一種鑒別紫萁貫眾的特異性引物、其試劑盒及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鑒別紫萁貫眾的特異性引物、其試劑盒及應用。所述引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1-2所示。本發(fā)明為紫萁貫眾的藥材鑒別提供了分子鑒定依據，可從多種藥材中快速、準確地檢測出紫萁貫眾。該方法構建的檢測試劑盒操作簡便，特異性好，靈敏度高，可實現對紫萁貫眾的莖、葉或植物其它部位以及藥材的檢測，適于廣泛的推廣應用。
【專利說明】一種鑒別紫萁貫眾的特異性引物、其試劑盒及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學檢測領域，具體地說，涉及一種鑒別紫萁貫眾的特異性引物、其試劑盒及應用。
【背景技術】
[0002]紫萁貫眾，2010版藥典新增品種，《中華本草》中指出早在《爾雅》《后漢書》等著名典籍中就已有記載。又名大貫眾(《山東中草藥手冊》)等，性苦，微寒，有小毒；歸肺、胃、肝經，具有清熱解毒、止血、殺蟲等功效。《中國藥典》(2010版)收載的紫萁貫眾為紫萁科植物紫萁(Osmunda japonica Thunb.)的干燥根莖和葉柄殘基?，F代藥理作用研究表明，紫萁根狀莖中的多糖成分具有一定廣譜的抑菌作用和驅蟲作用；含有的留體類化合物有明顯的抗病毒活性；含有的蛻皮留酮、紫萁酮等有明顯的抗氧化活性；紫萁的生品和炭品都有一定的凝血作用；以及其他改善記憶、抗癌、提高機體免疫力等作用。紫萁貫眾經常作為貫眾的一種主要商品流通品種，隨著2010版藥典的單獨收載，在使用過程中應特別注意其與貫眾類藥材的混淆問題。
[0003]傳統(tǒng)的鑒別方法如薄層鑒別、顯微鑒別、化學成分鑒別等，以及藥典上給出的水分、灰分、酸不溶性灰分的檢查標準都可以對紫萁進行鑒別，但都不能很準確的鑒別紫萁貫眾，特別是紫萁貫眾偽品較多，如貫眾、莢果蕨、鐵線蕨等，增加了鑒別的難度。隨著分子生物學的發(fā)展，分子標記技術成為鑒別植物的熱門生物技術。限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機擴增多態(tài)DNA (RAPD)、ISSR標記、AFLP技術等得到了廣泛的發(fā)展和應用。但存在成本及操作難易度問題，以及靈敏性和特異性問題。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明目的是提供一種可快速、準確地鑒別紫萁貫眾的特異性引物及含有該引物的試劑盒。
[0005]本發(fā)明另一目的是提供采用上述特異性引物PCR檢測紫萁貫眾的方法。
[0006]本發(fā)明又一目的是提供上述引物或試劑盒在鑒別紫萁貫眾中的應用。
[0007]為了實現本發(fā)明目的，本發(fā)明的紫萁貫眾(Osmunda rhizoma)的PCR檢測特異性引物，其包括
[0008]上游引物F: 5 ’ -TAGAATTAGTGTCAGTAGGAT-3，和
[0009]下游引物R: 5 ’ -GAAAATCAGAGAGACCCTAA-3，。
[0010]本發(fā)明還提供含有上述PCR引物的用于檢測紫萁貫眾的試劑盒。
[0011]所述試劑盒中還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液中的一種或多種。
[0012]優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
[0013]本發(fā)明還提供所述試劑盒在檢測紫萁貫眾中的應用。
[0014]本發(fā)明進一步 提供采用上述特異性引物PCR檢測紫萁貫眾的方法，包括以下步驟:I)提取樣品中的DNA ; 2 )以步驟I)中提取的DNA為模板，使用上述引物F和R，進行PCR擴增反應；3)分析PCR產物，即對上述擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳檢測結果判定樣品中是否含有紫萁貫眾。
[0015]其中，PCR反應體系以26 μ I計為:
[0016]
[0017]
【權利要求】
1.用于鑒別紫萁貫眾的特異性引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.1-2所
2.含有權利要求1所述引物的試劑盒。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液中的一種或幾種。
4.根據權利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，還包括標準陽性模板。
5.權利要求1所述引物或權利要求2-4任一項所述試劑盒在鑒別紫萁貫眾中的應用。
6.一種鑒別紫萁貫眾的方法，包括利用權利要求1所述引物進行PCR擴增的步驟。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增的體系以26μ1計為:模板DNA 2μ I ；2.5Μ dNTPs 2 μ I ;2.5Μ 引物各 I μ I ；5U/1 Taq DNA 聚合酶 0.2 μ I ;10XPCR 反應緩沖液 2.5 μ I ；25mmol/L Mg2+2 μ I ；ddH20 補足至 26 μ L.
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增的體系進一步包括Dye染料2μ 1，ddH20 補足至 26 μ I。
9.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增的條件為:94°C30s, 46°Clmin,72°C Imin0
【文檔編號】C12N15/11GK103725770SQ201210391751
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月15日 優(yōu)先權日:2012年10月15日
【發(fā)明者】陳士林, 黃林芳, 鄭司浩, 楊大堅, 徐宏喜, 卞兆祥, 陳新滋 申請人:中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所, 香港浸會大學