專利名稱：一種檢測PML-RARa融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域的熒光定量PCR技術(shù)，具體涉及一種檢測PML-RARa融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒。
背景技術(shù)：
急性早幼粒細(xì)胞性白血病(Acute Promyelocytic Leukemia, APL)是急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia, AML)中的一種亞型，約占成人AML患者的10% 15%，病人常較年輕，年齡多在3(Γ38歲之間，10歲以下者比較罕見。據(jù)統(tǒng)計，國內(nèi)APL發(fā)病率高于西方國家的10%左右，占AML的18. 7%，部分地區(qū)比如東北油田的發(fā)病率則高達(dá)20°/Γ30%。因此， APL存在年齡、種族與地域的差異。
近十余年來，由于全反式維甲酸和三氧化二砷的應(yīng)用，采用雙誘導(dǎo)治療能夠使得 APL的初期誘導(dǎo)緩解率達(dá)到90%以上。藥物誘導(dǎo)治療之后，給予短程化療和結(jié)合以維甲酸和三氧化二砷的藥物進(jìn)行維持治療，可以使病人在2年左右的時間結(jié)束治療并且臨床治愈率聞達(dá)90%ο
目前，APL的病因尚不明確，但是隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展， 人們對于APL分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制有了比較深入的了解。超過90%的APL發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制為t (15 ；17) (q22 ;q21)，導(dǎo)致15號染色體上PML基因和17號染色體上的RARa基因形成 PML-RARa融合基因。易位使15q22上的PML基因與17q21上的維甲酸受體α基因發(fā)生交互性重排，分別在15號染色體上形成PML-RARa融合基因和RARa-PML融合基因。研究表明， 患者的白血病細(xì)胞均有PML-RARa融合基因的表達(dá)，僅有70% 80%的患者同時表達(dá)PML-RARa 融合基因，說明PML-RARa融合基因是致病的關(guān)鍵。根據(jù)PML斷裂點的位置不同，PML-RARa 融合基因有三種亞型bcrl、bcr2和bcr3，分別稱為長型(L型)、變異型(V型)和短型(S型)， 發(fā)生的概率則依次為55%、5%和40%。PML-RARa融合蛋白作為一種變異的維甲酸受體，相較于野生型RARa蛋白具有不同的DNA特性,是維甲酸(retinoic acid,RA)信號的抑制物,通過不同的途徑稱為內(nèi)在而有效的RARa靶基因轉(zhuǎn)錄因子抑制物。
因此，當(dāng)患者檢測出PML-RARa融合基因突變時，可作為急性早幼粒細(xì)胞性白血病的診斷依據(jù)，也可作為對全反式維甲酸和砷劑治療療效預(yù)測的分子標(biāo)志。
目前可用于PML-RARa融合基因的方法有探針雜交法、基因芯片法、質(zhì)譜法、基因測序法及免疫熒光法等。探針雜交法假陽性率較高；基因芯片法成本高、制備方法繁瑣；質(zhì)譜法難以在普通醫(yī)療機(jī)構(gòu)開展；基因測序法雖敏感性和特異性高，但價格比較昂貴，而且操作較繁瑣，耗時較長。免疫熒光法檢測PML-RARa融合基因定量表達(dá)可高通量完成臨床樣品檢測，且特異性和敏感性都很高，其敏感性和特異性均高于直接免疫熒光檢測等方法。實時熒光定量PCR (Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))與免疫熒光法相比具有特異性增強(qiáng)、靈敏度提高和檢測快速、降低了污染等特點，且目前尚未有實時熒光定量PCR方法檢測PML-RARa融合基因。CN 102925558 A書明說2/11 頁發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明實施例提供了一種采用熒光定量PCR技術(shù)檢測 PML-RARa融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒。所述技術(shù)方案如下
一種檢測PML-RARa融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒，包括檢測用引物、熒光探針、 cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對照和陽性對照，所述檢測用引物、熒光探針包括PML-RARaL融合基因引物、PML-RARaV融合基因弓丨物和PML-RARa S融合基因引物中的至少一種和內(nèi)參基因ABL引物及Taqman熒光探針，其中
PML-RARa L融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示；
PML-RARa L融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；
PML-RARa L融合基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:3所示；
PML-RARa V融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所示；
PML-RARa V融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:5所示；
PML-RARa V融合基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:6所示；
PML-RARa S融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:7所示；
PML-RARa S融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:8所示；
PML-RARa S融合基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:9所示；
ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:10所不；
ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示；
ABL基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO: 12所示；
所述cDNA第一鏈合成試劑含有MgCl2、逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑、 Oligo (dT) 15、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和無RNase去離子水；所述熒光定量PCR混合液含有PCR預(yù)混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和無 RNase 去離子水。
進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括內(nèi)部陽性控制序列、內(nèi)部陽性控制序列的引物和 Taqman熒光探針，其中內(nèi)部陽性控制序列如序列表中SEQ ID NO: 13所示；內(nèi)部陽性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID NO: 14所示；內(nèi)部陽性控制序列的下游引物如序列表中 SEQ ID NO: 15所示；內(nèi)部陽性控制序列Taqman突光探針如序列表中SEQ ID NO: 16所示。
進(jìn)一步地，所述PML-RARa L融合基因Taqman熒光探針、PML-RARa V融合基因 Taqman熒光探針、PML-RARa S融合基因Taqman熒光探針和ABL基因的Taqman熒光探針的 5’端連接有熒光報告基團(tuán)FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA ;所述內(nèi)部陽性控制序列的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團(tuán)TET，3’端連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。
具體地，所述內(nèi)參基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO: 17所示。
具體地，所述陰性對照為去離子水；所述陽性對照為含有PML-RARa L融合基因、 PML-RARa V融合基因和PML-RARa S融合基因的總RNA樣品。
具體地，所述第一鏈cDNA合成試劑為25mmol/L MgCl2 4 μ L，10 X逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2 μ L，IOmmoI/L dNTP2 μ L, RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L，Oligo (dT) 15 O. 5ug, AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 I. 5U 和無RNase去離子水,總體積11 μ L。
具體地，所述熒光定量PCR的混合液(以反應(yīng)體系終濃度表示)為I X的PCR預(yù)混合液(原液為 2 XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、?！?2-0. 4mM 的 dNTPs,O. 3-0. 6mM 的 dUTP、O.2U/ μ L的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶以及無RNase去離子水。4
本發(fā)明試劑盒的優(yōu)點和效果如下
(I)敏感性高可重復(fù)敏感度為O. 01%，即10000個細(xì)胞中有一個含PML-RARa融合基因就可以被檢測出。
(2)特異性強(qiáng)使用特異性探針對定量分子進(jìn)行識別，準(zhǔn)確性高。同時，靶序列由弓I物和探針雙重控制，特異性好、假陽性低。
(3)簡便安全操作簡單、安全、自動化程度高而且防止污染。擴(kuò)增和檢測可以在同一管內(nèi)檢測，不需要開蓋，不易被污染；同時擴(kuò)增和檢測一步完成，不需要后期處理，無需要擔(dān)心放射性污染。
(4)全程監(jiān)控本發(fā)明實施例提供的試劑盒引入了內(nèi)部陽性控制質(zhì)量控制體系，對檢測過程進(jìn)行全程質(zhì)量監(jiān)控，有效避免假陽性或者假陰性。
(5)快速速度快、高通量，可在3-4小時完成。
本發(fā)明的試劑盒能快速、準(zhǔn)確、定量檢測PML-RARa融合基因mRNA水平，有效杜絕了假陽性和假陰性的發(fā)生，用于急性早幼粒細(xì)胞性白血病的診斷及治療過程中微小殘留病的監(jiān)測，為急性早幼粒細(xì)胞性白血病的診斷、制定治療方案及療效評價和預(yù)后提供了重要的檢測手段。


為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。·
圖IA是本發(fā)明實施例2提供的試劑盒的熒光實時定量PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增 I. OxlO6-L OxlO3拷貝的內(nèi)部陽性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品的熒光曲線圖IB是由本發(fā)明實施例2提供的試劑盒的熒光實時定量PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增 I. OxlO6-L OxlO3拷貝的內(nèi)部陽性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品的熒光曲線圖得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2A是本發(fā)明實施例2提供的試劑盒的熒光實時定量PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增 I. OxlO6-L OxlO3拷貝的ABL標(biāo)準(zhǔn)品的熒光曲線圖2B是由本發(fā)明實施例2提供的試劑盒的熒光實時定量PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增I.OxlO6-L OxlO3拷貝的ABL標(biāo)準(zhǔn)品熒光曲線圖得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實施方式
為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面結(jié)合附圖對本發(fā)明實施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。
實施例I.試劑盒的制備
I、特異性的引物和熒光探針的設(shè)計
根據(jù)基因序列(ABL基因序列、PML基因序列和RARa基因序列來源于美國國家生物技術(shù)信息中心核酸數(shù)據(jù)庫，其中ABL基因ID分別為25，參考序列號為NM_005157. 4 ；PML 基因ID分別為5371，參考序列號為NG_029036. I ;RARa基因ID分別為5914，參考序列號為 NG_027701. I)分別設(shè)計對上述各基因序列特異的引物和熒光探針。
2、按照下列試劑盒的組成配制試劑盒的各組分
本發(fā)明試劑盒組成如下
①RNA 提取試劑=Trizol 試劑(Invitrogen 公司，產(chǎn)品貨號15596-026/100ml), 每Iml骨髓組織加入ImlTrizol快速提取急性早幼粒細(xì)胞性白血病患者骨髓組織RNA。
②cDNA 第一鏈合成試劑盒(RTPCR) (Fermentas 公司，產(chǎn)品貨號K1622):25mmol/ L MgCl2 4 μ L，IOX 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2 μ L，IOmmoI/L dNTP2 μ L, RNA 酶抑制劑(RNasin，一種酸性糖蛋白)O. 5 μ L, Oligo (dT) 15 O. 5 μ g, AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U和無RNase去離子水。
③引物、探針和標(biāo)準(zhǔn)品包括PML-RARa融合基因引物、內(nèi)部陽性控制序列、內(nèi)部陽性控制序列引物、內(nèi)參基因ABL引物以及與引物對應(yīng)的Taqman熒光探針，具體如下
PML-RARa L融合基因上游引物序列5’-TCTTCCTGCCCAACAGCAA-3’(序列表中序列I);
PML-RARa L 融合基因下游引物序列5’-GCTGGGCACTATCTCTTCAGAAC-3’(序列表中序列2)；
PML-RARa L 融合基因 Taqman 熒光探針FAM5’-CAGCCATGAGACCCA_3’TAMRA (序列表中序列3)；
PML-RARa V 融合基因上游引物序列5’-GGACCTCAGCTCTTGCATCAC-3’(序列表中序列4)；
PML-RARaV 融合基因下游引物序列5’-GCTGGGCACTATCTCTTCAGAAC-3’(序列表中序列5)；
PML-RARa V 融合基因 Taqman 熒光探針FAM5’-AAGCCATTGAGACCCAG_3’TAMRA (序列表中序列6)；
PML-RARa S 融合基因上游引物序列5’-GAAGGTCATCAAGATGGAGTCTGA_3’(序列表中序列7)；
PML-RARa S融合基因下游引物序列5’-TGCTGCTCTGGGTCTCAATG_3’(序列表中序列8)；
PML-RARa S 融合基因 Taqman 熒光探針FAM5’ -AAGGAGGCAAGGTTGG-3’ TAMRA (序列表中序列9)；
內(nèi)部陽性控制序列為5’ -UCUUCCUGCCGAACAGCUACCACGUGGCCAGUGGCGCCGGGGAGGCA GCGAUUCAGACCCAGAGCAGCACUUGUGAAGAGAUAGUGCCCAGC-3’(序列表中序列 13)；
內(nèi)部陽性控制序列上游引物序列為5’-TCTTCCTGCCGAACAGCTA-3’(序列表中序列 14)；
內(nèi)部陽性控制序列下游引物序列為5’-GCTGGGCACTATCTCTTCACAAG-3’(序列表中序列15)；
內(nèi)部陽性控制序列Taqman 熒光探針TET5’ -CAGCGATTCAGACCCA-3’ TAMRA (序列表中序列16)。
ABL 基因序列為5’ -CAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCT GGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCAT AACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCC AAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGGAGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCC6CGCAATGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGG C-3’(序列表中序列17)；
ABL基因上游引物序列為5’-CCGGGTCTTAGGCTATAATCACA-3’(序列表中序列10);
ABL基因下游引物序列為5’ -GCCTTGGCCATTTTTGGTT-3’(序列表中序列11)；
ABL 基因 Taqman 熒光探針FAM5’ -TGGTGTGAAGCCC-3’ TAMRA (序列表中序列 12);
其中，內(nèi)部陽性控制序列為人工合成序列，包含一部分已知的PML-RARa融合基因序列和一部分人工合成序列；內(nèi)部陽性控制序列和ABL基因序列分別用作標(biāo)準(zhǔn)品。
上述引物序列、控制序列、基因序列和Taqman熒光探針序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
④陰性對照和陽性對照以去離子水為陰性對照，以含有PML-RARa融合基因總RNA樣品為陽性對照，采用上述實施例I中提供的本發(fā)明試劑盒組成①RNA提取試劑 Trizol試劑(Invitrogen公司，產(chǎn)品貨號15596-026/100ml),按每Iml骨髓組織加入Iml Trizol試劑的比例，快速提取已經(jīng)確診的含有PML-RARa融合基因的急性早幼粒細(xì)胞性白血病患者的骨髓組織RNA，作為陽性對照。
⑤PML-RARa L融合基因熒光定量PCR反應(yīng)液由熒光定量PCR混合液和檢測MPL 基因W515L位點突變特異性的引物、探針組成1X的PCR預(yù)混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號210212，2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、 O. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶、O. 25pmol/μ L 的 PML-RARa L 融合基因上游引物(序列表中序列1)、0. 25pmol/yL的PML-RARa L融合基因下游引物(序列表中序列2)、0· 3pmol/ μ L的PML-RARa L融合基因Taqman突光探針(序列表中序列3)、0· 25pmol/ μ L的內(nèi)部陽性控制序列上游引物(序列表中序列14)、0. 25pmol/yL的內(nèi)部陽性控制序列下游引物(序列表中序列15)、0. 3pmol/yL的內(nèi)部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列16)(以上所有的濃度都是指PCR反應(yīng)體系的終濃度)。通常取1-2 μ L的模板(包括被測樣品RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA和內(nèi)部陽性控制序列RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA)，其余為無 RNase去離子水,反應(yīng)總體積通常為20 μ L。
⑥PML-RARa V融合基因熒光定量PCR反應(yīng)液由熒光定量PCR混合液和檢測MPL 基因W515L位點突變特異性的引物、探針組成1Χ的PCR預(yù)混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號210212，2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、O.2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶、O. 25pmol/μ L 的 PML-RARa V 融合基因上游引物(序列表中序列4)、0. 25pmol/yL的PML-RARaV融合基因下游引物(序列表中序列 5)、0· 3pmol/ μ L的PML-RARa V融合基因Taqman突光探針(序列表中序列6)、0· 25pmol/ μ L的內(nèi)部陽性控制序列上游引物(序列表中序列14)、0. 25pmol/yL的內(nèi)部陽性控制序列下游引物(序列表中序列15)、0. 3pmol/yL的內(nèi)部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列16)、0. 3pmol/yL的內(nèi)部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列13)(以上所有的濃度都是指PCR反應(yīng)體系的終濃度)。通常取1-2 μ L的模板(包括被測樣品RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA和內(nèi)部陽性控制序列RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA),其余為無RNase去離子水， 反應(yīng)總體積通常為20 μ L0
⑦PML-RARa S融合基因熒光定量PCR反應(yīng)液由熒光定量PCR混合液和檢測MPL 基因W515L位點突變特異性的引物、探針組成1Χ的PCR預(yù)混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨CN 102925558 A書明說6/11 頁號210212，2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、 O. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶、O. 25pmol/μ L 的 PML-RARa S 融合基因上游引物(序列表中序列7)、0. 25pmol/yL的PML-RARa S融合基因下游引物(序列表中序列 8)、0· 3pmol/ μ L的PML-RARa S融合基因Taqman突光探針(序列表中序列9)、0· 25pmol/ μ L的內(nèi)部陽性控制序列上游引物(序列表中序列14)、0. 25pmol/yL的內(nèi)部陽性控制序列下游引物(序列表中序列15)、0. 3pmol/yL的內(nèi)部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列16)(以上所有的濃度都是指PCR反應(yīng)體系的終濃度)。通常取1-2 μ L的模板(包括被測樣品RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA和內(nèi)部陽性控制序列RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA)，其余為無 RNase去離子水,反應(yīng)總體積通常為20 μ L。
⑧ABL內(nèi)參基因熒光定量PCR反應(yīng)液由熒光定量PCR混合液和檢測ABL內(nèi)參基因的引物、探針組成=IX的PCR預(yù)混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號210212，2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/μ L 的 Taq 酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/y L的ABL內(nèi)參基因上游引物(序列表中序列 10 )、0· 25pmol/ μ L的ABL內(nèi)參基因下游引物(序列表中序列11 )、0· 3pmol/ μ L的ABL基因 Taqman熒光探針(序列表中序列12)(以上所有的濃度都是指PCR反應(yīng)體系的終濃度)。檢測時，加入ABL基因標(biāo)準(zhǔn)品模板2 μ L,反應(yīng)總體積通常為20 μ L?！?br> ⑨內(nèi)部陽性控制序列熒光定量PCR反應(yīng)液由熒光定量PCR混合液和檢測內(nèi)部陽性控制序列的引物、探針組成I X的PCR預(yù)混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號210212，2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/μ L 的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/yL的內(nèi)部陽性控制序列上游引物(序列表中序列11)、0. 25pmol/yL的內(nèi)部陽性控制序列下游引物(序列表中序列12)、0. 3pmol/ μ L的內(nèi)部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列13)(以上所有的濃度都是指PCR 反應(yīng)體系的終濃度)。檢測時，通常取1-2 μ L的模板(內(nèi)部陽性控制序列RNA反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA),其余為無RNase去離子水,反應(yīng)總體積通常為20 μ L。
3、PCR擴(kuò)增程序的設(shè)定在Iightcycler儀器上先經(jīng)過50°C 10s, 95°C IOmin,然后再經(jīng)過95°C 15s，60°C lmin，共40個循環(huán)。
實施例2.用實施例I制備的試劑盒檢測PML-RARa融合基因mRNA的表達(dá)量
以檢測30例急性早幼粒細(xì)胞性白血病骨髓組織標(biāo)本結(jié)果為例，其中，患者檢測出 PML-RARa融合基因形式包括PML-RARa L融合基因、PML-RARa V融合基因和PML-RARa S融合基因。用本發(fā)明的試劑盒檢測PML-RARa融合基因mRNA表達(dá)量的檢測流程為首先根據(jù)基因序列設(shè)計特異性的引物和熒光探針。其次獲取臨床急性早幼粒細(xì)胞性白血病患者骨髓組織樣本，快速提取組織RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR合成cDNA第一鏈；先配制ABL內(nèi)參基因和內(nèi)部陽性控制序列的熒光定量PCR反應(yīng)液，將內(nèi)部陽性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品和ABL標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至拷貝數(shù)/mL為I. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和I. OxlO6，分別制作內(nèi)部陽性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖IA和圖IB所不)和ABL標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖2A和圖2B所不)，然后再配制PML-RARa融合基因PCR反應(yīng)液進(jìn)行熒光定量PCR檢測樣品，在熒光定量PCR儀數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)中讀出CT值結(jié)果。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，首先分析內(nèi)部陽性控制序列擴(kuò)增結(jié)果，如果其 Ct值小于33，提示整個檢測過程有效，如果其Ct值大于35，提示檢測失敗，則需要重新進(jìn)行檢測，如果其Ct值位于33 35之間，需要重復(fù)檢測。當(dāng)內(nèi)部陽性控制序列Ct值小于33時，8將實時熒光定量PCR所得數(shù)據(jù)進(jìn)行計算，分別計算PML-RARa融合基因及ABL基因的Ct值， 兩者之差即為ACt值。最后，熒光定量PCR結(jié)果采用軟件分析，并標(biāo)化計算樣本數(shù)據(jù)。
具體步驟如下
①急性早幼粒細(xì)胞性白血病患者骨髓組織總RNA的抽提按RNA抽提純化的方法抽提急性早幼粒細(xì)胞性白血病患者骨髓組織總RNA。提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，通過紫外分光光度計測定260nm與280nm光密度值計算RNA的純度與濃度，用0.1% DEPC處理的水調(diào)節(jié)抽提的RNA至相同濃度。
②反轉(zhuǎn)錄合成cDNA :取2 μ L上述RNA提取液，在70°C保溫lOmin，隨后加入實施例I提供的本發(fā)明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/L MgCl2 4 μ L，IOX 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2 μ L，IOmmoI/L dNTPs2 μ L，RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L, Oligo (dT) 15 O. 5 μ g 和 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U,補加無RNase去離子水至總體積20 μ L,于42°C保溫15min,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA第一鏈。反應(yīng)結(jié)束后，加熱至99°C，5min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，加20 μ L無菌水混勻置冰箱_20°C保存。
取I μ L濃度為2 μ g/ml內(nèi)部陽性控制序列RNA (序列表中序列13)，在70°C保溫 IOmin隨后加入實施例I提供的本發(fā)明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/ L MgCl24y L，IOX 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2μ L，10mmol/L dNTPs2 μ L，RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L， Oligo (dT) 15 O. 5 μ g和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U，補加無RNase去離子水至總體積20 μ L，于42°C 保溫15min,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),合成cDNA。反應(yīng)結(jié)束后,加熱至99°C, 5min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶， 加20 μ L無菌水混勻置冰箱_20°C保存。
取I μ L濃度為2 μ g/ml的陽性對照RNA，在70°C保溫lOmin，隨后加入實施例I 提供的本發(fā)明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/L MgCl2 4yL,10X逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2 μ L，IOmmoI/L dNTPs2 μ L, RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L，Oligo (dT) 15 O. 5 μ g 和 AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U,補加無RNase去離子水至總體積20 μ L,于42°C保溫15min,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。反應(yīng)結(jié)束后，加熱至99°C，5min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，加20 μ L無菌水混勻置冰箱-20°C保存。
③將內(nèi)部陽性控制基因序列標(biāo)準(zhǔn)品和ABL標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至拷貝數(shù)/mL為1.OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和l.OxlO6，用實施例I提供的內(nèi)部陽性控制序列和ABL內(nèi)參基因的熒光定量PCR反應(yīng)液，分別制作內(nèi)部陽性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖IA和圖IB所示)和ABL標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖2A和圖2B所示)。
④PML-RARa融合基因熒光定量PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為20 μ L :1 XPCR預(yù)混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，PML-RARa L融合基因、PML-RARa V融合基因及PML-RARa S融合基因上、下游引物終濃度各0. 2 μ mol/ L，加入相應(yīng)的PML-RARa L融合基因、PML-RARa V融合基因及PML-RARa S融合基因各 Taqman熒光探針終濃度0. 3ymol/L，cDNAl. O μ L，同時加入內(nèi)部陽性控制序列上、下游引物終濃度各0. 2 μ mo I/L和內(nèi)部陽性控制序列Taqman熒光探針終濃度0. 3 μ mol/L,終濃度為0. 2 μ mol/L的內(nèi)部陽性控制序列RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA (②中反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA)，加入超純水至總體積20 μ L。在Iightcycler熒光定量PCR儀上反應(yīng)擴(kuò)增條件為95°C IOmin 預(yù)變性，然后95°C 15s,60°C Imin擴(kuò)增40個循環(huán)，擴(kuò)增過程中儀器自動收集熒光信號。
⑤ABL內(nèi)參基因熒光定量PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為20 μ L :含2XPCR混合液 (Qiagen公司，產(chǎn)品貨號210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，ABL 基因引物終濃度0.2 4 11101/1，探針終濃度0.2 4 11101/1，481^基因cDNAl. O μ L，加入無RNase去離子水補至總體積20 μ L。在Iightcycler熒光定量PCR儀上反應(yīng)擴(kuò)增條件為95°C IOmin預(yù)變性，然后95°C 15s,60°C Imin擴(kuò)增40個循環(huán)，擴(kuò)增過程中儀器自動收集熒光信號。
⑥陽性對照、陰性對照熒光定量PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為20 μ L :含2XPCR混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，PML-RARa 融合基因引物終濃度O. 2 μ mol/L,探針終濃度O. 3 μ mol/L,陽性對照RNA反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNAl. 0μ L或者陰性對照去離子水I. 0μ L，加入無RNase去離子水補至總體積20 μ L。 在Iightcycler熒光定量PCR儀上反應(yīng)擴(kuò)增條件為95°C IOmin預(yù)變性，然后95°C 15s, 60°C Imin擴(kuò)增40個循環(huán)，擴(kuò)增過程中儀器自動收集熒光信號。
⑦數(shù)據(jù)收集處理和分析PCR擴(kuò)增結(jié)束后，首先分析內(nèi)部陽性控制序列擴(kuò)增結(jié)果， 如果其Ct值小于33，提示整個檢測過程有效，如果其Ct值大于35，則需要重新進(jìn)行檢測。當(dāng)內(nèi)部陽性控制序列Ct值小于33時，將實時熒光定量PCR所得數(shù)據(jù)進(jìn)行計算，得出 PML-RARa融合基因(PML-RARa L融合基因、PML-RARa V融合基因或PML-RARa S融合基因) 相對于ABL內(nèi)參基因的相對表達(dá)量后再進(jìn)行統(tǒng)計分析，以比值大于或等于O. 0001為陽性表達(dá)，小于O. 0001為陰性表達(dá)(具體參見表I)
表I為熒光定量PCR分析PML-RARa融合基因在急性早幼粒細(xì)胞性白血病中的表達(dá)
權(quán)利要求
1.一種檢測PML-RARa融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒，包括檢測用引物、熒光探針、 cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對照和陽性對照，其特征在于，所述檢測用引物、熒光探針包括PML-RARaL融合基因引物、PML-RARa V融合基因引物和PML-RARa S 融合基因引物中的至少一種和內(nèi)參基因ABL引物及Taqman熒光探針，其中PML-RARa L融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示；PML-RARa L融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:2所示；PML-RARa L融合基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:3所示；PML-RARa V融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所示；PML-RARa V融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:5所示；PML-RARa V融合基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:6所示；PML-RARa S融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示；PML-RARa S融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:8所示；PML-RARa S融合基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:9所示；ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 10所不；ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 11所不；ABL基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO: 12所示；所述cDNA第一鏈合成試劑含有MgCl2、逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑、 Oligo (dT) 15、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和無RNase去離子水；所述熒光定量PCR混合液含有PCR預(yù)混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和無 RNase 去離子水。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括內(nèi)部陽性控制序列、 內(nèi)部陽性控制序列的引物和Taqman熒光探針，其中內(nèi)部陽性控制序列如序列表中SEQ ID NO: 13所示；內(nèi)部陽性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID NO: 14所示；內(nèi)部陽性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID NO: 15所示；內(nèi)部陽性控制序列Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO: 16所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述PML-RARaL融合基因Taqman熒光探針、PML-RARa V融合基因Taqman熒光探針、PML-RARa S融合基因Taqman熒光探針和 ABL基因的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團(tuán)FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團(tuán) TAMRA ;所述內(nèi)部陽性控制序列的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團(tuán)TET，3’端連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述內(nèi)參基因ABL的核酸序列如序列表中 SEQ ID NO: 17 所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述陰性對照為去離子水；所述陽性對照為含有PML-RARa L融合基因、PML-RARa V融合基因和PML-RARa S融合基因的總RNA樣品。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述cDNA第一鏈合成試劑為25mmol/ L MgCl2 4μ L，IOX 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2μ L，10mmol/L dNTP2 μ L，RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L， Oligo (dT) 15 O. 5 μ g, AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U和無RNase去離子水，總體積IluL0
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光定量PCR的混合液為1X的 PCR 預(yù)混合液、2. 5-4. OmM 的 Mg2+、?！?2-0. 4mM 的 dNTPs,O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶、O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶和無RNase去離子水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測PML-RARa融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，所述試劑盒包括PML-RARa L融合基因體系、PML-RARa V融合基因體系和PML-RARa S融合基因體系中的至少一種體系以及內(nèi)參基因ABL體系，所述體系均包括上游引物、下游引物和Taqman熒光探針。PML-RARa融合蛋白作為一種變異的維甲酸受體，相較于野生型RARa蛋白具有不同的DNA特性，是RA信號的抑制物，通過不同的途徑成為內(nèi)在而有效的RARa靶基因轉(zhuǎn)錄因子抑制物。因此，采用敏感性及特異性均較高的熒光定量PCR檢測PML-RARa融合基因mRNA水平，其檢測結(jié)果的特異性和敏感度均顯著提高，為預(yù)測急性早幼粒細(xì)胞性白血病的預(yù)后以及化療方案的確定提供了一種全新的快速簡便的基因診斷技術(shù)。
文檔編號C12Q1/68GK102925558SQ20121037470
公開日2013年2月13日 申請日期2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者童永清, 李艷 申請人:童永清, 李艷