和 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U,補(bǔ)加無(wú)RNase去離子水至總體積20 μ L,于42°C保溫15min,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA第一鏈。反應(yīng)結(jié)束后，加熱至99°C，5min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，加20 μ L無(wú)菌水混勻置冰箱_20°C保存。
取I μ L濃度為2 μ g/ml內(nèi)部陽(yáng)性控制序列RNA(序列表中序列7)，在70°C保溫IOmin,隨后加入實(shí)施例I提供的本發(fā)明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/L MgCl24y L，IOX 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2μ L，10mmol/L dNTPs2 μ L，RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L，Oligo (dT) 150· 5 μ g和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U，補(bǔ)加無(wú)RNase去離子水至總體積20 μ L，于42°C保溫15min,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),合成cDNA。反應(yīng)結(jié)束后,加熱至99°C, 5min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，加20 μ L無(wú)菌水混勻置冰箱_20°C保存。取I μ L濃度為2 μ g/ml的陽(yáng)性對(duì)照RNA，在70°C保溫lOmin，隨后加入實(shí)施例I提供的本發(fā)明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/L MgCl24 μ L, 10 X逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2 μ L，IOmmoI/L dNTPs2 μ L, RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L, Oligo (dT) 150· 5 μ g 和 AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U,補(bǔ)加無(wú)RNase去離子水至總體積20 μ L,于42°C保溫15min,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),合成cDNA。反應(yīng)結(jié)束后，加熱至99°C，5min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，加20 μ L無(wú)菌水混勻置冰箱_20°C保存。③將內(nèi)部陽(yáng)性控制基因序列標(biāo)準(zhǔn)品和ABL標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至拷貝數(shù)/mL為I. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和l.OxlO6，用實(shí)施例I提供的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列和ABL內(nèi)參基·因的熒光定量PCR反應(yīng)液，分別制作內(nèi)部陽(yáng)性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖IA和圖IB所示)和ABL標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖2A和圖2B所示)。④m BCR融合基因熒光定量PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為20 μ L :含I X PCR預(yù)混合液(Qiagen 公司，產(chǎn)品貨號(hào):210212, 2 XPCR Premix) 10. O μ L, 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，m BCR融合基因上、下游引物終濃度均為0.2 μ mol/L，m BCR融合基因Taqman熒光探針終濃度0. 3ymol/L，被測(cè)樣品RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNAl. 0μ L，同時(shí)加入內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的引物終濃度為0. 2 μ mol/L,內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的Taqman熒光探針終濃度0. 3 μ mol/L,終濃度為0. 2ymol/L的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA (②中反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA)，加入超純水至總體積20 μ L。在Iightcycler熒光定量PCR儀上反應(yīng)擴(kuò)增條件95°C IOmin預(yù)變性，然后95°C 15s,60°C Imin擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增過(guò)程中儀器自動(dòng)收集熒光信號(hào)。⑤ABL內(nèi)參基因熒光定量PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為20 μ L :含2XPCR混合液(Qiagen 公司，產(chǎn)品貨號(hào):210212, 2XPCR Premix) 10. O μ L, 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，ABL 基因上、下游引物終濃度均為0. 2 μ mol/L, ABL基因的Taqman熒光探針終濃度0. 2 μ mol/L, ABL基因cDNAl. O μ L,加入無(wú)RNase去離子水補(bǔ)至總體積20 μ L。在Iightcycler突光定量PCR儀上反應(yīng)擴(kuò)增條件為95°C IOmin預(yù)變性，然后95°C 15s, 60°C Imin擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增過(guò)程中儀器自動(dòng)收集熒光信號(hào)。⑥陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照熒光定量PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為20 μ L :含2XPCR混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號(hào):210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，m BCR融合基因上、下游引物終濃度均為0.2 μ mol/L，m BCR融合基因Taqman熒光探針終濃度0. 3 μ mol/L,陽(yáng)性對(duì)照RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNAl. OyL或者陰性對(duì)照去離子水I. O μ L，加入無(wú)RNase去離子水補(bǔ)至總體積20 μ L。在Iightcycler熒光定量PCR儀上反應(yīng)擴(kuò)增條件為95°C IOmin預(yù)變性，然后95°C 15s，60°C Imin擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增過(guò)程中儀器自動(dòng)收集突光信號(hào)。⑦數(shù)據(jù)收集處理和分析PCR擴(kuò)增結(jié)束后，首先分析內(nèi)部陽(yáng)性控制序列擴(kuò)增結(jié)果，如果其Ct值小于33，提示整個(gè)檢測(cè)過(guò)程有效，如果其Ct值大于35，則需要重新進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)內(nèi)部陽(yáng)性控制序列Ct值小于33時(shí)，將實(shí)時(shí)熒光定量PCR所得數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，得出m BCR融合基因相對(duì)于ABL內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以比值大于或等于O. 0001為陽(yáng)性表達(dá)，小于O. 0001為陰性表達(dá)(具體參見(jiàn)表I)表I為熒光定量PCR分析m BCR融合基因在急性淋巴細(xì)胞性白血病患者骨髓中的表達(dá)

樣品m BCR模板ABL模板m BCR/ABL
急性淋巴細(xì)胞性白血病 77589913188234770.02434
急性淋巴細(xì)胞性白血病 77182841515002300.05095
急性淋巴細(xì)胞性白血病 9127882785574990.00328
急性淋巴細(xì)胞性白血病 280222781246650.00010
急性淋巴細(xì)胞性白血病 5512432167557740.00254
急性淋巴細(xì)胞性白血病 277483166570720.00009
急性淋巴細(xì)胞性白血病 670133126655020.00021
急性淋巴細(xì)胞性白血病 145512172547520.00007
急性淋巴細(xì)胞性白血病 917243317255480.00028
急性淋巴細(xì)胞性白血病 6125413132543640.00196
急性淋巴細(xì)胞性白血病 1525142447182750.00062
急性淋巴細(xì)胞性白血病 71954623017276410.02385
急性淋巴細(xì)胞性白血病 66127452124856130.03112
急性淋巴細(xì)胞性白血病 126648613018285910.04196
急性淋巴細(xì)胞性白血病 2646613018577800.00088
急性淋巴細(xì)胞性白血病 277126353077641860.09005
急性淋巴細(xì)胞性白血病 1273562081775830.0006權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)m BCR融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒，包括檢測(cè)用引物、熒光探針、cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，其特征在于，所述檢測(cè)用引物、熒光探針包括m BCR融合基因引物、內(nèi)參基因ABL引物及Taqman熒光探針，其中 m BCR融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示； m BCR融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:2所示； m BCR融合基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO: 3所示； ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所不； ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 5所不； ABL基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:6所示； 所述cDNA第一鏈合成試劑含有MgCl2、逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑、Oligo (dT) 15、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和無(wú)RNase去離子水；所述熒光定量PCR混合液含有PCR預(yù)混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和無(wú) RNase 去離子水。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括內(nèi)部陽(yáng)性控制序列、內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的引物和Taqman熒光探針，其中內(nèi)部陽(yáng)性控制序列如序列表中SEQ IDN0:7所示；內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID N0:9所示；內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO: 10所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述mBCR融合基因的Taqman熒光探針和ABL基因的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)TET，3’端連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述內(nèi)參基因ABL的核酸序列如序列表中 SEQ ID NO: 11 所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述陰性對(duì)照為去離子水；所述陽(yáng)性對(duì)照為含有m BCR融合基因的總RNA樣品。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述cDNA第一鏈合成試劑為25mmol/LMgC 124 μ L，10 X 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2 μ L，IOmmoI/L dNTP2 μ L, RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L,Oligo (dT) 150. 5 μ g, AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U和無(wú)RNase去離子水,總體積11 μ L。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光定量PCR的混合液為1X的PCR 預(yù)混合液、2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq酶、O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶和無(wú)RNase去離子水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)m BCR融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。所述試劑盒包括檢測(cè)用引物、熒光探針、cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，所述檢測(cè)用引物、熒光探針包括m BCR融合基因引物、內(nèi)參基因ABL引物及Taqman熒光探針。m BCR融合基因是急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)的分子標(biāo)志物，其定量mRNA的表達(dá)量是目前診斷ALL最為敏感的方法，通過(guò)對(duì)治療前該基因的檢測(cè)，可以對(duì)該疾病預(yù)后作出判斷。因此，采用敏感性及特異性均較高的熒光定量PCR檢測(cè)m BCRmRNA水平，其檢測(cè)結(jié)果的特異性和敏感度均顯著提高，為臨床ALL患者制定治療方案以及預(yù)測(cè)預(yù)后提供了一種全新的快速簡(jiǎn)便的基因診斷技術(shù)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102925556SQ201210372120
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者童永清, 李艷 申請(qǐng)人:童永清, 李艷