專利名稱：一種利用氣提弱化酵母細胞連續(xù)振蕩行為的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，為一種發(fā)酵偶聯(lián)氣提技術(shù)弱化酵母細胞超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵過程中產(chǎn)物濃度振蕩的方法。
背景技術(shù)：
燃料乙醇是最主要的生物能源產(chǎn)品之一，目前主要以糖質(zhì)和淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)。淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)燃料乙醇，扣除副產(chǎn)品沖減后，原料成本仍然占總生產(chǎn)成本的60%左右，居首位，能耗成本占30%左右，次之。開發(fā)廉價原料資源，特別是以各類農(nóng)作物秸桿為代表的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)，是解決燃料乙醇生產(chǎn)原料成本高的根本途徑，但由于這類生物質(zhì)對纖維素酶解的強抗性，從中獲得糖的成本遠遠高于淀粉質(zhì)原料，而且水解糖中含有20-30%的五碳糖，難以被乙醇發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株有效利用，致使其燃料乙醇的生產(chǎn)成本遠遠高于糖質(zhì)和淀粉質(zhì)原料，無法工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。因此，開發(fā)燃料乙醇生產(chǎn)的節(jié)能技術(shù)，降低生產(chǎn)過程能耗，具有十分重要的意義。 以提高發(fā)酵終點乙醇濃度為目標(biāo)的高濃度發(fā)酵，不僅可以降低發(fā)酵醪精餾操作的能耗，而且還可以減少燃料乙醇生產(chǎn)廢糟液總量，節(jié)省廢糟液處理的能耗。目前，國內(nèi)外淀粉質(zhì)原料乙醇發(fā)酵，連續(xù)發(fā)酵乙醇體積比濃度一般為11-12%，間歇發(fā)酵略高，可以達到13-15%。發(fā)酵終點乙醇濃度超過15%的高濃度發(fā)酵，甚至達到20%的超高濃度發(fā)酵(Veryhigh gravity，VHG)，一直是學(xué)術(shù)界和工業(yè)界共同關(guān)注的研究方向，人們試圖從發(fā)酵工藝的改進、培養(yǎng)基營養(yǎng)組分添加、發(fā)酵裝置優(yōu)化等方面著手，不斷提高發(fā)酵終點乙醇濃度。然而，達到這樣高乙醇濃度而導(dǎo)致發(fā)酵終點殘余葡萄糖濃度升高，影響糖醇收率(工業(yè)生產(chǎn)中以進入發(fā)酵系統(tǒng)總糖來計算糖醇收率，發(fā)酵終點殘余葡萄糖濃度升高會導(dǎo)致糖醇收率的顯著降低)，不顯著延長發(fā)酵時間，增加雜菌污染的機會，造成糖和發(fā)酵生成乙醇的損耗，是基礎(chǔ)研究和應(yīng)用技術(shù)開發(fā)面臨的最大挑戰(zhàn)，也是VHG技術(shù)迄今為止未能在工業(yè)化生產(chǎn)中得到實際應(yīng)用的根本原因。因此，開發(fā)超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵是燃料乙醇工業(yè)化發(fā)展的一個重要方向。加拿大的DP Bayrock博士利用多級串聯(lián)反應(yīng)器進行了短時間的超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵并得到不錯效果(非專利文獻1)，然而，白鳳武教授發(fā)現(xiàn)進行長時間超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵過程中釀酒酵母呈現(xiàn)長周期、大振幅的振蕩行為，并發(fā)現(xiàn)其對其乙醇發(fā)酵性能產(chǎn)生明顯影響(非專利文獻2)。另外，巴西學(xué)者Walter Borzani教授也在利用釀酒酵母在含底物糖濃度20%的糖蜜(Blackstrap molasses,含有大量灰分和其它雜質(zhì))的連續(xù)乙醇發(fā)酵的研究工作中發(fā)現(xiàn)長周期，大振幅的振蕩行為(非專利文獻3)，遺憾的是Walter Borzani只報道了實驗現(xiàn)象，分析了對乙醇發(fā)酵收率的影響，而沒有開發(fā)這一振蕩現(xiàn)象的弱化策略。目前，只有白鳳武教授針對這種超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵條件下振蕩行為而開發(fā)相應(yīng)的振蕩弱化策略，在多級串聯(lián)反應(yīng)器條件下利用固定化方法較好地弱化了這種振蕩，但這種多級罐串聯(lián)操作的缺點在于增加了設(shè)備的投資和操作維護的難度(非專利文獻2)。除此之外，而未見關(guān)于弱化或消除這種高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵振蕩的報道或?qū)＠夹g(shù)。
現(xiàn)有技術(shù)非專利文獻I :Bayrock DPj Ingledew WM. 2001. Application of multistagecontinuous fermentation for production of fuel alcohol by very-high-gravityfermentation techno logy. Journal of Industrial Microbiology andBiotechnology27, 87-93.非專利文獻2 Bai FWj Chen LJj Anderson WAj Moo-Young M. 2004. Parameteroscillations in very high gravity medium continuous ethanol fermentation andtheir attenuation on multi-stage packed column bioreactor system. Biotechnologyand Bioengineering88:558-566.非專利文獻3 ；Borzani W. 2001. Variation of the ethanol yield during
osciIlatory concentration changes in undisturbed continuous ethanolfermentation of sugar-cane blackstrap molasses. World Journal of Microbiologyand Biotechnologyl7:253-258.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用氣提法弱化超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵過程中乙醇生產(chǎn)菌發(fā)酵參數(shù)振蕩的方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明的這一目的，采用一種在連續(xù)乙醇發(fā)酵過程中偶聯(lián)氣提裝置來弱化乙醇生產(chǎn)菌在超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵過程中參數(shù)振蕩的方法，包括如下步驟(I)培養(yǎng)乙醇生產(chǎn)菌的步驟；(2)利用乙醇生產(chǎn)菌進行超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵的步驟；和(3)利用氣提法弱化步驟(2)的過程中乙醇生產(chǎn)菌發(fā)酵參數(shù)振蕩行為的步驟。在本發(fā)明的方法中，乙醇生產(chǎn)菌優(yōu)選為工業(yè)釀酒酵母或基因工程絮凝酵母菌BHLOI。本發(fā)明的方法，步驟(2)使用超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵裝置，步驟(3)的氣提法使用氣提裝置；氣體裝置偶聯(lián)于超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵裝置，當(dāng)發(fā)酵裝置的發(fā)酵液中的發(fā)酵參數(shù)出現(xiàn)1-10個完整的振蕩周期后，啟動氣提裝置，向乙醇發(fā)酵液中通入氣體，利用氣提法弱化連續(xù)乙醇發(fā)酵過程中乙醇生產(chǎn)菌的振蕩行為。在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，在步驟(2)所述超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵中使用的連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度優(yōu)選為250g/L-350g/L，更優(yōu)選為280g/L，連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基的稀釋速率優(yōu)選為0. 012-0. 03611-1,更優(yōu)選為0. 0271Γ1。在連續(xù)的超高濃度乙醇發(fā)酵過程中，乙醇生產(chǎn)菌的發(fā)酵參數(shù)呈現(xiàn)周期性大幅振蕩，所述發(fā)酵參數(shù)包括發(fā)酵液中的殘余葡萄糖，乙醇，生物量。在本發(fā)明另一優(yōu)選方案中，在步驟(3 )的氣提過程中所用的氣體優(yōu)選為氮氣、空氣或發(fā)酵自產(chǎn)氣體如二氧化碳，氣提的原料液為乙醇生產(chǎn)菌的發(fā)酵液，氣體通過發(fā)酵系統(tǒng)中在攪拌槳的剪切作用下形成小氣泡。當(dāng)超高濃度連續(xù)發(fā)酵條件下的發(fā)酵液的發(fā)酵參數(shù)呈現(xiàn)1-10個完整的振蕩周期后，啟動氣提裝置，開始向乙醇發(fā)酵液中通入氣提氣體，每I. 5升(連續(xù)發(fā)酵有效體積)乙醇發(fā)酵液中通入的氣體流速優(yōu)選為100-300L/h，更優(yōu)選為200L/h。通入氣體約IOOh后，發(fā)酵液中的乙醇濃度可維持在50g/L左右，發(fā)酵液中的殘余葡萄糖濃度低于lg/L。停止通入氣提氣體時，連續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)恢復(fù)到氣提前的周期性振蕩行為，其振蕩周期超過IOOh。超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵可以顯著降低燃料乙醇生產(chǎn)能耗，然而酵母細胞在VHG條件下進行連續(xù)乙醇發(fā)酵呈現(xiàn)長周期、大振幅的振蕩行為，不僅嚴(yán)重影響乙醇發(fā)酵性能，而且不利于精餾裝置的穩(wěn)定運行，致使超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵技術(shù)未能在工業(yè)化生產(chǎn)中得到實際應(yīng)用。通過本發(fā)明的方法，在不增加設(shè)備投資的前提下，有效地實現(xiàn)了單級罐超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵并且控制殘余葡萄糖濃度低于lg/L，達到工業(yè)要求，為超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)提供了新的技術(shù)支持。


圖I為本發(fā)明中連續(xù)空氣或氮氣氣提乙醇發(fā)酵裝置結(jié) 構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明中連續(xù)自產(chǎn)氣氣提乙醇發(fā)酵裝置結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為游離酵母細胞連續(xù)乙醇發(fā)酵過程中發(fā)酵參數(shù)振蕩的數(shù)據(jù)曲線；圖4為絮凝酵母細胞連續(xù)乙醇發(fā)酵過程中發(fā)酵參數(shù)振蕩的數(shù)據(jù)曲線；圖5為游離細胞連續(xù)乙醇發(fā)酵系統(tǒng)中氮氣氣提前后發(fā)酵參數(shù)的數(shù)據(jù)曲線；圖6為游離細胞連續(xù)乙醇發(fā)酵系統(tǒng)中空氣氣提前后發(fā)酵參數(shù)的數(shù)據(jù)曲線；圖7為絮凝細胞連續(xù)乙醇發(fā)酵系統(tǒng)中自產(chǎn)氣氣提前后發(fā)酵參數(shù)的數(shù)據(jù)曲線。
具體實施例方式本發(fā)明是一種利用氣提弱化超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵過程中乙醇生產(chǎn)菌發(fā)酵參數(shù)振蕩行為的方法，其特征在于，該方法包括(I)培養(yǎng)乙醇生產(chǎn)菌的步驟；(2)利用乙醇生產(chǎn)菌進行超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵的步驟；和(3)利用氣提法弱化步驟(2)的過程中發(fā)酵參數(shù)振蕩行為的步驟。下面，結(jié)合附圖I對發(fā)明進行詳細說明?！磁囵B(yǎng)乙醇生產(chǎn)菌〉所述乙醇生產(chǎn)菌為工業(yè)釀酒酵母(Saccharomyces cereviae)或基因工程絮凝酵母菌BHLOl。其中，所述基因工程絮凝酵母菌BHLOl為將絮凝基因?qū)牍I(yè)釀酒酵母菌中得到的組成型表達的絮凝酵母菌株。本文中為了簡潔與清楚，將工業(yè)釀酒酵母，簡稱為游離酵母；基因工程絮凝酵母菌BHLOl，簡稱為絮凝酵母。將在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的菌株接種于搖瓶中的生長培養(yǎng)基中，在25-37°C，200_300rpm的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為15-25h，菌株培養(yǎng)條件優(yōu)選為在30°C、300rpm搖床振蕩條件下培養(yǎng)20h。<利用乙醇生產(chǎn)菌進行超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵>①將上述步驟中得到的含有乙醇生產(chǎn)菌的種子培養(yǎng)液按體積百分比10%的接種量接入到裝有I. 5L批式發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐3中，在30°C，300rpm，pH4. 5的發(fā)酵條件下進行批式發(fā)酵培養(yǎng)，利用設(shè)置在發(fā)酵罐3上的溫度調(diào)節(jié)器7和pH調(diào)節(jié)器8調(diào)節(jié)發(fā)酵液溫度和發(fā)酵液PH值。發(fā)酵過程中的發(fā)酵液pH值優(yōu)選控制在4. 5，通過pH調(diào)節(jié)器8向發(fā)酵液中加入2mol/L氫氧化鈉水溶液來調(diào)節(jié)。在發(fā)酵過程中向發(fā)酵罐3中通入壓縮空氣，壓縮空氣通過轉(zhuǎn)子流量計5b進行控制流量，將通氣速率控制在O. 05vvm,空氣在通入發(fā)酵罐前需經(jīng)過裝有水的設(shè)備6b調(diào)節(jié)空氣濕度，使通入發(fā)酵罐3的空氣中含有飽和的水蒸氣。每隔12h，測定發(fā)酵液中的殘余葡萄糖和乙醇濃度。②當(dāng)發(fā)酵罐3中發(fā)酵液的殘余葡萄糖濃度低于lg/L時，開始從儲罐I中通過蠕動泵(圖I中2，圖2中2a)向發(fā)酵罐3中以O(shè). 012-0. 0361Γ1的稀釋速率流加連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基，進行連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，每隔12h，測定發(fā)酵液中的發(fā)酵參數(shù)。連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)條件同①中所述發(fā)酵條件。連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基的稀釋速率優(yōu)選為O. 02711'連續(xù)發(fā)酵體系通過發(fā)酵罐3上的溢流口控制發(fā)酵體積，發(fā)酵液由溢流口流入廢液罐4中。在進行超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵后，檢測到的發(fā)酵參數(shù)出現(xiàn)大幅度波動，約100-130h后呈現(xiàn)穩(wěn)定的連續(xù)振蕩行為。 連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖為碳源，葡萄糖的濃度為250_300g/L，優(yōu)選為280g/L。所述發(fā)酵參數(shù)包括發(fā)酵液中殘余葡萄糖、乙醇和生物量。傳統(tǒng)乙醇發(fā)酵過程中，由于發(fā)酵后期高濃度乙醇對細胞的抑制作用，因此只能進行高濃度底物的批式發(fā)酵，難以實現(xiàn)連續(xù)的高濃度乙醇發(fā)酵，工業(yè)上雖是進行的連續(xù)發(fā)酵，但是流加的培養(yǎng)基都是含有低濃度糖的培養(yǎng)基。因此進行超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵是工業(yè)乙醇發(fā)酵的重要方向，相對傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵工藝是一個很大的提高和改善，使用這種工藝可以提高終點發(fā)酵的乙醇濃度，從而降低乙醇精餾能耗。但是，在連續(xù)超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵過程中乙醇生產(chǎn)菌的振蕩現(xiàn)象使得發(fā)酵過程中的底物葡萄糖不能穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化為乙醇，容易造成大量的底物損失和能量消耗，因此，弱化這種振蕩現(xiàn)象對于超高濃度連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)工業(yè)乙醇顯得尤為重要。本發(fā)明利用高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵中進行氣提的方法有效弱化這種酵母細胞的振蕩現(xiàn)象。<利用氣提法弱化發(fā)酵過程中乙醇生產(chǎn)菌的發(fā)酵參數(shù)振蕩行為>待出現(xiàn)1-10個完整的發(fā)酵參數(shù)振蕩周期后，在不改變連續(xù)乙醇發(fā)酵條件的同時啟動氣提裝置，通過轉(zhuǎn)子流量計5a以100-300L/h的速率向發(fā)酵液中通入氣體，大氣泡在攪拌槳的剪切作用下分裂成許多小氣泡，由于氣液兩相的乙醇濃度梯度的驅(qū)動兩相間的乙醇傳遞作用，乙醇在氣相中隨氣泡流入冷凝設(shè)備中得到收集，如此進行乙醇氣提。所述通入氣體為空氣、氮氣或發(fā)酵自產(chǎn)氣體，其中，通入氣體為空氣或氮氣時采用圖I所示的連續(xù)氣提乙醇發(fā)酵裝置；通入氣體為發(fā)酵自產(chǎn)氣時采用圖2所示的連續(xù)自產(chǎn)氣氣提乙醇發(fā)酵裝置。圖I中，通入氣體流速通過轉(zhuǎn)子流量計5a控制，并在通入發(fā)酵罐3前通過設(shè)備6a調(diào)節(jié)濕度，使通入發(fā)酵罐3的氣體中含有飽和的水蒸氣。發(fā)酵罐3中的氣體帶走部分乙醇同時在冷凝管11中被冷凝回收到收集瓶9中，由于發(fā)酵液中乙醇被移除，降低了乙醇對細胞的毒性傷害，乙醇生產(chǎn)菌的乙醇毒害作用得到了緩解，氣提一段時間后發(fā)酵系統(tǒng)趨于穩(wěn)定，發(fā)酵罐3中的乙醇濃度維持在一定的濃度，當(dāng)乙醇生產(chǎn)菌為游離酵母時乙醇濃度維持在47. 36±8. 15%g/L水平，當(dāng)乙醇生產(chǎn)菌為絮凝酵母時維持在75. 56±4. 67%g/L水平，同時發(fā)酵液中的殘余葡萄糖濃度也維持在低于lg/L的水平，這種近似穩(wěn)態(tài)的連續(xù)發(fā)酵狀態(tài)維持不變。直到停止氣提操作后，發(fā)酵系統(tǒng)才漸漸恢復(fù)到之前的周期性振蕩行為(如圖5，圖6，圖7)。通過進水口 12向冷凝管11中流入低溫冷凝液，保持冷凝管11處于0-5°C的溫度范圍，13為出水口，而收集瓶9在冷凝夾套10中保持低溫狀態(tài)。圖2中，氣提氣體為發(fā)酵自產(chǎn)氣，通入氣體流速通過空氣泵2b來調(diào)節(jié)。通過氣體流量計5b向發(fā)酵罐3中通入微量空氣，以維持乙醇生產(chǎn)菌的正常生長，通氣速率控制在O. 05vvm。圖2中其他設(shè)備及功能與圖I中相同。在氣提弱化過程中，通入氣體為氮氣時，所收集得到的乙醇濃度高于通入氣體為空氣時的乙醇濃度。這是因為通入氣體為空氣時，由于空氣中氧氣給超高濃度乙醇發(fā)酵條件下的酵母細胞提供充足的氧氣，使碳流量大量流向生物量合成途徑，有可能會削弱乙醇脅迫在發(fā)酵參數(shù)振蕩過程中的影響，而惰性氣體氮氣對乙醇發(fā)酵沒有影響，所以得到的乙醇濃度高于通入空氣時的乙醇濃度。在氣提弱化過程中，通入氣體為發(fā)酵自產(chǎn)氣時，可以有效防止在使用外源氣體(空氣或氮氣)時的氣體流速較大且氣體中乙醇冷凝不夠徹底而導(dǎo)致部分乙醇隨尾氣排出造成 損失的問題，提高氣提效率而且節(jié)省外源氣體供應(yīng)。絮凝酵母細胞作為乙醇生產(chǎn)菌，由于其獨特的絮凝沉降特性維持發(fā)酵體系中高生物量，從而防止生物量流失以及減少底物葡萄糖合成生物量的消耗，同時減輕流出液乙醇分離過程中生物量去除的能耗，能有效提高乙醇的得率。實施例下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作具體說明。但本發(fā)明不受下述實施例的限制，在符合本發(fā)明前后宗旨的范圍內(nèi)，可對本發(fā)明作適當(dāng)變更。另外，下述實施例中，如無特殊說明，所使用的實驗方法均為常規(guī)方法，所用材料、試劑等均可從生物或化學(xué)公司購買。乙醇生產(chǎn)菌①工業(yè)釀酒酵母菌(Saccharomyces cereviae),購買于美國ATCC菌種庫(ATCCnumber:4126)②基因工程絮凝酵母菌BHLOl (菌種保藏號CGMCC 3408，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)培養(yǎng)基①搖瓶生長培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基中含葡萄糖30g，酵母粉10g，蛋白胨6g，121°C滅菌 20min。②批式發(fā)酵培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基中含葡萄糖120g，酵母粉5g，蛋白胨3g，121°C滅菌 20min。③連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基中含葡萄糖280g，酵母粉5g，蛋白胨3g，110°C滅菌 15min。<乙醇生產(chǎn)菌的培養(yǎng)和超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵 >:用接種環(huán)接入一環(huán)斜面保存(4°C)的乙醇生產(chǎn)菌到含有IOOmL搖瓶生長培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，在旋轉(zhuǎn)式搖床上以300rpm、30°C的條件下培養(yǎng)20h后，接入到發(fā)酵罐3中的批式發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為培養(yǎng)基量的10% (體積百分比)，接種后在轉(zhuǎn)速300rpm、30°C、pH4. 5和通氣量為O. 05vvm的設(shè)定條件下培養(yǎng)，空氣的濕度通過設(shè)備6b調(diào)節(jié)至飽和。培養(yǎng)15h后，每隔12h，測定發(fā)酵液中的殘余葡萄糖濃度，當(dāng)發(fā)酵液中的殘余葡萄糖濃度低于lg/L時，在不改變發(fā)酵條件的情況下，按照0.0271^的速率流加連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基，進行連續(xù)發(fā)酵，每隔12h，測定發(fā)酵液中的發(fā)酵參數(shù)，即生物量和乙醇、殘余葡萄糖的濃度。在連續(xù)發(fā)酵過程中，發(fā)酵參數(shù)出現(xiàn)波動，一段時間后呈現(xiàn)穩(wěn)定的連續(xù)振蕩行為。<氣提弱化發(fā)酵過程中振蕩行為 >:連續(xù)超高濃度乙醇發(fā)酵呈現(xiàn)周期性振蕩行為，等到出現(xiàn)2-3個完整的振蕩周期后，啟動氣提裝置，通過流量器5a，以200L/h的速率通入無菌氣體，一段時間后，發(fā)酵系統(tǒng)維持穩(wěn)定，這種近似穩(wěn)態(tài)的狀態(tài)維持不變，直到停止氣提操作后，發(fā)酵系統(tǒng)才漸漸恢復(fù)到之前的周期性振蕩行為。乙醇和葡萄糖的濃度測定的分析使用常規(guī)液相色譜法。生物量的測定使用恒溫干重法。比較例I游離細胞超高濃度乙醇發(fā)酵體系中發(fā)酵參數(shù)振蕩行為在單級攪拌發(fā)酵罐中進行超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵，按上述方法進行游離酵母細胞 的培養(yǎng)和乙醇發(fā)酵，以O(shè). 0271Γ1的稀釋速率向發(fā)酵液中流加連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基,一段時間后，酵母細胞的發(fā)酵參數(shù)呈現(xiàn)一種長周期大振幅的振蕩行為(圖3)。如圖3所示，發(fā)酵液中殘余葡萄糖、乙醇和生物量濃度分別在179. 70-92. 61g/L、71. 31-31. 4g/L和7. 04-2. 18g/L區(qū)間內(nèi)振蕩，振蕩周期約130h。比較例2絮凝細胞超高濃度乙醇發(fā)酵體系中發(fā)酵參數(shù)振蕩行為在單級攪拌發(fā)酵罐中進行超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵，按上述方法進行絮凝酵母細胞的培養(yǎng)和連續(xù)乙醇發(fā)酵，以O(shè). 0271Γ1的稀釋速率向發(fā)酵液中流加連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基，一段時間后，酵母細胞的發(fā)酵參數(shù)呈現(xiàn)一種長周期大振幅的振蕩行為(圖4)。如圖4所示，發(fā)酵液中殘余葡萄糖、乙醇和生物量濃度分別在212. 21-59. 73g/L、88. 41-25. 37g/L和12. 24-3. 17g/L區(qū)間內(nèi)振蕩，振蕩周期約130h。實施例I在游離細胞超高濃度乙醇發(fā)酵體系中利用空氣弱化振蕩利用在圖I所示的連續(xù)氣體氣提乙醇發(fā)酵裝置，按上述方法進行游離酵母細胞的培養(yǎng)和連續(xù)乙醇發(fā)酵。在進行單級攪拌罐超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵的基礎(chǔ)上，當(dāng)酵母細胞的發(fā)酵參數(shù)出現(xiàn)2-3個完整的振蕩周期后，啟動氣提裝置，通過流量器5a將無菌空氣通入發(fā)酵罐3中，在連續(xù)乙醇發(fā)酵的同時進行乙醇氣提。實驗表明，氣提乙醇很大程度地降低了發(fā)酵液中的乙醇濃度，圖I冷凝收集瓶9中收集的乙醇濃度達到166. 81g/L，乙醇得率達到約25% ;很大程度地弱化單級罐連續(xù)超高濃度發(fā)酵過程中出現(xiàn)的經(jīng)發(fā)酵參數(shù)振蕩，殘余葡萄糖濃度從140. 07±28. 22%降到了 lg/L以下，達到了乙醇發(fā)酵工業(yè)化要求，生物量由4. 02±58. 84%提高到了 32. 37 ±4. 78%，如圖5所示?？諝鈿怏w之前的發(fā)酵參數(shù)以及空氣氣提后的具體發(fā)酵參數(shù)如下表所示
權(quán)利要求
1.一種利用氣提法弱化超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵過程中乙醇生產(chǎn)菌發(fā)酵參數(shù)振蕩的方法，其特征在于，該方法包括 (1)培養(yǎng)乙醇生產(chǎn)菌的步驟； (2)利用乙醇生產(chǎn)菌進行超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵的步驟；和 (3)利用氣提法弱化步驟(2)的過程中乙醇生產(chǎn)菌發(fā)酵參數(shù)振蕩行為的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述乙醇生產(chǎn)菌為工業(yè)釀酒酵母或基因工程絮凝酵母菌BHLOI。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中使用的超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵裝置偶聯(lián)步驟(3)中使用的氣提裝置。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，在步驟(2)所述超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵中使用的連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為250g/L 350g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基的稀釋速率為O.012-0. 03611'
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，在步驟(3)所述的氣提法中所用的氣體為氮氣、空氣或發(fā)酵自產(chǎn)氣體，氣提原料液為乙醇生產(chǎn)菌的發(fā)酵液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法，其特征在于，當(dāng)發(fā)酵液的發(fā)酵參數(shù)出現(xiàn)1-10個完整的振蕩周期后，啟動氣提裝置，通入氣提氣體，氣體流速為100-300L/h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用氣提技術(shù)弱化超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵過程中乙醇生產(chǎn)菌發(fā)酵參數(shù)振蕩的方法，該方法包括(1)培養(yǎng)乙醇生產(chǎn)菌的步驟；(2)利用乙醇生產(chǎn)菌進行超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵的步驟；和(3)利用氣提法弱化連續(xù)乙醇發(fā)酵過程中乙醇生產(chǎn)菌發(fā)酵參數(shù)振蕩行為的步驟。本發(fā)明的方法，在不增加設(shè)備投資的前提下，有效地實現(xiàn)了單級罐超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵并且控制殘余葡萄糖濃度低于1g/L，達到工業(yè)生產(chǎn)要求，為超高濃度連續(xù)乙醇發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)提供了新的技術(shù)支持。
文檔編號C12P7/06GK102876728SQ201210375688
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月27日
發(fā)明者薛闖, 王亮, 白鳳武 申請人:大連理工大學(xué)