專利名稱：一種誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的方法。
背景技術(shù)：
在不利環(huán)境下，多種細(xì)菌會(huì)進(jìn)入一種活的非可培養(yǎng)(viable butnonculturable，VBNC)狀態(tài)。該狀態(tài)是非芽孢細(xì)菌的一種休眠形式，可以提高細(xì)菌在不利環(huán)境下的存活能力。目前已知60多種細(xì)菌都能進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)，其中絕大部分為致病菌。雖然活的非可培養(yǎng)狀態(tài)細(xì)菌仍然具有代謝活性，但在該菌常用的非選擇性培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)或形成菌落，因此常規(guī)細(xì)菌檢測(cè)方法如平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)不到活的非可培養(yǎng)狀態(tài)細(xì)菌的存在，這樣就可能低估檢測(cè)樣品中細(xì)菌的數(shù)量，給人們帶來(lái)安全隱患。開(kāi)展有關(guān)活的非可培養(yǎng)狀態(tài)細(xì)菌的特征及形成機(jī)制等方面的研究對(duì)有效殺滅活的非可培養(yǎng)狀態(tài)細(xì)菌至關(guān)重要。但由于獲得活的非可培養(yǎng)狀態(tài)細(xì)菌需要很長(zhǎng)的時(shí)間，因此限制了對(duì)其研究的進(jìn)度。目前誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的方法主要是寡營(yíng)養(yǎng)結(jié)合低溫的方法。但該方法所需的誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)，通常要一個(gè)月以上，從而限制了對(duì)活的非可培養(yǎng)狀態(tài)細(xì)菌的研究進(jìn)度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的方法。本發(fā)明提供的誘導(dǎo)目的細(xì)菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的方法，包括如下步驟將目的細(xì)菌經(jīng)高壓二氧化碳處理，使其進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)。上述方法中，所述高壓二氧化碳處理的條件如下壓力為5_7MPa、溫度為25-37°C、時(shí)間為 5-60min。上述方法中，所述高壓二氧化碳處理的條件如下壓力為5MPa、溫度為25°C、時(shí)間為40min ；或壓力為5MPa、溫度為31°C、時(shí)間為30min ；或壓力為5MPa、溫度為37°C、時(shí)間為25min。 在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述高壓二氧化碳處理為將目的細(xì)菌用高壓二氧化碳裝置進(jìn)行高壓二氧化碳處理，在本發(fā)明的實(shí)施例中，高壓二氧化碳裝置型號(hào)CAU-HPCD-I (高密度二氧化碳?xì)⒕b置，在專利ZL200520132590. X中公開(kāi))，具體步驟將20mL待誘導(dǎo)菌液(細(xì)菌懸浮液)裝入玻璃瓶中，用封口膜封好；將菌液放入反應(yīng)釜中，對(duì)菌液進(jìn)行HP⑶處理，處理壓力為5MPa，處理溫度為25°C，保壓時(shí)間為40min ;達(dá)到上述處理參數(shù)后立即卸壓；得到誘導(dǎo)后菌液。上述方法中，在所述高壓二氧化碳處理前還包括如下步驟將所述目的細(xì)菌洗滌、懸浮，得到細(xì)菌懸浮液。上述方法中，所述洗滌和所述懸浮均采用生理鹽水，所述生理鹽水具體為O. 85%(質(zhì)量百分含量)NaCl水溶液。上述方法中，所述目的細(xì)菌為處于對(duì)數(shù)期的目的細(xì)菌。上述方法中，所述目的細(xì)菌為大腸桿菌，所述大腸桿菌具體為Escherichia coli0157:H7。在上述方法中，在高壓二氧化碳處理后，還包括如下步驟檢測(cè)經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)處理后的目的細(xì)菌的活菌數(shù)和可培養(yǎng)菌數(shù)；若可培養(yǎng)菌數(shù)為零而活菌數(shù)不為零，則目的細(xì)菌進(jìn)入了活的非可培養(yǎng)狀態(tài)；其中，檢測(cè)經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)處理后的目的細(xì)菌活菌數(shù)采用PI/SYT09雙染法，檢測(cè)經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)處理后的目的細(xì)菌可培養(yǎng)菌數(shù)采用平板計(jì)數(shù)法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種細(xì)菌培養(yǎng)方法。本發(fā)明提供的細(xì)菌培養(yǎng)方法，包括上述方法的步驟。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明開(kāi)發(fā)一種誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的方法，利用高壓二氧化碳技術(shù)處理細(xì)菌，可促使細(xì)菌在Ih之內(nèi)快速進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)；本發(fā)明的方法加快了活的非可培養(yǎng)狀態(tài)細(xì)菌的制備，提高了有關(guān)活的非可培養(yǎng)狀態(tài)細(xì)菌的研究進(jìn)度。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。實(shí)施例I、誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)一、高壓二氧化碳誘導(dǎo)I、細(xì)菌懸浮液制備采用O. 85% (質(zhì)量百分含量)NaCl水溶液洗滌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E. coli 0157:H7 (菌株編號(hào)NCTC12900)菌體兩次，然后用O. 85% (質(zhì)量百分含量)NaCl水溶液重懸菌體，使菌體濃度約為108cfu/mL，作為待誘導(dǎo)菌液(細(xì)菌懸浮液)；2、高壓二氧化碳處理實(shí)驗(yàn)組用自行設(shè)計(jì)的高壓二氧化碳?xì)⒕鷻C(jī)(型號(hào)CAU-HP⑶-1，高密度二氧化碳?xì)⒕b置，在專利ZL200520132590. X中公開(kāi))對(duì)菌液進(jìn)行高壓二氧化碳處理；具體步驟將20mL待誘導(dǎo)菌液(細(xì)菌懸浮液)裝入玻璃瓶中，用封口膜封好；將菌液放入反應(yīng)釜中，對(duì)菌液進(jìn)行HP⑶處理，處理壓力為5MPa，處理溫度為25°C，保壓時(shí)間為40min ;達(dá)到上述處理參數(shù)后立即卸壓；得到誘導(dǎo)后菌液。對(duì)照組待誘導(dǎo)菌液不進(jìn)行高壓二氧化碳處理，只在25°C放置40min。二、檢測(cè)活菌數(shù)測(cè)定方法采用PI/SYT0 9雙染法；具體步驟將配比好的染料混合物(PI SYTO 9體積比為I: I)與誘導(dǎo)后菌液按照3:1000的比例混合，混合均勻后在室溫下避光孵育15min ;孵育完成后，在熒光顯微鏡下觀察(1000X)并計(jì)數(shù)，通常需要選擇10個(gè)視野，而且一個(gè)樣品要做兩次重復(fù)?？膳囵B(yǎng)菌數(shù)測(cè)定方法采用平板計(jì)數(shù)法；具體步驟參照GB 4789. 2-2010方法，將誘導(dǎo)后菌液用O. 85%NaCl進(jìn)行10倍逐級(jí)稀釋，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)吸取3個(gè)連續(xù)稀釋度的稀釋樣ImL于滅菌平皿中，倒入約20mL TSA培養(yǎng)基搖勻，待培養(yǎng)基凝固后倒置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后記錄菌落數(shù)。采用上述方法分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的活菌數(shù)和可培養(yǎng)菌數(shù)，從而計(jì)算活的非可培養(yǎng)狀態(tài)菌數(shù)(活菌數(shù)-可培養(yǎng)菌數(shù))。以檢測(cè)細(xì)菌是否進(jìn)入了活的非可培養(yǎng)狀態(tài)，當(dāng)可培養(yǎng)菌數(shù)為零而活菌數(shù)不為零時(shí)就認(rèn)為細(xì)菌進(jìn)入了活的非可培養(yǎng)狀態(tài)。結(jié)果如下實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)后菌液的活菌數(shù)為106 79cfu/mL ;誘導(dǎo)后菌液的可培養(yǎng)菌數(shù)為O ;進(jìn)入了活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的菌數(shù)為106 79cfu/mL。
對(duì)照組的可培養(yǎng)菌數(shù)仍約為108cfu/mL，基本認(rèn)為沒(méi)有活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的菌。因此，可以看出，本發(fā)明的方法在高壓二氧化碳誘導(dǎo)40min時(shí)獲得了活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的E. coli 0157:H7。而目前采用的寡營(yíng)養(yǎng)結(jié)合低溫法需要I個(gè)月的時(shí)間，因此本發(fā)明的方法可以誘導(dǎo)細(xì)菌快速進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)。實(shí)施例2、誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)一、高壓二氧化碳誘導(dǎo)I、細(xì)菌懸浮液制備與實(shí)施例I中的一的步驟I的方法相同。2、高壓二氧化碳誘導(dǎo)與實(shí)施例I中的一的步驟2的方法基本相同，僅將處理溫度變?yōu)?1 °C，保壓時(shí)間變?yōu)?0min ;得到誘導(dǎo)后菌液。二、檢測(cè)與實(shí)施例I中的二的方法相同。結(jié)果如下實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)后菌液的活菌數(shù)為106 89cfU/mL ;誘導(dǎo)后菌液的可培養(yǎng)菌數(shù)為O ;因此進(jìn)入了活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的菌數(shù)為106 89cfu/mL。對(duì)照組的可培養(yǎng)菌數(shù)仍約為108cfu/mL，基本認(rèn)為沒(méi)有活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的菌。因此，可以看出，本發(fā)明的方法在高壓二氧化碳誘導(dǎo)30min時(shí)獲得了活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的 E. coli 0157:H7。本實(shí)施例同實(shí)施例I相比，高壓二氧化碳使E. coli 0157:H7進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的誘導(dǎo)時(shí)間更加縮短，而且獲得的活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的菌數(shù)與實(shí)施例I接近。實(shí)施例3、誘導(dǎo)細(xì)菌快速進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)一、高壓二氧化碳誘導(dǎo)I、細(xì)菌懸浮液制備與實(shí)施例I中的一的步驟I的方法相同。2、高壓二氧化碳誘導(dǎo)與實(shí)施例I中的一的步驟I的方法基本相同，僅將處理溫度變?yōu)?7°C，保壓時(shí)間變?yōu)?5min ;得到誘導(dǎo)后菌液。結(jié)果如下實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)后菌液的活菌數(shù)為IO5 72CfVmL ;誘導(dǎo)后菌液的可培養(yǎng)菌數(shù)為O ;因此進(jìn)入了活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的菌數(shù)為105 72cfu/mL。對(duì)照組的可培養(yǎng)菌數(shù)仍約為108cfu/mL，基本認(rèn)為沒(méi)有活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的菌。因此，可以看出，本發(fā)明的方法在高壓二氧化碳誘導(dǎo)25min時(shí)獲得了活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的 E. coli 0157:H7。本實(shí)施例同實(shí)施例I和2相比，高壓二氧化碳使E. coli 0157:H7進(jìn)入活的非可培 養(yǎng)狀態(tài)的誘導(dǎo)時(shí)間更短，但獲得的活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的菌數(shù)要低于實(shí)施例I和2。
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)目的細(xì)菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的方法，包括如下步驟將目的細(xì)菌經(jīng)高壓二氧化碳處理，使其進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述高壓二氧化碳處理的條件如下壓力為 5-7MPa、溫度為 25-37°C、時(shí)間為 5_60min。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述高壓二氧化碳處理的條件如下 壓力為5MPa、溫度為25°C、時(shí)間為40min ； 或壓力為5MPa、溫度為31°C、時(shí)間為30min ； 或壓力為5MPa、溫度為37°C、時(shí)間為25min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于在所述高壓二氧化碳處理前還包括如下步驟將所述目的細(xì)菌洗滌、懸浮，得到細(xì)菌懸浮液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述洗滌和所述懸浮均采用生理鹽水，所述生理鹽水具體為O. 85% (質(zhì)量百分含量)NaCl水溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述目的細(xì)菌為處于對(duì)數(shù)期的目的細(xì)菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述目的細(xì)菌為大腸桿菌，所述大腸桿菌具體為 Escherichia coli 0157:H7。
8.—種細(xì)菌培養(yǎng)方法，包括權(quán)利要求1-7任一所述方法的步驟。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟將目的細(xì)菌經(jīng)高壓二氧化碳處理，使其進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明開(kāi)發(fā)一種誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的方法，利用高壓二氧化碳技術(shù)處理細(xì)菌，可促使細(xì)菌在1h之內(nèi)快速進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)；本發(fā)明的方法加快了活的非可培養(yǎng)狀態(tài)細(xì)菌的制備，提高了有關(guān)活的非可培養(yǎng)狀態(tài)細(xì)菌的研究進(jìn)度。
文檔編號(hào)C12N1/04GK102899272SQ20121039252
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月16日
發(fā)明者廖小軍, 趙鳳 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)