一種bdna在尿液中檢測(cè)pca3的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供的一種BDNA在尿液中檢測(cè)PCA3的應(yīng)用(1)PCA3標(biāo)本搜集；(2)研究PCA3標(biāo)本搜集；(3)利用BDNA技術(shù)檢測(cè)：本發(fā)明利用bDNA技術(shù)擅長(zhǎng)對(duì)小片段基因的捕獲，獨(dú)特設(shè)計(jì)的目標(biāo)探針與PCA3高效特異結(jié)合，加上改進(jìn)的放大信號(hào)體系使得靈敏度、特異性均有保證。該技術(shù)避免了傳統(tǒng)PCR的假陽(yáng)性、假陰性問(wèn)題，且操作簡(jiǎn)單，凡具有分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本技能人員均可操作。同時(shí)，本技術(shù)檢測(cè)的結(jié)果靈敏度高、陽(yáng)性檢出率高、穩(wěn)定性和可重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、易于普及。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種BDNA在尿液中檢測(cè)PCA3的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及前列腺癌檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種BDNA在尿液中檢測(cè)PCA3的應(yīng)用。【背景技術(shù)】
[0002]目前，前列腺癌早期診斷方法及PCA3優(yōu)勢(shì)前列腺癌(PCa)是西方國(guó)家男性最常見(jiàn)惡性腫瘤，位于死亡原因第二位。隨著我國(guó)人口老齡化、飲食結(jié)構(gòu)西方化以及診斷技術(shù)的提高，PCa的發(fā)病率和診斷率逐年增加。
[0003]診斷前列腺癌最常用的標(biāo)記物是PSA，但PSA是前列腺組織特異性抗原，不是PCa特異性抗原，故良性前列腺增生、前列腺炎、急性尿潴留、前列腺的各種手術(shù)操作和檢查均可引起血清PSA高，疾病特異性差。美國(guó)每4個(gè)血清PSA > 4ng/ml的老年男性中僅I人被穿刺活檢證實(shí)為前列腺癌。還有約15%的PCa患者血清PSA小于4ng/mL。臨床迫切需要一種腫瘤特異性標(biāo)記物來(lái)診斷前列腺癌。而PCA3基因是PCa特異性基因，因此使用PCA3基因作為診斷PCa的腫瘤標(biāo)記物將比PSA有更好的敏感性及特異性。
[0004]PCA3定位于第9號(hào)染色體(9q21_22)，全長(zhǎng)約25kb，包含3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子。研究表明PCA3是一種非編碼RNA基因，其蛋白產(chǎn)物非常少，因此對(duì)PCA3的mRNA檢測(cè)更具針對(duì)性。
[0005]PCA3自從1999年首次被發(fā)現(xiàn)后經(jīng)過(guò)了漫長(zhǎng)的研究，目前國(guó)外對(duì)PCA3預(yù)測(cè)前列腺癌的敏感性和特異性是肯定的，它優(yōu)于PSA。PCA3在前列腺癌組織中的特異性高表達(dá)使其成為一個(gè)前景廣闊的前列腺癌標(biāo)志物。但對(duì)PCA3高表達(dá)的機(jī)制、其生物學(xué)功能及PCA3在前列腺癌形成和疾病進(jìn)展的關(guān)鍵生化途徑中有`何意義等方面仍存在許多未知的、需要探索的領(lǐng)域。在腫瘤診斷方面因?yàn)镻CA3轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物僅僅為十幾kb的片段，而mRNA在一般環(huán)境和運(yùn)輸保存中容易降解，因此采用哪一種技術(shù)平臺(tái)來(lái)檢測(cè)PCA3是確保診斷準(zhǔn)確可靠的關(guān)鍵。目前國(guó)外檢測(cè)PCA3主要有三種方式，PCR技術(shù)、TMA技術(shù)、和bDNA技術(shù)。前兩種技術(shù)最大不確定性是核酸序列擴(kuò)增帶來(lái)的固有的假陽(yáng)性和假陰性問(wèn)題。因?yàn)樵摷夹g(shù)的放大是用引物擴(kuò)增，需要擴(kuò)增的區(qū)域是完整的，如標(biāo)本中的RNA斷裂和降解或變異就無(wú)法與引物結(jié)合，導(dǎo)致假陰性。bDNA技術(shù)(branched DNA, bDNA)是目前唯一被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于艾滋病毒(HIV)和丙肝病毒(HCV)檢測(cè)的最新技術(shù)，bDNA技術(shù)中使用的探針包括目標(biāo)探針(targetprobe)、前放大體(preamplifier)、放大體(amplifier)、標(biāo)記探針(label probe)。上述探針中只有目標(biāo)探針需要針對(duì)不同的目的基因進(jìn)行不同設(shè)計(jì)，后三種探針對(duì)任何基因的bDNA分析都是通用的。目標(biāo)探針包含了多種針對(duì)PCA3基因不同片段的特異性探針，用于捕捉目標(biāo)基因片段。放大探針是技術(shù)的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的為解決以上技術(shù)問(wèn)題，提供一種靈敏度高、陽(yáng)性檢出率高、穩(wěn)定性和可重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、易于普及的在尿液中檢測(cè)PCA3的應(yīng)用。
[0007]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的BDNA在尿液中檢測(cè)PCA3的應(yīng)用是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0008]一種BDNA在尿液中檢測(cè)PCA3的應(yīng)用，所采用的操作步驟為:
(1)PCA3標(biāo)本搜集
尿液PCA3檢測(cè)使用標(biāo)本為經(jīng)直腸前列腺按摩后的尿液標(biāo)本:
1)檢查前飲水500ml有助于收集尿液標(biāo)本；
2)前列腺指檢后立即搜集尿液；
3)至少要20-30ml尿液，收集在貼好標(biāo)簽的杯子里，必須是最初排泄的尿液標(biāo)本，保存尿液的尿杯里不應(yīng)含任何防腐劑；
4)如果標(biāo)本長(zhǎng)期保存，應(yīng)放_(tái)80°C，短期內(nèi)檢測(cè)放置_20°C保存。
(2)研究PCA3標(biāo)本搜集
1)研究利用PCA3作為靶標(biāo)在前列腺癌診斷個(gè)體化評(píng)估中的可行性；
2)研究bDNA技術(shù)平臺(tái)檢測(cè)經(jīng)直腸前列腺按摩后尿液中PCA3評(píng)分診斷前列腺癌的靈敏度、特異性、檢測(cè)速度，以及是否便于通量檢測(cè)；
3)研究不同臨床分期和病理分級(jí)的前列腺癌患者PCA3評(píng)分變化是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異和臨床意義；
4)研究PCA3評(píng)分，作為前 列腺癌進(jìn)展及預(yù)后評(píng)判指標(biāo)和前列腺癌治療后監(jiān)測(cè)指標(biāo)的可行性；
5)研究中國(guó)人PCA3的ROC曲線以及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)和診斷閾值；
6)研究PCA3異構(gòu)體在中國(guó)前列腺癌患者人群的表達(dá)以及在不同病理分級(jí)的腫瘤標(biāo)本中是否有差異表達(dá)；
7)研究PCA3不同異構(gòu)體表達(dá)下，雄激素受體異構(gòu)體表達(dá)情況，分析兩者是否有相關(guān)性。
(3)利用BDNA技術(shù)檢測(cè):
1)建立用bDNA技術(shù)檢測(cè)尿液中PCA3早期診斷前列腺癌的最佳檢測(cè)流程；
2)建立中國(guó)人PCA3評(píng)分的ROC曲線和PCA3診斷閾值，以及PCA3對(duì)前列腺癌個(gè)體化診斷中的評(píng)估體系；并將PCA3作為無(wú)創(chuàng)性診斷前列腺癌的標(biāo)志物在臨床推廣應(yīng)用；
3)了解中國(guó)前列腺癌患者PCA3異構(gòu)體表達(dá)特異性；
4)了解中國(guó)前列腺癌患者PCA3異構(gòu)體表達(dá)與雄激素受體異構(gòu)體表達(dá)的相關(guān)性。
5)bDNA技術(shù)中使用的探針包括目標(biāo)探針(target probe)、前放大體(preamplifier)、放大體(amplifier)、標(biāo)記探針(label probe),上述探針中只有目標(biāo)探針需要針對(duì)不同的目的基因進(jìn)行不同設(shè)計(jì)，后三種探針對(duì)任何基因的bDNA分析都是通用的，目標(biāo)探針包含了多種針對(duì)PCA3基因不同片段的特異性探針，用于捕捉目標(biāo)基因片段，以便得出更準(zhǔn)確的結(jié)果O
[0009]本發(fā)明的有益效果是，利用bDNA技術(shù)擅長(zhǎng)對(duì)小片段基因的捕獲，獨(dú)特設(shè)計(jì)的目標(biāo)探針與PCA3高效特異結(jié)合，加上改進(jìn)的放大信號(hào)體系使得靈敏度、特異性均有保證。該技術(shù)避免了傳統(tǒng)PCR的假陽(yáng)性、假陰性問(wèn)題，且操作簡(jiǎn)單，凡具有分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本技能人員均可操作。同時(shí)，本技術(shù)檢測(cè)的結(jié)果靈敏度高、陽(yáng)性檢出率高、穩(wěn)定性和可重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、易于普及。【具體實(shí)施方式】
[0010]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0011 ] 一種BDNA在尿液中檢測(cè)PCA3的應(yīng)用，所采用的操作步驟為:
(1)PCA3標(biāo)本搜集
尿液PCA3檢測(cè)使用標(biāo)本為經(jīng)直腸前列腺按摩后的尿液標(biāo)本:
1)檢查前飲水500ml有助于收集尿液標(biāo)本；
2)前列腺指檢后立即搜集尿液；
3)至少要20-30ml尿液，收集在貼好標(biāo)簽的杯子里，必須是最初排泄的尿液標(biāo)本，保存尿液的尿杯里不應(yīng)含任何防腐劑；
4)如果標(biāo)本長(zhǎng)期保存，應(yīng)放_(tái)80°C，短期內(nèi)檢測(cè)放置_20°C保存。
(2)研究PCA3標(biāo)本搜集
1)研究利用PCA3作為靶標(biāo)在前列腺癌診斷個(gè)體化評(píng)估中的可行性；
2)研究bDNA技術(shù)平臺(tái)檢測(cè)經(jīng)直腸前列腺按摩后尿液中PCA3評(píng)分診斷前列腺癌的靈敏度、特異性、檢測(cè)速度，以及是否便于通量檢測(cè)；
3)研究不同臨床分期和病理 分級(jí)的前列腺癌患者PCA3評(píng)分變化是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異和臨床意義；
4)研究PCA3評(píng)分，作為前列腺癌進(jìn)展及預(yù)后評(píng)判指標(biāo)和前列腺癌治療后監(jiān)測(cè)指標(biāo)的可行性；
5)研究中國(guó)人PCA3的ROC曲線以及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)和診斷閾值；
6)研究PCA3異構(gòu)體在中國(guó)前列腺癌患者人群的表達(dá)以及在不同病理分級(jí)的腫瘤標(biāo)本中是否有差異表達(dá)；
7)研究PCA3不同異構(gòu)體表達(dá)下，雄激素受體異構(gòu)體表達(dá)情況，分析兩者是否有相關(guān)性。
(3)利用BDNA技術(shù)檢測(cè):
1)建立用bDNA技術(shù)檢測(cè)尿液中PCA3早期診斷前列腺癌的最佳檢測(cè)流程；
2)建立中國(guó)人PCA3評(píng)分的ROC曲線和PCA3診斷閾值，以及PCA3對(duì)前列腺癌個(gè)體化診斷中的評(píng)估體系；并將PCA3作為無(wú)創(chuàng)性診斷前列腺癌的標(biāo)志物在臨床推廣應(yīng)用；
3)了解中國(guó)前列腺癌患者PCA3異構(gòu)體表達(dá)特異性；
4)了解中國(guó)前列腺癌患者PCA3異構(gòu)體表達(dá)與雄激素受體異構(gòu)體表達(dá)的相關(guān)性。
5)bDNA技術(shù)中使用的探針包括目標(biāo)探針(target probe)、前放大體(preamplifier)、放大體(amplifier)、標(biāo)記探針(label probe),上述探針中只有目標(biāo)探針需要針對(duì)不同的目的基因進(jìn)行不同設(shè)計(jì)，后三種探針對(duì)任何基因的bDNA分析都是通用的，目標(biāo)探針包含了多種針對(duì)PCA3基因不同片段的特異性探針，用于捕捉目標(biāo)基因片段，以便得出更準(zhǔn)確的結(jié)果O
[0012]得出的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù):PCA3探針設(shè)計(jì)初步驗(yàn)證 PCA3探針數(shù)據(jù)分析，一致性初步檢驗(yàn)，32標(biāo)本
【權(quán)利要求】
1.一種BDNA在尿液中檢測(cè)PCA3的應(yīng)用，其特征在于，所采用的操作步驟為: (1)PCA3標(biāo)本搜集 尿液PCA3檢測(cè)使用標(biāo)本為經(jīng)直腸前列腺按摩后的尿液標(biāo)本: 1)檢查前飲水500ml有助于收集尿液標(biāo)本； 2)前列腺指檢后立即搜集尿液； 3)至少要20-30ml尿液，收集在貼好標(biāo)簽的杯子里，必須是最初排泄的尿液標(biāo)本，保存尿液的尿杯里不應(yīng)含任何防腐劑； 4)如果標(biāo)本長(zhǎng)期保存，應(yīng)放_(tái)80°C，短期內(nèi)檢測(cè)放置_20°C保存。 (2)研究PCA3標(biāo)本搜集 1)研究利用PCA3作為靶標(biāo)在前列腺癌診斷個(gè)體化評(píng)估中的可行性； 2)研究bDNA技術(shù)平臺(tái)檢測(cè)經(jīng)直腸前列腺按摩后尿液中PCA3評(píng)分診斷前列腺癌的靈敏度、特異性、檢測(cè)速度，以及是否便于通量檢測(cè)； 3)研究不同臨床分期和病理分級(jí)的前列腺癌患者PCA3評(píng)分變化是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異和臨床意義； 4)研究PCA3評(píng)分，作為前列腺癌進(jìn)展及預(yù)后評(píng)判指標(biāo)和前列腺癌治療后監(jiān)測(cè)指標(biāo)的可行性； 5)研究中國(guó)人PCA3的ROC曲線以及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)和診斷閾值； 6)研究PCA3異構(gòu)體在中國(guó)前列腺癌患者人群的表達(dá)以及在不同病理分級(jí)的腫瘤標(biāo)本中是否有差異表達(dá)； 7)研究PCA3不同異構(gòu)體表達(dá)下，雄激素受體異構(gòu)體表達(dá)情況，分析兩者是否有相關(guān)性。 (3)利用BDNA技術(shù)檢測(cè): 1)建立用bDNA技術(shù)檢測(cè)尿液中PCA3早期診斷前列腺癌的最佳檢測(cè)流程； 2)建立中國(guó)人PCA3評(píng)分的ROC曲線和PCA3診斷閾值，以及PCA3對(duì)前列腺癌個(gè)體化診斷中的評(píng)估體系；并將PCA3作為無(wú)創(chuàng)性診斷前列腺癌的標(biāo)志物在臨床推廣應(yīng)用； 3)了解中國(guó)前列腺癌患者PCA3異構(gòu)體表達(dá)特異性； 4)了解中國(guó)前列腺癌患者PCA3異構(gòu)體表達(dá)與雄激素受體異構(gòu)體表達(dá)的相關(guān)性。 5)bDNA技術(shù)中使用的探針包括目標(biāo)探針(target probe)、前放大體(preamplifier)、放大體(amplifier)、標(biāo)記探針(label probe),上述探針中只有目標(biāo)探針需要針對(duì)不同的目的基因進(jìn)行不同設(shè)計(jì)，后三種探針對(duì)任何基因的bDNA分析都是通用的，目標(biāo)探針包含了多種針對(duì)PCA3基因不同片段的特異性探針，用于捕捉目標(biāo)基因片段，以便得出更準(zhǔn)確的結(jié)果O
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103436594SQ201210391488
【公開(kāi)日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2012年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月16日
【發(fā)明者】張鷺鷺, 張愛(ài)國(guó), 劉桐宇 申請(qǐng)人:科蒂亞(新鄉(xiāng))生物技術(shù)有限公司