一種分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于腫瘤基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，涉及一種膠質(zhì)瘤標(biāo)本中分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞的方法。本發(fā)明的方法包括將腫瘤組織用機(jī)械法聯(lián)合酶消化法制成細(xì)胞懸液；密度梯度離心法，富集篩選出較高純度的CD11b+的小膠質(zhì)細(xì)胞，然后用CD11b+磁珠進(jìn)一步分選獲得高純度的小膠質(zhì)細(xì)胞；其中，Percoll分離液由70%的Percoll、30%的Percoll和HBSS組成。本發(fā)明優(yōu)化的percoll密度梯度離心法富集小膠質(zhì)細(xì)胞的純度可達(dá)95%以上，且免疫熒光和吞噬實(shí)驗(yàn)等也證實(shí)其具有良好的功能；本發(fā)明的方法具有操作簡(jiǎn)便易行、成本較低、質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，為進(jìn)一步研究腦膠質(zhì)瘤中小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫功能及在腫瘤的免疫逃逸中的作用研究提供了基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】一種分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于腫瘤基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，涉及一種分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞的方法，尤其涉及從離體的新鮮膠質(zhì)瘤標(biāo)本中分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞的方法；該方法結(jié)合Percoll密度梯度離心法與磁珠分選法，通過(guò)免疫磁珠標(biāo)記CDllb從新鮮膠質(zhì)瘤標(biāo)本中分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞，并在體外培養(yǎng)擴(kuò)增，為小膠質(zhì)細(xì)胞與腫瘤免疫逃逸的關(guān)系研究提供基礎(chǔ)。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了目前腦膠質(zhì)瘤是發(fā)病率最高的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，其具有生存期短、復(fù)發(fā)率及死亡率高等特點(diǎn)。有統(tǒng)計(jì)顯示,腦腫瘤是實(shí)體瘤患兒死亡的首要疾病,膠質(zhì)瘤占兒童腫瘤構(gòu)成比的1/5左右，成人膠質(zhì)瘤占原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤的50%~60%。盡管近年來(lái)的綜合治療(包括手術(shù)、放療、化療)取得了進(jìn)步，但膠質(zhì)母細(xì)胞瘤2年的生存率為27.2%，5年僅為9.8%。由于免疫治療具有抗腫瘤的精確性和可持續(xù)性等可能的潛在優(yōu)勢(shì)，故近年來(lái)對(duì)膠質(zhì)瘤免疫逃逸機(jī)制及免疫治療的研究成為膠質(zhì)瘤應(yīng)用基礎(chǔ)研究中發(fā)展最為迅速的領(lǐng)域之一。
[0003]小 膠質(zhì)細(xì)胞(Microglia)是膠質(zhì)瘤組織中浸潤(rùn)的主要免疫細(xì)胞。有研究采用流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織中約1/3的細(xì)胞表達(dá)小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記(CDllb/c)，其遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了膠質(zhì)瘤組織中其他免疫細(xì)胞的數(shù)量。所述小膠質(zhì)細(xì)胞與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的先天性和獲得性免疫反應(yīng)相關(guān)，在生理?xiàng)l件下，小膠質(zhì)細(xì)胞呈分枝狀并一直監(jiān)視其周圍的微環(huán)境，一旦被激活，其將對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷做出反應(yīng)并分泌炎性因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，吞噬受損的細(xì)胞及碎片，乃至呈遞抗原。
[0004]基于小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理生理中的重要作用，最近有若干研究關(guān)注于人小膠質(zhì)細(xì)胞的分離，以便探索其在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用；然而，目前大多數(shù)的分離方法都花費(fèi)相當(dāng)多的時(shí)間用生長(zhǎng)因子(如M-CSF、GM-CSF)刺激培養(yǎng)細(xì)胞；其中，Gibbons等認(rèn)為，若要獲得理想的純度和質(zhì)量，勢(shì)必要從分子生物學(xué)的角度分析小膠質(zhì)細(xì)胞的表型(Int J Biochem Cell Biol，2010，42:844 - 856) ;Dick 和 Hussain 分別于 1997 年和2006年介紹了從新鮮組織中分離小膠質(zhì)細(xì)胞的方法，但是并未涉及小膠質(zhì)細(xì)胞的分離純度(AIDS，1997，11:1699 - 1708 ；Neuro Oncol, 2006a, 8:261 - 279) ;2010 年，Adam Wu 采用Percoll密度梯度離心法分離人腦膠質(zhì)瘤組織中的小膠質(zhì)細(xì)胞(Neuro Oncol, 2010, 12
(11):1113-1125)。新近，荷蘭科學(xué)家Marta等提供了從尸體腦組織中分選小膠質(zhì)細(xì)胞的途徑，并且也采用了 percoll密度梯度離心聯(lián)合磁珠分選的辦法(GLIA，2012，60:96-111),但其中采用的機(jī)械剪切組織制備細(xì)胞懸液，仍存在細(xì)胞得率低及損傷較大的缺點(diǎn)，雖然Cardona等建立了從鼠腦組織中提取小膠質(zhì)細(xì)胞的方法，并且達(dá)到了近100%的純度(NatProtoc，2006，1:1947 - 1951 )，但目前為止，如何高效的從人的新鮮膠質(zhì)瘤標(biāo)本中獲得高純度的小膠質(zhì)細(xì)胞仍然存在較大困難。
[0005]迄今為止，尚未見(jiàn)有關(guān)結(jié)合Percoll密度梯度離心法與磁珠分選法，通過(guò)免疫磁珠標(biāo)記CDllb有效地從新鮮膠質(zhì)瘤標(biāo)本中分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞，并在體外培養(yǎng)擴(kuò)增的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞的方法，尤其是從離體的新鮮膠質(zhì)瘤標(biāo)本中分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞的方法；該方法結(jié)合Percoll密度梯度離心法與磁珠分選法，通過(guò)免疫磁珠標(biāo)記CDllb有效地從離體的新鮮膠質(zhì)瘤標(biāo)本中分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞，并在體外培養(yǎng)擴(kuò)增，為小膠質(zhì)細(xì)胞與腫瘤免疫逃逸關(guān)系的研究提供重要的基礎(chǔ)。
[0007]本發(fā)明中，首先采用機(jī)械剪切聯(lián)合酶消化的方法提高細(xì)胞得率及減小細(xì)胞損傷，具有操作簡(jiǎn)便、效果顯著的特點(diǎn)。
[0008]本發(fā)明中，結(jié)合Percoll密度梯度離心法與磁珠分選法，從離體的新鮮膠質(zhì)瘤標(biāo)本中分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞，其中的Percoll為包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒；其滲透壓低? 20mosm/kg H20),粘度小,可形成高達(dá)1.3g/ml密度,采用預(yù)先形成的密度梯度時(shí)可在低離心力(200~1000g)于數(shù)分至數(shù)十分鐘內(nèi)達(dá)到滿意的細(xì)胞分離效果；由于Percoll擴(kuò)散常數(shù)低，所形成的梯度較穩(wěn)定；此外，Percoll不穿透生物膜，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害，可用于分離細(xì)胞、亞細(xì)胞成分、細(xì)菌及病毒，以及將受損細(xì)胞及其碎片與完好的活細(xì)胞分離；
[0009]本發(fā)明中，采用免疫磁珠分選系統(tǒng)(Magnetic Cell Sorting, MACS)用于細(xì)胞分離，該技術(shù)的核心是在磁珠表面包被抗體，直接與靶細(xì)胞的相應(yīng)抗原分子或間接與事先結(jié)合在靶細(xì)胞表面的抗體進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，在外加磁場(chǎng)中，結(jié)合了磁珠的細(xì)胞會(huì)與其他未被結(jié)合的細(xì)胞分離，當(dāng)超強(qiáng)順磁性的磁珠脫離磁場(chǎng)后會(huì)立即消失磁性，此時(shí)可提取或去除所標(biāo)記的細(xì)胞，從而達(dá)到陽(yáng)性或陰性分選的目的；所述MACS具有孵育時(shí)間短、操作過(guò)程快、不影響細(xì)胞在流式檢測(cè)中 的散射特性與細(xì)胞的功能和活性等優(yōu)點(diǎn)，而且，磁珠會(huì)在細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中生物降解，而無(wú)需再進(jìn)行專門(mén)的去除。
[0010]本發(fā)明的分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞的方法，包括如下步驟:
[0011]第一步，結(jié)合物理分離和酶的消化作用，將膠質(zhì)瘤標(biāo)本制成單細(xì)胞懸液，比單一方式能更多的獲得保持細(xì)胞活性的細(xì)胞；
[0012]第二步，通過(guò)不同濃度Percoll溶液分離，富集小膠質(zhì)細(xì)胞，并將其與髓磷脂及紅細(xì)胞碎片等分開(kāi)；
[0013]第三步，利用免疫磁珠分選CDllb陽(yáng)性的細(xì)胞，提高小膠質(zhì)細(xì)胞的分離純度；
[0014]本發(fā)明方法中，采用流式細(xì)胞術(shù)檢驗(yàn)每一步驟所得細(xì)胞的純度，以活細(xì)胞中CDllb+細(xì)胞的比例表示小膠質(zhì)細(xì)胞的純度:其中第一步所得細(xì)胞中有30%的CDllb+的小膠質(zhì)細(xì)胞，第二步所得細(xì)胞中有80%左右的CDllb+的小膠質(zhì)細(xì)胞，第三步則收獲純度高達(dá)95%以上的⑶IIb+的小膠質(zhì)細(xì)胞；
[0015]本發(fā)明方法中，還采用免疫熒光方法，定性直觀地觀察最后獲得的細(xì)胞中小膠質(zhì)細(xì)胞的另一經(jīng)典標(biāo)記Iba-1染色的情況，結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)的一致。
[0016]更具體的，本發(fā)明的一種分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于，其包括步驟:
[0017](I)將離體的新鮮腦膠質(zhì)瘤組織用機(jī)械剪切結(jié)合酶消化的方法制成單細(xì)胞懸液，取少量細(xì)胞懸液用CDllb流式抗體檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞的純度；
[0018](2)按優(yōu)化后的方法配置不同密度Percoll分離液(70%和30%)；[0019](3)將制成的單細(xì)胞懸液離心后去上清，細(xì)胞用70%perCO114ml重懸成單細(xì)胞懸液，加入15ml的離心管,然后依序加入30%percoll液及HBSS層；500g, 30min, 4°C，低加減速度進(jìn)行離心；取少量細(xì)胞懸液用CDllb流式抗體檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞的純度；
[0020](4)吸取離心后的percoll70%和30%交界處細(xì)胞，加入PBSlOml, 1200rpm,室溫，離心5分鐘，去上清；
[0021](5)除了取少量細(xì)胞進(jìn)行CDllb流式抗體檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞的純度外，其余細(xì)胞繼續(xù)后續(xù)的磁珠分選純化操作；
[0022](6)用80iUMACS緩沖液重懸上述步驟所得細(xì)胞，加入包被抗人⑶Ilb抗體的免疫磁珠20iU，4°C放置15分鐘，加入Iml MACS緩沖液重懸細(xì)胞，離心去除未結(jié)合的磁珠抗體，棄上清，重新用500 u IMACS緩沖液重懸細(xì)胞，500 U I/次緩沖液預(yù)洗MS磁性分選柱2次后，將500ii I細(xì)胞懸液過(guò)柱，500 ii I緩沖液洗柱兩次，去除非標(biāo)記陰性細(xì)胞，移柱出磁場(chǎng)，用ImlMACS緩沖液洗柱，收集洗液即為陽(yáng)性細(xì)胞；再次用CDllb流式抗體檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞的純度；
[0023](7)將上述步驟獲得的小膠質(zhì)細(xì)胞用含血清及GM-CSF的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，2-3天更換培養(yǎng)基I次。
[0024]本發(fā)明的方法中，所述離體的新鮮的腦膠質(zhì)瘤組織須放置于冰上并于20小時(shí)之內(nèi)處理；用量為每管取2-3g腦膠質(zhì)瘤組織；所述的腦膠質(zhì)瘤組織采用機(jī)械剪切聯(lián)合木瓜酶消化進(jìn)行處理；
[0025]本發(fā)明方法中，通過(guò)下述步驟制備不同濃度的Percoll溶液:
[0026]先用9份Percoll與1份HBSS混合達(dá)到生理性滲透壓，然后用HBSS稀釋到所需濃度；其中，涉及以下不同·濃度 70% (密度 1.090g/ml)、40% (1.056g/ml),30% (1.043g/ml)的Percoll溶液，優(yōu)選采用70%與30%兩個(gè)濃度不連續(xù)密度梯度Percoll層法進(jìn)行富集小膠質(zhì)細(xì)胞，本發(fā)明的實(shí)施例中，聯(lián)合70%、40%、30%三個(gè)濃度分離，然后用流式細(xì)胞術(shù)分析相應(yīng)分離界面的細(xì)胞比例，結(jié)果顯示，30%與40%界面以及40%與70%界面⑶I Ib+小膠質(zhì)細(xì)胞比例可達(dá)70%左右，紅細(xì)胞多位于試管底部，細(xì)胞碎片和髓磷脂多位于30%與HBSS界面；用70%與30%兩個(gè)濃度不連續(xù)密度梯度Percoll層法進(jìn)行富集小膠質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果顯示，30%與70%界面⑶Ilb+小膠質(zhì)細(xì)胞比例可達(dá)80%左右；結(jié)果表明，本方法采用70%與30%兩個(gè)濃度不連續(xù)密度梯度Percoll層法進(jìn)行富集小膠質(zhì)細(xì)胞，簡(jiǎn)化了配置多種Percoll溶液的繁瑣操作，比目現(xiàn)有技術(shù)的percoll密度梯度法能更好的富集所需細(xì)胞。
[0027]本發(fā)明方法的步驟(2)中，配置2個(gè)不同密度Percoll分離液底部一層為70%Percoll 液 4ml，中間一層為 30%Percoll 液 8ml,最上一層為 2ml 的 HBSS ；
[0028]本發(fā)明所述方法的步驟(1)、(3)、(6)中，每管細(xì)胞數(shù)105個(gè)/lOOul，CDlIb-APC (eBioscience)及同型對(duì)照分別5ul/管，4°C孵育15分鐘，PBS洗2遍后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中CDllb+小膠質(zhì)細(xì)胞的比例；
[0029]本發(fā)明所述方法的步驟(7 )，在1640+10%FBS含血清培養(yǎng)基中添加50U/ml的GM-CSF細(xì)胞因子，制備成小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0030]本發(fā)明進(jìn)一步檢測(cè)了獲得的小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫表型及吞噬功能；
[0031]所述小膠質(zhì)細(xì)胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)3天后，細(xì)胞形態(tài)均一，與已知的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)契合；利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了小膠質(zhì)細(xì)胞表面的免疫分子HLA-DR、⑶40、⑶80、⑶86、B7-H1、B7-H4等的表達(dá)情況；通過(guò)對(duì)E.coli顆粒的吞噬功能實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，小膠質(zhì)細(xì)胞具有良好的吞噬功能。
[0032]本發(fā)明的膠質(zhì)瘤標(biāo)本中分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞的方法，具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0033](I)本發(fā)明結(jié)合了 Percoll密度梯度離心法和免疫磁珠分選法，可直接、快速地從新鮮膠質(zhì)瘤標(biāo)本中分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞，無(wú)需昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，且純度較高，并保持原代小膠質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)特性，為研究和應(yīng)用腦膠質(zhì)瘤中相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)提供了一個(gè)有效方法；
[0034](2)本發(fā)明試驗(yàn)探討了不同濃度Percoll溶液的分離效果，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析小膠質(zhì)細(xì)胞的純度，優(yōu)化了篩選小膠質(zhì)細(xì)胞的最佳不連續(xù)濃度梯度，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作的同時(shí)，使小膠質(zhì)細(xì)胞與紅細(xì)胞、髓磷脂較為徹底地分開(kāi)；
[0035](3)本發(fā)明以⑶Ilb為標(biāo)記通過(guò)陽(yáng)性免疫分選可獲得表型均一的小膠質(zhì)細(xì)胞，CDllb作為膜表面抗原在人小膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)傳代擴(kuò)增過(guò)程中穩(wěn)定表達(dá),為研究該表面分子在小膠質(zhì)細(xì)胞生物行為中的意義并進(jìn)一步完善小膠質(zhì)細(xì)胞特性的認(rèn)識(shí)提供了平臺(tái)。
[0036]本方法優(yōu)化了現(xiàn)有分離方法，通過(guò)percoll梯度離心富集腦膠質(zhì)瘤組織中的小膠質(zhì)細(xì)胞，再通過(guò)磁珠進(jìn)一步分選，從而保證了獲得的小膠質(zhì)細(xì)胞的高純度；經(jīng)優(yōu)化的percoll密度梯度離心法富集小膠質(zhì)細(xì)胞的純度可達(dá)80%,比現(xiàn)有技術(shù)未優(yōu)化的percoll密度梯度離心法提高了約10%左右，進(jìn)一步用磁珠分選后純度可達(dá)到95%以上，且免疫熒光和吞噬實(shí)驗(yàn)等證實(shí)其有良好的功能；本發(fā)明的方法具有操作簡(jiǎn)便易行、成本較低、質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，為進(jìn)一步研究腦膠質(zhì)瘤中小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫功能及在腫瘤的免疫逃逸中的作用研究奠定了基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0037]圖1為優(yōu)化的Percoll密度梯度離心法結(jié)合⑶IIb磁珠分選出高純度Microglia示意圖。`
[0038]圖2中，A為現(xiàn)有技術(shù)的密度梯度離心法收獲小膠質(zhì)細(xì)胞(HBSS/30%/40%/70%percolI) ；B為優(yōu)化后的percoll密度梯度離心法(HBSS/30%/70%percoll)收獲小膠質(zhì)細(xì)胞。
[0039]圖3為本發(fā)明優(yōu)化后的Percoll密度梯度離心法與現(xiàn)有技術(shù)的Percoll密度梯度離心法獲取細(xì)胞用流式檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞的純度,其中，
[0040]A為APC同型對(duì)照；B為腦膠質(zhì)瘤組織制成的單細(xì)胞懸液；C為目前文獻(xiàn)報(bào)道常用的Percoll密度梯度離心法獲得的細(xì)胞懸液；D為按優(yōu)化后percoll密度梯度離心法收獲的細(xì)胞懸液；E為CDllb磁珠分選收獲的陽(yáng)性分選細(xì)胞懸液。
[0041]圖4中，A為小膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)細(xì)胞(X 100倍)，B為細(xì)胞免疫熒光鑒定顯示小膠質(zhì)細(xì)胞呈Iabl (+)。
[0042]圖5為I例低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中用本發(fā)明優(yōu)化方法提取的小膠質(zhì)細(xì)胞免疫表型鑒定(流式檢測(cè))。
[0043]圖6為小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬熒光微珠照片(X 400倍)。
【具體實(shí)施方式】[0044]實(shí)施例1膠質(zhì)瘤標(biāo)本中分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞
[0045](I)處理膠質(zhì)瘤標(biāo)本:取新鮮的膠質(zhì)瘤標(biāo)本(手術(shù)切除20小時(shí)內(nèi))約2_3g，置于盛有5ml的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)皿中，用剪刀將其剪碎，置入15ml離心管，1500rpm，離心5分鐘，棄上清；加入木瓜蛋白酶(lmg/ml) 4-5ml,37°C消化30分鐘,加血清終止消化，1500rpm,離心5分鐘，棄上清，用IOml的1640培養(yǎng)基重懸，過(guò)40 iim濾網(wǎng)過(guò)濾于15ml離心管，得單細(xì)胞懸液，1500rpm離心5分鐘,棄上清；
[0046](2) Percoll密度梯度離心法富集分離細(xì)胞:向上述15ml離心管中依次加入70%Percoll溶液4ml，30%Percoll溶液8ml，最后加入HBSS 2ml，500g，加減速度設(shè)為低速(slow),離心30分鐘，用巴氏管從70%與30%Percoll溶液的界面吸取細(xì)胞，PBS重懸后1500r/分鐘離心5分鐘，棄上清；
[0047](3)免疫磁珠分選:用80 ill的MACS緩沖液重懸上步驟所得細(xì)胞，加入包被抗人⑶IIb抗體的免疫磁珠20 u 1，4°C放置15分鐘，加入Iml的MACS緩沖液洗滌兩次，離心去除未與細(xì)胞結(jié)合的磁珠抗體，棄上清，重新用500 u I的MACS緩沖液重懸細(xì)胞，500 U I的MACS緩沖液預(yù)洗MS磁性分選柱2次后，將500 u I細(xì)胞懸液過(guò)柱，500 U I的MACS緩沖液，去除非標(biāo)記陰性細(xì)胞，移柱出磁場(chǎng)，用Iml的MACS緩沖液洗柱，收集洗液即為陽(yáng)性細(xì)胞。
[0048]實(shí)施例2優(yōu)化Percoll密度梯度離心法富集小膠質(zhì)細(xì)胞
[0049]處理膠質(zhì)瘤標(biāo)本:取新鮮的膠質(zhì)瘤標(biāo)本(手術(shù)切除20小時(shí)內(nèi))，至于盛有5ml的1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，用剪刀將其剪碎，加入木瓜蛋白酶，37°C消化30分鐘，加血清終止消化，混勻后1500rpm，離心5分鐘，棄上清，用20ml_30mll640培養(yǎng)液重懸，過(guò)40 y m濾網(wǎng)得
單細(xì)胞懸液，離心，棄上 清。
[0050]采用現(xiàn)有技術(shù)的Percoll密度梯度離心法富集小膠質(zhì)細(xì)胞:用70%PerColl液4ml重懸細(xì)胞，加入15ml離心管中，然后依序加入40%、30%PercOll溶液各4ml，最后加入2mlHBSS, 500g離心30分鐘；離心后，顯示HBSS/30%Percoll界面為髓磷脂及細(xì)胞碎片層，細(xì)胞主要集中于30%/40%perCOll界面和40%/70%界面，紅細(xì)胞碎片主要集中于試管底部；用巴氏管分別從30%/40%percoll界面和40%/70%界面吸取細(xì)胞，PBS重懸后1500rpm，離心5分鐘，棄上清。流式細(xì)胞術(shù)分析:100iilPBS重懸上步所得細(xì)胞，加5iUAPC結(jié)合的抗人⑶Ilb抗體，4°C孵育30分鐘，PBS洗兩遍，300 u I多聚甲醛重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)，顯示Percoll液30%與40%界面以及40%與70%界面⑶Ilb+小膠質(zhì)細(xì)胞比例可達(dá)70%左右，紅細(xì)胞多位于試管底部，細(xì)胞碎片和髓磷脂多位于30%與HBSS界面。
[0051]采用優(yōu)化Percoll密度梯度離心法:采用70%與30%兩個(gè)濃度不連續(xù)密度梯度Percoll層法進(jìn)行富集小膠質(zhì)細(xì)胞，在30%與70%界面⑶IIb+小膠質(zhì)細(xì)胞比例可達(dá)80%左右，可簡(jiǎn)化操作，能較好的富集所需的細(xì)胞。
[0052]實(shí)施例2優(yōu)化的Percoll密度梯度離心法聯(lián)合磁珠分選分離新鮮膠質(zhì)瘤標(biāo)本中小膠質(zhì)細(xì)胞
[0053]處理膠質(zhì)瘤標(biāo)本:取新鮮的膠質(zhì)瘤標(biāo)本(手術(shù)切除20小時(shí)內(nèi))，至于盛有5ml的1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用剪刀將其剪碎，加入木瓜蛋白酶(lmg/ml)，37°C消化30分鐘，加血清終止消化，混勻后1500rpm離心5分鐘，棄上清，用20_30ml的1640培養(yǎng)基重懸，過(guò)40 um濾網(wǎng)得單細(xì)胞懸液，離心，棄上清。
[0054]采用優(yōu)化的Percoll密度梯度離心法富集小膠質(zhì)細(xì)胞:向上述離心管中依次加入70%Percoll溶液4ml, 30%Percoll溶液8ml,最后加入2ml的HBSS, 500g離心30分鐘，用巴氏管從70%與30%Percoll溶液的界面吸取細(xì)胞，PBS重懸后1500rpm/分鐘離心5分鐘，棄上清，取部分細(xì)胞用于流式檢測(cè)CDllb+小膠質(zhì)細(xì)胞純度外，其余按常規(guī)后續(xù)步驟進(jìn)行。
[0055]免疫磁珠分選:用80 ill的MACS緩沖液重懸上述步驟所得細(xì)胞，加入包被抗人CDllb抗體的免疫磁珠(購(gòu)自Miltenyi biotec)20 u I，4°C放置15分鐘，加入Iml的MACS緩沖液洗滌兩次，1500rpm, 5分鐘離心去除未結(jié)合的磁珠抗體，棄上清，重新用500 U I的MACS緩沖液重懸細(xì)胞，500 u I的MACS緩沖液預(yù)洗MS磁性分選柱2次后，將500 U I細(xì)胞懸液過(guò)柱，500iU的MACS緩沖液洗柱兩次，去除非標(biāo)記陰性細(xì)胞，移柱出磁場(chǎng)，用Iml的MACS緩沖液洗柱，收集洗液即為陽(yáng)性細(xì)胞。
[0056]流式細(xì)胞術(shù)分析:100iil的PBS重懸上步驟所得細(xì)胞，加5 ill APC結(jié)合的抗人CDllb抗體(購(gòu)自eBioscience)，4°C孵育15分鐘，PBS洗兩遍，300^1多聚甲醛重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果顯示，所獲活細(xì)胞中⑶Ilb+小膠質(zhì)細(xì)胞可達(dá)90%以上(其中，圖3E所示為I例III級(jí)星形細(xì)胞瘤標(biāo)本按上述方法獲得后的流式檢測(cè)結(jié)果)。
[0057]實(shí)施例3收獲的小膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及免疫熒光鑒定
[0058](I)原代培養(yǎng):將按本發(fā)明所述方法所獲得的小膠質(zhì)細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液(含GM-CSF)、置于37°C、體積分?jǐn)?shù)為5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，之后每隔3天換液I次；
[0059](2)細(xì)胞免疫熒光:12孔板中將CDllb+小膠質(zhì)細(xì)胞爬片后，PBS洗3次，每次5分鐘；用4%多聚甲醛固定30分鐘，PBS洗3次，每次5分鐘；用l%Triton處理30分鐘；PBS洗3次，每次5分鐘;羊血清于37°C封閉20分鐘JflAnti Ibal 一抗(0.5 u g/mL) (Wako CatalogN0.019-19741)，4°C過(guò)夜，PBS 洗 3 次，每次 5 分鐘；加二抗 Alexa Fluor ? 594donkey antiRabbit IgG 37°C I小時(shí)，PBS洗3次，每次5分鐘；晾干封片，Nikon熒光顯微鏡拍照。
[0060]實(shí)施例4分選獲得的小膠質(zhì)細(xì)胞免疫功能分析
[0061]免疫表型測(cè)定:取本發(fā)明獲得的小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞，以⑶lib、⑶40、HLA-DR、⑶80、⑶86、、B7-H1、B7-H4單克隆抗體為探針，用流式細(xì)胞術(shù)分析表面分子表達(dá)。
[0062]吞噬功能檢測(cè):取本發(fā)明獲得的I X IO6小膠質(zhì)細(xì)胞置于六孔板中培養(yǎng)，與熒光素標(biāo)記的E.coli微珠充分混合，37°C孵育12h后，于鏡下拍照，棄上清，PBS洗3_4遍，4%多聚甲醛固定10分鐘，加入10 u g/ml的DAPI染色10分鐘，PBS洗5分鐘X 3次后，熒光顯微鏡拍照。
【權(quán)利要求】
1.一種分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于，其包括步驟: 步驟一，結(jié)合物理分離和酶的消化作用，將離體的新鮮的膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本制成單細(xì)胞懸液； 步驟二，采用不同濃度Percoll溶液分離、富集小膠質(zhì)細(xì)胞，并將其與髓磷脂及紅細(xì)胞碎片分開(kāi)； 步驟三，利用免疫磁珠分選CDllb陽(yáng)性的細(xì)胞，提高小膠質(zhì)細(xì)胞的分離純度。
2.按權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述步驟一中:取離體的新鮮的膠質(zhì)瘤標(biāo)本2_3g，置于盛有5ml的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)皿中，用剪刀將其剪碎，置入15ml離心管，1500rpm,離心5分鐘,棄上清；加入lmg/ml的木瓜蛋白酶4-5ml, 37°C消化30分鐘,加血清終止消化，1500rpm,離心5分鐘,棄上清,用IOml的1640培養(yǎng)基重懸,過(guò)40 y m濾網(wǎng)過(guò)濾于15ml離心管，得單細(xì)胞懸液，1500rpm離心5分鐘，棄上清； 所述步驟二中:向上述15ml離心管中依次加入70%Percoll溶液4ml, 30%Percoll溶液8ml，最后加入HBSS 2ml,500g,加減速度設(shè)為低速，離心30分鐘，用巴氏管從70%與30%Percoll溶液的界面吸取細(xì)胞，PBS重懸后1500r/分鐘離心5分鐘，棄上清； 所述步驟三中:用80 ill的MACS緩沖液重懸上步驟所得細(xì)胞，加入包被抗人⑶Ilb抗體的免疫磁珠20 u 1，4°C放置15分鐘，加入Iml的MACS緩沖液洗滌兩次，離心去除未與細(xì)胞結(jié)合的磁珠抗體，棄上清，重新用500 u I的MACS緩沖液重懸細(xì)胞，500 U I的MACS緩沖液預(yù)洗MS磁性分選柱2次后，將500 u I細(xì)胞懸液過(guò)柱，500 U I的MACS緩沖液，去除非標(biāo)記陰性細(xì)胞，移柱出磁場(chǎng)，用Iml的MACS緩沖液洗柱，收集洗液即為陽(yáng)性細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟一中，所述離體的新鮮腦膠質(zhì)瘤組織放置于冰上并20小時(shí)內(nèi)處理；采用機(jī)械剪切聯(lián)合木瓜酶消化進(jìn)行處理。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟二中，配置2個(gè)不同密度Percoll分離液,底部一層為70%Percoll液4ml,中間一層為30%Percoll液8ml,最上一層為 2ml 的 HBSS。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟二中，配置不同密度Percoll分離液；用70%percoll重懸成單細(xì)胞懸液,加入離心管,然后依序加入30%percoll液及HBSS層，30min，4°C，低加減速度離心，取細(xì)胞懸液用⑶Ilb流式抗體檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞的純度。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟二中，吸取離心后的percoll70%和30%交界處細(xì)胞，加入PBS, 1200rpm,室溫，離心，去上清。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟二中，取少量細(xì)胞進(jìn)行CDllb流式抗體檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞的純度，其余細(xì)胞繼續(xù)磁珠分選純化操作。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟三中，用MACS緩沖液重懸所得細(xì)胞，加入包被抗人⑶IIb抗體的免疫磁珠，4°C放置，加入MACS緩沖液重懸細(xì)胞，離心去除未結(jié)合的磁珠抗體，棄上清，用MACS緩沖液重懸細(xì)胞，500 u I/次緩沖液預(yù)洗MS磁性分選柱2次后,將500 ii I細(xì)胞懸液過(guò)柱，500 ii I緩沖液洗柱兩次，去除非標(biāo)記陰性細(xì)胞，移柱出磁場(chǎng)，用MACS緩沖液洗柱，收集洗液即為陽(yáng)性細(xì)胞；再檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞的純度。
9.根據(jù)權(quán)利要求所述I的方法，其特征在于，所述的方法還包括步驟:在1640+10%FBS含血清培養(yǎng)基中添加50U/ml的GM-CSF細(xì)胞因子，制成小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基。
【文檔編號(hào)】C12N5/078GK103710306SQ201210380987
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2012年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月9日
【發(fā)明者】毛穎, 葉紅星, 姚瑜, 岳琪, 莫鏈杰, 張新, 周良輔 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院