專利名稱：一種大豆來源的油體蛋白基因種子特異性啟動子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及到一種從大豆中克隆到的油體蛋白基因種子特異性啟動子序列及其應(yīng)用。從大豆總DNA克隆到的這個種子特異性啟動子并與目的基因連接到植物表達(dá)載體，導(dǎo)入植物中，使轉(zhuǎn)基因植物種子中特異高效表達(dá)下游基因的方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糧食作物(包括部分經(jīng)濟(jì)作物)中食用的部分主要是種子，，種子的品質(zhì)和產(chǎn)量直接影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人們的生活水平。在提高種子品質(zhì)和質(zhì)量的過程中，雜交是經(jīng)典方法，通過選擇兩個性狀好的父本和母本進(jìn)行雜交，得到更理想的后代，但這個方法的缺陷就是周期太長。隨著基因工程的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因則大大縮短了育種時間。在轉(zhuǎn)基因工程研究的過程中，具有應(yīng)用價值的外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)往往達(dá)不到理想水平。而啟動子是決 定基因表達(dá)的關(guān)鍵因素，選擇合適的啟動子對于轉(zhuǎn)基因有著重要作用。根據(jù)啟動子的轉(zhuǎn)錄模式可將啟動子分為三類組成型啟動子、組織特異性啟動子和誘導(dǎo)啟動子。組成型啟動子在轉(zhuǎn)基因工程中被廣泛應(yīng)用，如雙子葉植物中應(yīng)用的CaMV35S和CsVMV啟動子，單子葉植物中應(yīng)用的玉米Ubiqutin啟動子和水稻的Actinl啟動子。組織特異性啟動子包括根特異性啟動子(Yamamoto YT et al, 1992 ；Elmayan and Tepfer, 1995 ；Xu et al, 1995 ；Nitzet al, 2001 ；Vaughan et al, 2006 ；Vi jaybhaskar et al, 2008 ；Jeong et &1,2010)、莖特異性啟動子(Bostwick et al, 1994)、花特異性啟動子(van der Meer et al, 1990 ;Irishand Yamamoto, 1995 ；Rul 1 z-Rivero and Prat,1998 ；Maizel and Weigel, 2004；Chiouand Yeh, 2008 ;Verdonk et al, 2008)、果實特異性啟動子(Montgomery et al, 1993 ；vanHaaren and Houck, 1993 ；Xu et al, 1996 ；Coupe and Deikman 1997 ；Deikman et al,1998 ；Moon and Callahan, 2004)和種子特異性啟動子(Beachy R et al, 1985)等。誘導(dǎo)啟動子包括缺水誘導(dǎo)啟動子(Kasuga M et al, 1999 ；Xiao et al，2001 ；Rai M et al，2009)、低溫誘導(dǎo)啟動子(Seki M et al, 2001 ；Kasuga M et al, 2004 ;杜娟等，2005)、鹽誘導(dǎo)啟動子(Russell BL et al, 1998 ；Zhou SF et al, 2001 ；Aryadeep R et al, 2007)、損傷誘導(dǎo)性啟動子(Farmer EE et al, 1994)和受病原菌誘導(dǎo)啟動子(呂華飛等，1999 ;Sa Q et al, 2003 ；Peng JL et al, 2004)等。在組成型啟動子的控制下，外源基因一般會在轉(zhuǎn)基因植物所有部位和所有發(fā)育階段都高量表達(dá)，這樣會造成資源浪費(fèi)，甚至?xí)绊懼参锏纳L發(fā)育，得不到理想的轉(zhuǎn)基因植物。種子特異性啟動子則可以很好的控制外源基因的表達(dá)，只在種子中高效表達(dá)，在其他部位和發(fā)育階段幾乎不表達(dá)。這就為提高種子的品質(zhì)和產(chǎn)量奠定了很好的基礎(chǔ)。在上個世紀(jì)80年代就開始有種子特異性啟動子的研究，1985年Beachy等人(Beachy RN, et al. (1985)Accumulation and assembly of soybean β -conglycinin in seeds of transformedpetunia plants. The EMBO Journal, 4 (12), 3047-3053.)研究大豆伴球蛋白基因時發(fā)現(xiàn)，β_球蛋白的α-亞基啟動子具有很強(qiáng)的時空調(diào)控性，在轉(zhuǎn)基因植株中只在成熟過程中的種子中高效表達(dá)，而在其他部位和發(fā)育階段幾乎不表達(dá)。隨后，其它種子特異性啟動子被發(fā)現(xiàn)并克隆出來Baumlein等從野生大豆分離出來USP基因啟動子(Baumlein H et al,1991) ；Russell等1997發(fā)現(xiàn)水稻谷蛋白I基因和玉米素基因啟動子分別在胚乳和胚乳外層表達(dá)(Russell DA et al，1997);油菜napinB基因啟動子可在種子中特異表達(dá)(Wu CYet al, 2000) ;Rossak等發(fā)現(xiàn)3_酮脂酰輔酶A合成酶啟動子(Rossak M et al, 2001)在轉(zhuǎn)基因擬南芥中開花5天后表達(dá),9-11天后達(dá)到高峰；Hwang等發(fā)現(xiàn)水稻球蛋白啟動子(HwangYS et al 2002) ;Kluth等發(fā)現(xiàn)gbssl基因上游40kb堿基與⑶S基因連接后轉(zhuǎn)入植物發(fā)現(xiàn)其在小麥灌漿時表達(dá)，并進(jìn)一步確定啟動子序列為基因上游I. Okb (Kluth A et al，2002)；Sunikumar等從棉花胚cDNA中分離出1108bp的β-球蛋白B基因的啟動子(Sunikumar Get al，2002) ;Mei等2004年發(fā)現(xiàn)的玉米中球蛋白啟動子(Mei C et al，2004) ;Qu等將水稻SBEl基因啟動子與⑶S連接后轉(zhuǎn)入植物發(fā)現(xiàn)水稻種子盾片中表達(dá)(Qu LQ et al，2004)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶啟動子和谷氨酸合成酶基因的啟動子控制外源基因分別在胚乳內(nèi)層和水稻盾片中表達(dá)(Qu LQ et al,2004)。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明目的是提供一個大豆油體蛋白基因種子特異性啟動子的序列，它能夠使下游基因在種子中特異高效表達(dá)，在其他組織中或發(fā)育階段幾乎不表達(dá)，為提高農(nóng)作物或經(jīng)濟(jì)作物種子的品質(zhì)和產(chǎn)量提供重要元件。技術(shù)方案本發(fā)明提供了一個大豆來源的種子特異性啟動子序列，其特征在于，該啟動子的全長序列為SEQ ID NO. I。大豆油體蛋白基因表達(dá)模式鑒定步驟提取大豆(品種為“南農(nóng)99-10”)各個發(fā)育階段根、莖、幼葉、老葉、花、幼莢、老莢、未成熟種子和成熟種子的RNA，并反轉(zhuǎn)成cDNA，設(shè)計引物(5’ CAATGTTCTCGTCCTCGCCG 3’ ；5’GATGGAGGTGATGCCGAAGA 3，)對基因做 RT-PCR，大豆 cons6 基因(Libault 等，2008)做內(nèi)參對照，檢測該基因各個發(fā)育階段的表達(dá)情況?？寺≡搯幼有蛄泻丸b定其功能如下步驟I.利用SDS法提取大豆總DNA。2.設(shè)計并合成如下一對引物引物I :5，GTCGACAACGTGGCTTGCACTTGTCTC 3，，引物2 :5 ’ GGATCCGGTATGGAAAGCGAGAGAGG 3 ’。3.以大豆總DNA為模版，用上述引物做PCR，將PCR片段和T載體連接，挑單菌落提取質(zhì)粒測序，確定啟動子序列。將陽性菌株提取的質(zhì)粒和PBIlOl載體用Sal I和BamH I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，回收酶切片段并在4°C過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，37°C恢復(fù)I小時后涂板過夜培養(yǎng)。挑取單菌落提質(zhì)粒測序，確定目的啟動子序列。4.將連接好的重組載體，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，轉(zhuǎn)化擬南芥，其所結(jié)種子在含有50mg/L的卡那霉素的MS平板上生長，陽性植株為正常生長的擬南芥，將陽性植株繁殖2代，在F3代分離比為3 I的植株為單克隆。選取純合體鑒定各個發(fā)育階段的GUS染色。

圖IRT-PCR檢測大豆油體蛋白基因各個發(fā)育階段表達(dá)情況，圖從左到右依次為根、莖、幼葉、老葉、花、未成熟種子、成熟種子、幼莢和老莢。油體蛋白基因只在未成熟種子中表達(dá)。圖2PCR擴(kuò)增得到的油體蛋白基因啟動子片段電泳圖。I是油體蛋白基因啟動子；M 是 DNA marker。圖3構(gòu)建種子特異性啟動子與PBIlOl的重組載體。圖4轉(zhuǎn)化擬南芥后得到的單克隆純和陽性植株在各個發(fā)育階段的GUS染色。從左到右依次是萌發(fā)10天幼苗、生長25天植株、生長50天莖和花和開花后5天、8天、11天、14天、20天的種子和莢子。
(五)具體實施方案·大豆油體蛋白基因表達(dá)模式的鑒定I.提取大豆組織RNA(I)取IOOmg組織樣品用研磨棒研磨，期間不斷加入液氮，直至樣品成粉狀；轉(zhuǎn)入裝有ImLTotal RNA提取試劑Trizol溶液室溫靜置5min。利用Trizol法提取各組織RNA。(2)將提取好的RNA加入適量的RNase-free水溶液沉淀，必要時可用移液槍輕輕吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后，經(jīng)過電泳和紫外分光光度計(A260/A280)檢測樣品的RNA濃度和質(zhì)量，于_80°C保存。2.半定量 RT-PCR(I)取RNA樣品各2 μ g，在反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV的作用下合成cDNA第一鏈，由RNA到cDNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)操作按M-MLV說明書進(jìn)行，只是體系加倍；將合成的cDNA稀釋25倍作為模板用于半定量PCR擴(kuò)增。(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完成后，進(jìn)行半定量PCR反應(yīng)。油體蛋白基因的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳根據(jù)溴化乙錠(EB)染色信號分析擴(kuò)增片段大小，拍攝凝膠的照片。以在大豆中高度保守、并組成型表達(dá)的cons6基因為內(nèi)參照。擴(kuò)增引物為5’ CAATGTTCTCGTCCTCGCCG3’ ；5’ GATGGAGGTGATGCCGAAGA 3’油體蛋白基因啟動子的獲得和功能鑒定I.啟動子的克隆利用SDS法提取大豆(品種為“南農(nóng)99-10”，來源于國家大豆改良中心)總DNA
設(shè)計引物擴(kuò)增目的啟動子序列，擴(kuò)增引物為5 ’ CAATGTTCTCGTCCTCGCCG 3 ’ ；5’ GATGGAGGTGATGCCGAAGA 3’，擴(kuò)增片段大小為 1774bp將PCR片段和T載體(購自PR0MEGA公司)連接，挑單菌落提取質(zhì)粒測序，確定啟動子序列。將陽性菌株提取的質(zhì)粒和PBIlOl載體(購自Biovector Science Lab)用Sal
I和BamH I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，回收酶切片段并在4°C過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，37°C恢復(fù)I小時后涂板過夜培養(yǎng)。挑取單菌落提質(zhì)粒測序，確定目的啟動子序列。提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101 (購自Biovector Science Lab),測序獲得陽性菌株，_80°C保存。2.蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥
(I)農(nóng)桿菌侵染擬南芥根據(jù)Clough and Bent (1998)的Floral Dipping方法進(jìn)行擬南芥轉(zhuǎn)化。取生長一個月左右，生長狀況良好的植株，去除結(jié)實的果莢。將轉(zhuǎn)化有PBIlOl和種子特異啟動子重組載體的農(nóng)桿菌GV3101于28°C培養(yǎng)過夜后，按I : 100接菌培養(yǎng)至0D600 ^ 2. 0，4500rpm離心lOmin，菌體沉淀用轉(zhuǎn)化液懸浮，至終濃度0D600 O. 8。轉(zhuǎn)化時將擬南芥地上部分浸泡于菌液中5-15s，確保全部花苞都被浸沒。用吸水紙吸去多余的液體，將植物平放并保持濕度，避光過夜。第二天將植物取出，豎直并轉(zhuǎn)移到正常條件下生長，每隔一周轉(zhuǎn)化一次，一般轉(zhuǎn)化三次后收種。 轉(zhuǎn)化液MS液體培養(yǎng)基加5%蔗糖(滅菌)，O. 05% Silwet L-77 (購自GE公司)。(2)陽性植株的篩選轉(zhuǎn)基因植株種子在含50 μ g/ml Kanamycin的抗性MS培養(yǎng)基上生長,一周后挑取正常生長的轉(zhuǎn)化苗移入土壤中繼續(xù)生長。提取野生型及轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA，將兩個DNA分別為模板對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR鑒定。PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)過兩代自交后就能得到轉(zhuǎn)基因植株純系(上一代植株Kanamycin抗性具有3 I的分離比，本代植株抗性為100 并于后代植株保持100%抗性用于進(jìn)一步的實驗。(3)⑶S基因的檢測⑶S報告基因的檢測參照Yadegari et al (1994)⑶S染色，將各組織浸入⑶S溶液，37°C浸泡2h，種子和莢子浸泡時間則需幾個小時甚至過夜，染色后各組織乙醇脫色完畢后，經(jīng)透明液透明(幼苗、根尖等組織透明5-10min左右；莢子、種子等組織需透明幾小時乃至過夜)，然后利用體視顯微鏡觀察并拍照。鑒定結(jié)果是啟動子只在未成熟種子和種子萌發(fā)時期啟動下游CUS基因的表達(dá)，而在其他組織中基本不啟動下游基因。
權(quán)利要求
1.一種大豆來源的種子特異性啟動子，序列特征包括SEQ NO. I所示的序列以及與它互補(bǔ)，同源，或該序列經(jīng)過插入、突變幾個核苷酸而形成的具有相同功能的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求I所述核苷酸序列的重組載體。
3.含有權(quán)利要求2所述重組載體的植物宿主細(xì)胞或植物宿主組織。
4.按照權(quán)利要求3所述的植物宿主細(xì)胞或植物宿主組織，其特征是植物宿主細(xì)胞是植物種子細(xì)胞，植物宿主組織是植物種子本身或其后代的種子細(xì)胞或種子。
5.一種在植物中表達(dá)權(quán)利要求I的所述的種子特異啟動子的方法，其特征是 (1)權(quán)利要求2所述的重組載體導(dǎo)入植物細(xì)胞， (2)使所述的植物細(xì)胞生長成能夠結(jié)種子的成熟植物。
6.按照權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述植物是擬南芥。
7.權(quán)利要求I 6任意一項用于人類食品、動物飼料、化妝品或藥品。
全文摘要
本發(fā)明涉及到一個大豆來源的油體蛋白基因啟動子及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及到改變糧食作物或經(jīng)濟(jì)作物種子品質(zhì)和產(chǎn)量的基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明包括種子特異性啟動子序列SEQ ID NO.1，以及重組載體轉(zhuǎn)化宿主組織，并表達(dá)下游基因改變種子成分的方法。本發(fā)明克隆的啟動子對油料作物(大豆)種子品質(zhì)和產(chǎn)量的提高具有重要意義。
文檔編號C12N15/113GK102876680SQ20121039049
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月16日
發(fā)明者章文華, 趙江哲, 柏楊 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)