一種高特異高敏感檢測副溶血性弧菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高特異高敏感檢測副溶血性弧菌的方法，包括以下步驟：步驟1）制備反應(yīng)液；步驟2）使用副溶血性弧菌的核酸，以及若干臨床分離金黃色葡萄球菌、頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，多次進行反應(yīng)，觀察它們的陰陽性。本發(fā)明通過配制反應(yīng)液，設(shè)計引物序列，能快速、準確的檢測副溶血性弧菌，并及時采取相應(yīng)的措施，減少了疾病的發(fā)生率。
【專利說明】一種高特異高敏感檢測副溶血性弧菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及疾病檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說，是一種高特異高敏感檢測副溶血性弧菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)是一種嗜鹽性細菌。副溶血性弧菌食物中毒，是進食含有該菌的食物所致，主要來自海產(chǎn)品，如墨魚、海魚、海蝦、海蟹、海蜇，以及含鹽分較高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。本菌存活能力強，在抹布和砧板上能生存I個月以上，海水中可存活47天。臨床上以急性起病、腹痛、嘔吐、腹瀉及水樣便為主要癥狀。本病多在夏秋季發(fā)生于沿海地區(qū)，常造成集體發(fā)病。近年來由于海鮮空運，內(nèi)地城市病例也漸增多。快速檢測副溶血性弧菌，對提高副溶血性弧菌引起的檢測和診斷效率，確定有效治療方案具有很大意義。
[0003]環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)是由日本榮研(EIKEN)株式會社開發(fā)的高特異性敏感度的核酸檢測系統(tǒng)，無須昂貴的設(shè)備，已經(jīng)成為核酸快速檢測法的良好手段，本發(fā)明結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)，設(shè)計針對副溶血性弧菌的特異性基因序列的一對外引物(VP-F3和VP-B3)和一對內(nèi)引物(VP-FIP和VP-BIP)進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明公開了一種高特異高敏感檢測副溶血性弧菌的方法，提高了它的檢測和診斷效率。
[0005]為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，達到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
一種高特異高敏感檢測副溶血性弧`菌的方法，包括以下步驟:
步驟I)制備反應(yīng)液 反應(yīng)液組成及含量為
8u/ul Bst核酸聚合酶8u
IOX耐熱聚合酶反應(yīng)緩沖液lX，MgS04 2mM
4M甜菜堿IM
IOmM d-NTP 混合液400 μ M
內(nèi)引物
VP-FIP40umol
VP-BIP40umol
外引物
VP-F35umol
VP-B35umol
標本核酸20ng
添加焦碳酸二乙酯處理水至總量達到25ul;步驟2)使用副溶血性弧菌的核酸，以及若干臨床分離金黃色葡萄球菌、頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，多次進行反應(yīng)，觀察它們的陰陽性。
[0006]進一步的，所述外引物VP-F3的序列為GCGCAAGGTTACAACATC。
[0007]進一步的，所述外引物VP-B3的序列為CACACTCAGAGCGCAATG。
[0008]進一步的，所述內(nèi)引物VP-FIP的序列為 TCACGAAACCGTGCTCTTCTG-GTTGTTTGATACTCACGCCT。
[0009]進一步的，所述內(nèi)引物VP-BIP 的序列為 GCGAGCGATCCTTGTTTGGA-GTACTTGATGCATGTAATCGA。
[0010]進一步的，所述反應(yīng)液中加入熒光顯示物質(zhì)溴化乙錠、鈣黃綠素進行實時檢查。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明通過配制反應(yīng)液，設(shè)計引物序列，能快速、準確的檢測副溶血性弧菌，并及時采取相應(yīng)的措施，減少了疾病的發(fā)生率。
【具體實施方式】
[0012]下面將結(jié)合實施例，來詳細說明本發(fā)明。
[0013]一種高特異高敏感檢測副溶血性弧菌的方法，包括以下步驟:
【權(quán)利要求】
1.一種高特異高敏感檢測副溶血性弧菌的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟I)制備反應(yīng)液 反應(yīng)液組成及含量為 8u/ul Bst核酸聚合酶8u IOX耐熱聚合酶反應(yīng)緩沖液lX，MgS04 2mM4M甜菜堿IM IOmM d-NTP 混合液400 μ M 內(nèi)引物 VP-FIP40umol VP-BIP40umol 外引物 VP-F35umol VP-B35umol標本核酸20ng 添加焦碳酸二乙酯處理水至總量達到25ul; 步驟2)使用副溶血性弧菌的核酸，以及若干臨床分離金黃色葡萄球菌、頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，多次進行反應(yīng)，觀察它們的陰陽性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高特異高敏感檢測副溶血性弧菌的方法，其特征在于:所述外引物 VP-F3 的序列為 GCGCAAGGTTACAACATC。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高特異高敏感檢測副溶血性弧菌的方法，其特征在于:所述外引物 VP-B3 的序列為 CACACTCAGAGCGCAATG。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高特異高敏感檢測副溶血性弧菌的方法，其特征在于:所述內(nèi)引物VP-FIP的序列為
TCACGAAACCGTGCTCTTCTG-GTTGTTTGATACTCACGCCT。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高特異高敏感檢測副溶血性弧菌的方法，其特征在于:所述內(nèi)引物 VP-BIP 的序列為 GCGAGCGATCCTTGITTGGA-GTACTTGATGCATGTAATCGA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高特異高敏感檢測副溶血性弧菌的方法，其特征在于:所述反應(yīng)液中加入熒光顯示物質(zhì)溴化乙錠、鈣黃綠素進行實時檢查。
【文檔編號】C12R1/63GK103725765SQ201210385753
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月12日
【發(fā)明者】金京勛 申請人:蘇州四同醫(yī)藥科技有限公司