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好好芭ScMnSOD基因的CDS序列及應用的制作方法

文檔序號:413868閱讀:643來源:國知局
專利名稱:好好芭ScMnSOD基因的CDS序列及應用的制作方法
技術領域
本發(fā)明屬于基因工程領域,具體地說,涉及好好芭ScMnSOD基因的⑶S序列及應用。
背景技術
在自然界中,導致作物低產的非生物脅迫因子有很多,例如,干旱、鹽潰、低溫等經常會影響植物的正常生長和發(fā)育過程,打破了植物正常的生理、生化代謝平衡,給植物造成嚴重傷害,甚至導致植株死亡。在這些非生物脅迫因子中危害最大的是干旱,由其導致的損·失僅低于生物脅迫即病蟲害。據文獻報道,全球大約36%的土地處于干旱、半干旱地區(qū),占耕地面積的43%。在我國,約占國土面積1/2的土地處于干旱和半干旱地區(qū),特別是我國年降水季節(jié)分配不均且量少的北部和西部,遭受的干旱脅迫十分嚴重,這也是導致西部經濟不發(fā)達的一個重要原因。干旱除了會對農作物造成低產,還會對生態(tài)環(huán)境造成危害。河流干涸、沙塵暴、草地退化、森林銳減、湖泊濕地減少以及生物量和生物多樣性急劇下降等這一系列由干旱導致的生態(tài)環(huán)境危機己經對人類社會的可持續(xù)發(fā)展構成了嚴重威脅,并引起了社會的全面關注。另外,城市土地面積隨著城市化步伐的加快而擴大,從而增強了對城市綠化植物的需求,同時,城市水資源的消耗也逐漸增大。目前我國水資源緊缺的地區(qū)有很多,性狀優(yōu)良但有著較大耗水量的植物在城市綠化中難以得到廣泛推廣。因此,水資源匱乏嚴重制約了我國城市綠化進程的發(fā)展。干旱嚴重影響著植物的正常生長發(fā)育和代謝,并阻礙著我國農業(yè)發(fā)展、生態(tài)環(huán)境建設及城市綠化建設的發(fā)展。因此,當前植物育種中的一個迫切需求和重要目標是提高植物的干旱耐受能力。引種、馴化、雜交、品種比較觀察和選育等是常規(guī)植物抗旱工程研究的主要方法,然而這些方法耗時長,效果不明顯。不同于常規(guī)育種,采用基因工程技術將抗旱基因重組到植物基因組中,植物的干旱耐受能力有可能在短期內得到提高,而且品種固有的優(yōu)良性狀仍會得到遺傳,因此,這種方法在植物抗旱研究中得到了廣泛應用,對我國開展抗旱植物育種工作具有十分重大的現實意義。好好色(Simmondsia Chinensis)是原產于北美的一種多年生常綠灌木,主要分布在索羅蘭沙漠,具有耐干旱,鹽堿、高溫等特點。好好芭能在荒山、丘陵、沙漠地區(qū)生長,起到防風固沙的作用,因此好好芭還具有重要的生態(tài)價值。好好芭油可以作為抹香鯨油的替代品,并且具有自身的特點無魚腥味,原油不含硬脂酸,用于工業(yè)時幾乎不用處理,被稱為“液體黃金”,可用于國防機械、民用機械、日化工業(yè)以及醫(yī)藥領域,具有重要的經濟價值。目前關于好好芭的研究大多集中在好好芭油上,而對于好好芭的抗逆機理研究很少。由于好好芭是一種優(yōu)良的資源植物,它有很強的環(huán)境脅迫適應能力,有極高的干旱耐受性和抵御沙漠高溫、高熱的能力,同時它還能耐受瘠薄土壤和抵抗鹽堿,適合在荒山、丘陵、沙地等干旱半干旱地區(qū)種植,是保護生態(tài)環(huán)境的重要的種質基因資源植物。因此,研究好好芭抗逆資源基因的功能及調控機制,從而為抗旱作物育種提供新的基因資源,具有現實的理論意義和實際應用價值。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供好好芭ScMnSOD基因的⑶S序列及應用。為了實現本發(fā)明目的,本發(fā)明的好好色(Simmondsia Chinensis) ScMnSOD基因的⑶S序列,其具有i)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列;或ii)SEQ ID No.1所示核苷酸序列經取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸且同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。例如,將SEQ ID No.1中的第6位A替換為C,或是將第694飛96位TAA缺失,或是在第387位添加ACA均不會影響該基因的功能。經證實,本發(fā)明克隆得到的ScMnSOD基因的⑶S序列,其表達產物定位于線粒體
中。本發(fā)明還提供由上述ScMnSOD基因的⑶S序列編碼的蛋白。該蛋白具有超氧化物歧化酶(SOD)活性。本發(fā)明還提供含有上述ScMnSOD基因的⑶S序列的載體。優(yōu)選出發(fā)載體為植物雙元表達載體。本發(fā)明還提供含有上述ScMnSOD基因的⑶S序列的轉基因細胞系。本發(fā)明還提供含有上述ScMnSOD基因的⑶S序列的工程菌。本發(fā)明還提供上述ScMnSOD基因的⑶S序列在提高轉基因植物抗逆性中的應用。所述抗逆性是指抗旱性、抗寒性、抗鹽性及抗氧化脅迫能力。優(yōu)選抗逆性是指抗旱性。優(yōu)選所述植物為擬南芥。本發(fā)明進一步提供上述ScMnSOD基因的⑶S序列在抗旱作物育種中的應用。本發(fā)明首次從優(yōu)良的資源植物一好好芭中克隆得到干旱高表達基因ScMnSOD,并對其表達產物的生化活性進行了分析。本發(fā)明利用轉基因技術在野生型擬南芥中過表達ScMnSOD基因的⑶S序列,結果表明,過表達ScMnSOD基因的⑶S序列可提高擬南芥的抗旱,這為充分利用好好芭SOD基因資源提供理論基礎和技術支持,為抗旱作物育種提供新的基因資源。同時,也為進一步研究好好芭其他抗逆資源基因的功能及調控機制開辟了新思路。具有現實的理論意義和實際應用價值。


圖1為本發(fā)明實施例2中重組質粒pCAMBIA1302-ScMnS0D-GFP的Bln I /Nco I酶切產物鑒定結果;其中,I為酶切產物,M為DNAMarker DL2000。圖2為本發(fā)明實施例2中ScMnSOD-GFP亞細胞定位分析結果;其中,A :轉GFP擬南芥根DAPI染色;B GFP在擬南芥中的表達;C :A、B疊加效果;D :轉ScMnSOD-GFP擬南芥根毛Janu’ s green B染色;E =ScMnSOD-GFP在擬南芥根毛中的表達;F :D、E疊加效果。圖3為本發(fā)明實施例3中pET28 (a)-ScMnSOD重組質粒的EcoR I /Sal I酶切產物鑒定結果;其中,I為酶切產物,M為DNA MarkerDL2000。圖4為本發(fā)明實施例3中原核表達的ScMnSOD蛋白經SDS-PAGE檢測結果;其中,1-5分別為未誘導、誘導lh、2h、3h和純化的His6-ScMnS0D蛋白,M為蛋白分子量標準。圖5為本發(fā)明實施例3中原核表達的ScMnSOD蛋白酶活測定結果;其中,A為ScMnSOD蛋白酶活抑制率曲線;B為ScMnSOD蛋白酶活趨勢方程。圖6為本發(fā)明實施例4中轉ScMnSOD基因⑶S序列的擬南芥植株在土壤干旱處理下的表型。圖7為本發(fā)明實施例4中轉ScMnSOD基因⑶S序列的擬南芥干旱處理后植物存活率。圖8為本發(fā)明實施例4中轉ScMnSOD基因⑶S序列的擬南芥干旱處理后葉片含水量情況;其中,A為野生型擬 南芥和過表達ScMnSOD擬南芥葉片含水量測定,B為野生型擬南芥和過表達ScMnSOD擬南芥葉片失水速率測定,C為野生型擬南芥和過表達ScMnSOD擬南芥葉片ROS含量測定。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明,但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明,實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段,所用原料均為市售商品。以下實施例均按照常規(guī)實驗條件,如Sambrook等分子克隆實驗手冊(New York:Gold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)等。以下實施例中涉及的材料、菌株及載體哥倫比亞野生型擬南芥,大腸桿菌DH5 α、大腸桿菌BL21及農桿菌GV3101購自Transgene,pMD18_T購自TaKaRa公司,pET-28 (a)購自 Novagen, pCAMBIA1302 購自 CAMBIA 公司。以下實施例中涉及的試劑限制性內切酶、限制性內切酶Bln I ,Nco I ,EcoR1、Sal1、Hind II1、Spe I 和 T4DNA Ligase 購自 TaKaRa 公司;DNA Marker 購自廣州東盛生物公司;抗生素、IPTG購自Sigma公司,X-Gluc購自BBI,超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒-WST購自日本同仁化學研究所,Genome Walking Kit購自TaKaRa公司。實施例1好好芭ScMnSOD基因的⑶S序列的克隆前期對好好色(Simmondsia Chinensis)葉片進行脫水處理,然后提取RNA并反轉錄合成cDNA,采用抑制消減雜交(SSH)方法富集差異表達基因,構建消減文庫,用放射性雜交方法篩選文庫,測序后得到大量EST片段。從中選取ScMnSOD基因EST片段,根據片段序列設計上游引物 Pl :5’ -CTCCCAAACATCTATACCAAGCAAACGG-3’,下游引物 P2 :3’ -CGAACTGTTGTCATCTGCGTAGCGGGAA-5’。采用 Plant RNeasy Kit (Qiagen)提取好好芭幼嫩葉片總 RNA,然后采用Clontech的SMART RACE cDNA Amplification Kit按照試劑盒說明書分別進行3’ RACE和5’ RACE,對PCR產物分別測序。拼接3’ RACE和5’ RACE測序結果,獲得全長好好芭 ScMnSOD 基因的 CDS 序列(SEQ ID NO.1)。實施例2好好芭ScMnSOD基因的⑶S序列表達產物的亞細胞定位 通過PCR法,分別在ScMnSOD的cDNA編碼區(qū)的5 ^和:V端添加Bln I和Nco I酶切位點,然后與經相應酶切的PCAMBIA1302-GFP載體(CAMBIA公司)連接,轉化大腸桿菌,篩選陽性克隆。酶切消化重組質粒pCAMBIA1302-ScMnS0D-GFP,電泳檢測,結果顯示,重組載體的插入片段大小約為700bp,和預期的ScMnSOD的cDNA編碼區(qū)大小相符(圖1)。測序進一步證實了載體構建的正確性。采用蘸花法轉化野生型擬南芥,分別篩選、鑒定轉35S: :GFP, 35S: :ScMnS0D-GFP的陽性轉基因植株。將消毒后的陽性植株種子種植于MS培養(yǎng)基上,取陽性植株幼苗的根來觀察目的蛋白在細胞內的定位情況。將轉35S: :GFP的陽性苗幼根置于0. 1%的TBST溶液中浸泡3次,每次5min,然后用200ng/DAPI染色5min,制成裝片與熒光顯微鏡下觀察。結果顯示,GFP在細胞質、細胞核中均有表達。將轉35S: =ScMnSOD-GFP的陽性苗幼根置于
0.02%詹姆斯綠B染液中染色lOmin,然后制作裝片置于顯微鏡下觀察,結果顯示ScMnSOD在線粒體中表達(圖2)。實施例3ScMnS0D蛋白表達、純化及酶活鑒定將帶有EcoR I和Sal I酶切位點的ScMnSOD基因的PCR擴增產物經EcoR I和Sal I酶切后亞克隆至pET-28(a)載體上,使它們處于His6標簽的C端,構建成pET28 (a)-ScMnSOD重組載體,酶切鑒定(圖3)。結果顯示,表達質粒中包含的插入片段,與目的基因片段的cDNA編碼區(qū)長度大小相符。序列測定進一步證實了構建載體的正確性。 將pET28 (a) -ScMnSOD質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3),在含有卡那霉素(50 u g/ml)的LB平板上篩選轉化子。挑取單菌落,經液體培養(yǎng)和ImM IPTG誘導融合蛋白的表達,菌體和裂解液上清經15%SDS-PAGE,考馬斯亮藍G250染色,在約30kD處有一條明顯的誘導條帶,與預期的His6-ScMnS0D蛋白分子量完全符合。融合蛋白His6-ScMnS0D存在于細菌裂解液上清中,為可溶性蛋白。離心收集IPTG誘導培養(yǎng)4h的轉化子,按照Ni2+-NTA說明書,在非變性條件下純化融合蛋白His6-ScMnS0D。經SDS-PAGE檢測,表明融合蛋白成功從菌體總蛋白中分離,且條帶位置正確(圖4)。結果表明,His6-ScMnS0D可以在原核細胞中正確表達,并能在非變性條件下以可溶蛋白的形式純化獲得。為準確測定每毫克SOD蛋白的酶活,采用Bradford法對純化蛋白的濃度進行測定。然后采用日本同仁化學研究所研制的超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒-WST,對純化蛋白的SOD酶活進行測定。按照試劑盒說明書計算出各樣品蛋白的抑制率,繪制各純化蛋白樣品的抑制率曲線,并選擇50%抑制率上下兩點的數值做出趨勢方程(圖5A、圖5B),計算純化蛋白的酶活,公式如下酶活=1/(IC50X20U IX 蛋白濃度)最后得出純化蛋白的酶活為1189. 91U/mg,該結果顯示ScMnSOD基因表達產物具有SOD酶活。實施例4轉ScMnSOD基因⑶S序列的擬南芥抗旱性分析I 土壤干旱處理下轉基因擬南芥表性分析分別對野生型及轉基因擬南芥種子進行消毒,均勻點種于MS固體培養(yǎng)基平板上,4°C春化3d。然后置于恒溫22°C,光照16h/黑暗8h的培養(yǎng)箱中。一周后,將生長狀況一致的幼苗移至盆中(營養(yǎng)土 蛭石=3:1),置于空氣濕度為509T60%,22°C恒溫,光照16h/黑暗8h條件的培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)兩周。然后對苗子進行干旱處理,直到大部分苗子出現脫水致死的現象發(fā)生,然后對苗子進行正常澆水,3d后照相記錄表型,7d后統(tǒng)計存活的擬南芥植株,并比較分析各類擬南芥植株的表型差異。2轉基因擬南芥葉片含水量及ROS含量分析取生長4周的野生型及轉基因擬南芥植株的大小相近的蓮座葉片90片,分成三組,稱鮮重,然后將葉片置于光下自然脫水6h,稱重。然后置于烘箱中72h至恒重,稱干重,計算葉片含水量并作顯著性分析,并測定失水速率。將生長4周、長勢相近的野生型及轉基因擬南芥停止?jié)菜甀周,然后取相同位置的蓮座葉片于液氮中研磨,稱取粉末IOOmgJP Iml冰冷的生理鹽水,1000g,4°C離心lOmin,取上清液,按照組織活性氧(ROS)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書測定擬南芥葉片中活性氧(ROS)相對含量,實驗重復三次。對轉基因擬南芥純合體的干旱敏感表型進行分析,將在MS培養(yǎng)基平板上生長勢均一的擬南芥植株移植營養(yǎng)土上,每小盆種植10棵幼苗,每種材料6盆,將不同材料的小盆放置到同一個托盤中,覆保鮮膜3d。揭膜后定量澆水,將待幼苗生長2周左右充分澆水,待土壤完全吸水后撤掉托盤中剩余的水分,植株停止?jié)菜_始干旱處理。所有材料隨機擺放,每天移動位置,觀察突變體與野生型在干旱處理過程中的生長情況。在停止?jié)菜甀ld后,此時野生型和過表達植株生長狀況相對良好,沒有出現萎蔫現象。在停止?jié)菜?4d后,野生型擬南芥已經部分開始萎蔫,此時轉基因擬南芥少數開始萎蔫。在干旱19d后開始恢復澆水,野生型擬南芥絕大部分已萎蔫致死,部分轉基因擬南芥還能生長?;謴蜐菜?d后照相,野生型擬南芥只有少數能恢復生長,而轉基因擬南芥恢復生長的數目相對較多(圖 6)。因此認為過表達ScMnSOD擬南芥表現出干旱耐受,推測ScMnSOD與干旱脅迫相關。恢復澆水7d后統(tǒng)計植株存活率,統(tǒng)計結果也表明,過表達ScMnSOD基因植株表現出干旱耐受性狀(圖7),主要表現為在干旱處理過程中過表達植株存活數量明顯大于野生型。這提示ScMnSOD基因在植物耐受干旱過程中起到了積極作用。植物耐受干旱能力差異主要反映在兩方面,一方面是吸水能力的差異,主要是植物根系從土壤中攝取水分的能力,正常情況下植株體內的水分含量可以反映植物根系吸水能力的差異;另一方面是植物保水能力的差異,主要是在干旱脅迫下植物維持內部水分能力的差異,可以通過水分散失速率的差異來衡量。本發(fā)明分析野生型和轉基因擬南芥植株在含水量及失水速率方面的差異,以期解釋野生型和轉基因擬南芥植株之間存在干旱耐受差異的主要原因。分析了生長4周的野生型和過表達ScMnSOD擬南芥蓮座葉片含水量的差異。取植株的大小相近的蓮座葉片90片,分成三組,稱鮮重,然后將葉片置于光下自然脫水6h,稱重。然后置于烘箱中72h至恒重,稱干重,計算葉片含水量并作顯著性分析。結果顯示,野生型和轉ScMnSOD基因擬南芥的吸水能力沒有顯著差異,而干燥6h后野生型葉片的含水量低于轉ScMnSOD葉片的含水量(圖8A),表明二者在正常情況下的吸水能力也沒有差異,引起二者對干旱敏感的原因在于二者之間的保水能力存在差異。為驗證這一推論,又進行了離體葉片失水速率的測定。材料為在土壤中生長4周左右的植株葉片,在取樣前一天充分澆水,使野生型和轉基因擬南芥材料都完全吸水,次日取相應材料的大小一致的離體蓮座葉片各90片分成3組,平鋪在不帶蓋子的培養(yǎng)皿中,放置在自然光下進行葉片失水實驗,每30min稱重一次,共6h,分析稱重結果,計算水分散失速率和葉片相對鮮重。結果顯示,野生型葉片水分散失速率大于轉基因擬南芥葉片,自然干燥6h,野生型已喪失53%的水分,而轉ScMnSOD基因擬南芥葉片喪失了約45%的水分(圖8B)。該結果說明ScMnSOD基因的過表達可提高擬南芥的保水能力,提示MnSOD在植物耐旱過程中起到了重要的作用。干旱脅迫造成了植物代謝生理過程的紊亂,能引起植物細胞內ROS的大量積累。為研究在干旱脅迫過程中對野生型和轉基因擬南芥葉片ROS含量的差異,檢測了野生型和過表達ScMnSOD擬南芥葉片ROS量。將生長4周、長勢相近的擬南芥干旱脅迫I周,然后取相同位置的蓮座葉片于液氮中研磨,稱取粉末IOOmgJp Iml冰冷的生理鹽水,lOOOg,4°C離心lOmin,取上清液,按照試劑盒說明書測定擬南芥葉片中ROS相對含量,實驗重復三次。結果顯示,在干旱脅迫前野生型和轉基因擬南芥葉片之間ROS含量差異不顯著,但是野生型擬南芥葉片的ROS含量要高于轉基因擬南芥葉片ROS含量。在干旱脅迫后,擬南芥葉片的ROS含量均提高,其中轉基因擬南芥葉片中ROS含量明顯低于野生型擬南芥葉片ROS含量(圖SC)。以上結果表明,ScMnSOD在清除由干旱脅迫產生的ROS過程中發(fā)揮著重要的作用。雖然,上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述,但在本發(fā)明基礎上,可以對之作一些修改或改進,這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此,在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進,均屬于本發(fā)明要求保護的范圍?!?br> 權利要求
1.好好色(SimmondsiaChinensis) ScMnSOD 基因的 CDS 序列,其具有 i)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列;或 ii)SEQID No.1所示核苷酸序列經取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸且同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。
2.由權利要求1所述ScMnSOD基因的⑶S序列編碼的蛋白。
3.含有權利要求1所述ScMnSOD基因的CDS序列的載體。
4.根據權利要求3所述的載體,其出發(fā)載體為植物雙元表達載體。
5.含有權利要求1所述ScMnSOD基因的CDS序列的轉基因細胞系。
6.含有權利要求1所述ScMnSOD基因的⑶S序列的工程菌。
7.權利要求1所述ScMnSOD基因的CDS序列在提高轉基因植物抗逆性中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用,其特征在于,所述抗逆性是指抗旱性、抗寒性、抗鹽性及抗氧化脅迫能力。
9.根據權利要求8所述的應用,其特征在于,抗逆性是指抗旱性。
10.根據權利要求7-9任一項所述的應用,其特征在于,所述植物為擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明涉及好好芭(Simmondsia Chinensis)ScMnSOD基因的CDS序列及應用,所述基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明利用轉基因技術在野生型擬南芥中過表達ScMnSOD基因的CDS序列,結果表明,過表達ScMnSOD基因的CDS序列可提高擬南芥的抗旱性,這為充分利用好好芭SOD基因資源提供理論基礎和技術支持,為抗旱作物育種提供新的基因資源。同時,也為進一步研究好好芭其他抗逆資源基因的功能及調控機制開辟了新思路。具有現實的理論意義和實際應用價值。
文檔編號C12N1/15GK102994523SQ20121037573
公開日2013年3月27日 申請日期2012年9月29日 優(yōu)先權日2012年9月29日
發(fā)明者張根發(fā), 劉肖飛 申請人:北京師范大學
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