專利名稱：氨基糖苷類藥物性耳聾易感基因檢測(cè)試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及熒光PCR-熔解曲線法對(duì)氨基糖苷類藥物性耳聾易感基因進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
據(jù)我國(guó)2006年第二次全國(guó)殘疾人抽樣調(diào)查顯示，聽力殘疾者2004萬人，占全國(guó)8296萬殘疾人的24. 16%，其中藥物致聾的占30%_40%，人數(shù)多達(dá)800萬。藥物性耳聾指的是使用某些藥物治病或人體接觸某些化學(xué)制劑所引起的耳聾。目前已發(fā)現(xiàn)耳毒性藥物達(dá)100多種，而耳毒性抗生素最為常見。氨基糖苷類抗生素是最常見的耳毒性抗生素，包括臨床上常用的鏈霉素、慶大霉素等。近十年來已經(jīng)明確了幾個(gè)與氨基糖苷類抗生素有關(guān)的線粒體突變，其中A1555G、C1494T等在中國(guó)人群中的發(fā)生頻率高達(dá)4%。因此，檢測(cè)氨基糖苷類藥物性耳聾線粒體突變位點(diǎn)，對(duì)耳聾的診斷、早期篩查，以及提供用藥指導(dǎo)有著重要的意義。目前市場(chǎng)上針對(duì)耳聾基因檢測(cè)的試劑盒種類較少，常見的線粒體突變檢測(cè)方法有PCR-RFLP法、微陣列芯片法、ARMS-PCR法、熒光定量PCR法、直接測(cè)序法等。國(guó)內(nèi)臨床常用的方法為微陣列芯片法和熒光定量PCR法等，他們主要的技術(shù)缺陷如下I、微陣列芯片法能對(duì)突變基因位點(diǎn)具體分型，且檢測(cè)基因型相對(duì)多，但其有幾大缺點(diǎn)檢測(cè)需經(jīng)過全血DNA提取(30min)、PCR擴(kuò)增(2h以上)、產(chǎn)物雜交分析(Ih以上)等步驟，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)(4h以上)，操作繁瑣，不能滿足臨床對(duì)致聾基因大量篩查的需求；由于操作流程過多，容易造成樣本交叉污染；其次，對(duì)單個(gè)堿基的辨識(shí)率比較低，易出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性，使結(jié)果的準(zhǔn)確率受到影響；此外，微陣列芯片成本過高，需要專門的芯片掃描儀器，檢測(cè)成本高，如博奧生物生產(chǎn)的“晶芯”系列產(chǎn)品，一人份檢測(cè)需要千元以上，難以在臨床上大范圍推廣。因此，有必要研發(fā)檢測(cè)時(shí)間短、成本低且適合對(duì)藥物致聾基因進(jìn)行篩查的產(chǎn)品。2、現(xiàn)有PCR法產(chǎn)品的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)時(shí)間短，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，成本低，但其有以下缺
占-
^ \\\ ·普通ARMS-PCR產(chǎn)品的擴(kuò)增效率僅為正常擴(kuò)增的1_10%，因此擴(kuò)增體系缺乏穩(wěn)定性；四引物ARMS-PCR的一個(gè)反應(yīng)只能檢一個(gè)突變位點(diǎn)中生北控生物有限公司的產(chǎn)品可以檢測(cè)四個(gè)耳聾基因突變位點(diǎn)，但是每個(gè)位點(diǎn)需要一個(gè)反應(yīng)管，多重PCR難以實(shí)現(xiàn)，檢測(cè)過程繁瑣。普通PCR產(chǎn)品共有的缺點(diǎn)在結(jié)果判讀時(shí)需要通過條帶大小判斷基因型，缺乏直觀性。凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果容易造成PCR交叉污染、檢測(cè)靈敏度低且耗時(shí)長(zhǎng)。3、利用Taqman探針進(jìn)行基因分型，靈敏度高，特異性強(qiáng)，但有以下缺點(diǎn)利用Taqman探針進(jìn)行SNP突變檢測(cè),每檢測(cè)一個(gè)位點(diǎn)需要2條探針,且對(duì)探針靈敏度有較高要求。探針合成成本較高，對(duì)熒光PCR儀的通道數(shù)有要求，不利于推廣。當(dāng)前的檢測(cè)試劑盒每個(gè)反應(yīng)僅檢測(cè)一個(gè)位點(diǎn)。如目前北京科聆金儀生物技術(shù)有限公司，解放軍301醫(yī)院開發(fā)的熒光檢測(cè)產(chǎn)品也僅一次檢測(cè)單一位點(diǎn)。尚無能一次檢測(cè)多位點(diǎn)的產(chǎn)品問世。4、直接測(cè)序法的優(yōu)點(diǎn)是能夠確切的知道所檢測(cè)區(qū)域的基因序列，準(zhǔn)確度高，但是有以下缺點(diǎn)檢測(cè)過程繁瑣，周期過長(zhǎng)測(cè)序之前需要對(duì)目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，再進(jìn)行毛細(xì)管電泳測(cè)序，整個(gè)過程需要嚴(yán)格質(zhì)控；測(cè)序反應(yīng)成本較高，需要昂貴的熒光標(biāo)記的核酸和專業(yè)的測(cè)序儀，不適合臨床推廣。測(cè)序結(jié)果的判讀比較復(fù)雜，需要經(jīng)過專業(yè)訓(xùn)練。綜上所述現(xiàn)有的常用方法，如熒光定量PCR法檢測(cè)基因，僅檢測(cè)線粒體上單一突變位點(diǎn)，大部分熒光定量PCR法無內(nèi)標(biāo)，不能進(jìn)行質(zhì)量控制；微陣列態(tài)芯片產(chǎn)品操作時(shí)間長(zhǎng)、成本高、準(zhǔn)確度低且需特殊儀器。大規(guī)模篩查線粒體基因突變，要求快速、低成本、檢測(cè)范圍廣，以上產(chǎn)品無法同時(shí)滿足。針對(duì)上述問題，急需一種比現(xiàn)有方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)范圍廣、檢測(cè)靈敏度高的產(chǎn)品，切實(shí)滿足氨基糖苷類藥物性耳聾易感基因篩查的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用等位基因特異性PCR(Allele Specific PCR)，聯(lián)合熔解曲線分析(Melting Curve Analysis),利用產(chǎn)物Tm值的差異對(duì)不同樣本進(jìn)行基因檢測(cè),無需探針、無需對(duì)引物進(jìn)行特殊修飾，成本低廉。能快速、準(zhǔn)確檢測(cè)線粒體上兩個(gè)易感基因位點(diǎn)。本發(fā)明的技術(shù)方案為提供一種氨基糖苷類藥物性耳聾易感基因檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括PCR反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品；所述PCR反應(yīng)液包括弓I物、PCR Buffer、dNTP混合液、飽和熒光染料、Taq酶和UNG酶；所述dNTP混合液為dATP、dCTP、dGTP和dUTP的混合液；所述引物包括1494位點(diǎn)特異性引物T，所述引物T的序列為SEQ ID NO: I ；1555位點(diǎn)特異性引物G，所述引物G的序列為SEQ ID NO: 2 ；兩位點(diǎn)公用的下游引物R，所述引物R的序列為SEQ ID NO:3 ；一對(duì)內(nèi)參beta-actin弓丨物Al和引物A2，所述引物Al的序列為SEQ ID N0:4，所述引物A2的序列為SEQ ID NO: 5。其中，所述陰性質(zhì)控品為帶有正常人線粒體DNA片段的質(zhì)粒載體。所述陽(yáng)性質(zhì)控品分為1494陽(yáng)性質(zhì)控品和1555陽(yáng)性質(zhì)控品，即帶有1494突變或1555突變的人線粒體DNA片段的質(zhì)粒載體。優(yōu)選的，上述的氨基糖苷類藥物性耳聾易感基因檢測(cè)試劑盒，所述PCR反應(yīng)液中引物終濃度為50-500nM，PCR Buffer中的MgCl2終濃度為I. 5_9mM，所述dNTP混合液的各組分終濃度為100-300nM，Taq酶終濃度為1_7. 5IU/反應(yīng)，UNG酶終濃度為O. 05-0. 3IU/反應(yīng)。優(yōu)選的，上述的氨基糖苷類藥物性耳聾易感基因檢測(cè)試劑盒，所述飽和熒光染料為 EvaGreen 染料、LC Green PLUS 染料、ResoLight 染料或 SYTO 9 染料。優(yōu)選的，上述的氨基糖苷類藥物性耳聾易感基因檢測(cè)試劑盒，所述的PCR反應(yīng)液各組分含量為去離子水16·14μ L ;10XPCR buffer 2. 5 μ L ； IOmM dATP、dCTP、dGTP、dUTP 的等體積混合液2 μ L ;IOmM dUTP 0. 5μ L ；100 μ M引物 Al :0. OlyL ;100 μ M引物 Α2 :0. OlyL ;100 μ M 引物 G :0· 04μ L ;ΙΟΟμΜ 引物 T :0.03yL ;ΙΟΟμΜ 引物 R:0.02yL ;20 X Evagreen I. 25 μ L ；5U/y L超純 Taq 酶0. 2μ L ;·
IU/μ L UNG :0. 3 μ L。本發(fā)明的又一技術(shù)方案為提供一種氨基糖苷類藥物性耳聾易感基因檢測(cè)方法，包括如下步驟(I)采用上述任一項(xiàng)所述的試劑盒對(duì)樣品的模板DNA的目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2)對(duì)PCR產(chǎn)物的目的基因的突變位點(diǎn)進(jìn)行熔解曲線分析。上述的氨基糖苷類藥物性耳聾易感基因檢測(cè)方法，所述步驟(I)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為50°C>I-IOmin ；90-95°C> IOmin ；95°C>5-30s,50-65°C>30-90s, 30-45 個(gè)循環(huán)。優(yōu)選的，上述的氨基糖苷類藥物性耳聾易感基因檢測(cè)方法，所述步驟(I)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件具體為50°C、5min;90-95°C> IOmin ；95oC>15s,60°C>30s,72°C>30s,35 個(gè)循環(huán)。優(yōu)選的，上述的氨基糖苷類藥物性耳聾易感基因檢測(cè)方法，所述步驟(2) PCR產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析的程序?yàn)?0°C _90°C連續(xù)檢測(cè)，15次/S?，F(xiàn)有的常用方法，如熒光定量PCR法檢測(cè)基因，僅檢測(cè)線粒體上單一突變位點(diǎn)，大部分熒光定量PCR法無內(nèi)標(biāo)，不能進(jìn)行質(zhì)量控制；微陣列態(tài)芯片產(chǎn)品操作時(shí)間長(zhǎng)、成本高、準(zhǔn)確度低且需特殊儀器，大規(guī)模篩查線粒體基因突變，要求快速、低成本、檢測(cè)范圍廣，以上產(chǎn)品無法同時(shí)滿足。本發(fā)明根據(jù)氨基糖苷類藥物性耳聾易感基因SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異的PCR引物，使得僅突變模板能擴(kuò)增，在熔解曲線分析時(shí)顯示Tm值特征峰，而正常模板只能擴(kuò)增內(nèi)控基因，采用多重PCR熒光檢測(cè)法及熔解曲線分析法，能在同一 PCR反應(yīng)中檢測(cè)2個(gè)氨基糖苷類藥物性耳聾易感位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)一管操作對(duì)線粒體基因突變位點(diǎn)的分型。本發(fā)明基因檢測(cè)無需探針、無需對(duì)引物進(jìn)行特殊修飾，成本低廉，并且檢測(cè)快速、準(zhǔn)確。相比現(xiàn)有方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)范圍更廣，檢測(cè)靈敏度更高，切實(shí)滿足氨基糖苷類藥物性耳聾易感基因篩查的需求。


圖I :突光PCR熔解曲線檢測(cè)線粒體C1494T突變陽(yáng)性樣本的溶解曲線；圖2 :熒光PCR熔解曲線檢測(cè)線粒體A1555G突變陽(yáng)性樣本的溶解曲線；圖3 :突光PCR熔解曲線檢測(cè)線粒體突變陰性樣本的溶解曲線。
具體實(shí)施例方式為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式并配合附圖詳予說明。本發(fā)明采用等位基因特異性PCR，是利用Taq酶缺乏3’ _5’外切酶活性，當(dāng)引物的3’端不能與模板完全配對(duì)，則PCR擴(kuò)增不能進(jìn)行。因此，理想狀況下，將引物3’端設(shè)計(jì)為僅與突變模板匹配，而與正常模板不匹配，此引物即只能擴(kuò)增突變模板，而對(duì)正常模板不擴(kuò)增，從而達(dá)到分型的作用。同時(shí)，在引物3’端其他位置，如2、3、4位，引入突變堿基，可以增強(qiáng)引物的特異性，徹底抑制非特異擴(kuò)增。因此，針對(duì)某一位點(diǎn)，可以設(shè)計(jì)方向相反的兩條特異性引物，一條僅擴(kuò)增突變模板，另一條僅擴(kuò)增正常模板，同時(shí)設(shè)計(jì)相配合的上下游引物，使得正常模板的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度與突變模板的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度有差異，通過電泳時(shí)片段大小的差異，可以判斷樣本的基因型。從這一方面來說，等位基因特異性PCR是一種簡(jiǎn)便易行的基因檢測(cè)方法，引物不需要昂貴的特殊的標(biāo)記，操作簡(jiǎn)便，適用于檢測(cè)本發(fā)明中氨基糖苷類藥物致聾易感基因位點(diǎn)的檢測(cè)。不同序列的DNA，Tm值與GC含量，長(zhǎng)度和二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。利用DNA雙鏈嵌合染料可以進(jìn)行熔解曲線分析，在緩慢升溫的過程中，DNA逐漸解鏈并釋放出染料分子，熒光值隨即下降，由此可以計(jì)算出此DNA鏈的Tm值，根據(jù)Tm值的不同判斷擴(kuò)增片段的性質(zhì)。熒光熔解曲線法能夠通過產(chǎn)物Tm值的不同區(qū)分不同片段長(zhǎng)度的產(chǎn)物，較凝膠電泳法靈敏度更高；同時(shí)可以杜絕由于產(chǎn)物開蓋引起的PCR產(chǎn)物氣溶膠污染。熔解曲線法與等位基因特異性PCR聯(lián)用，可以制造低成本、簡(jiǎn)便性和實(shí)用性強(qiáng)的診斷試劑盒，極為適合臨床診斷和大規(guī)模篩查。實(shí)施例I本發(fā)明試劑盒的制備使用本發(fā)明試劑盒包含PCR反應(yīng)液及質(zhì)控品。PCR反應(yīng)液中包含Taq酶、DNA雙鏈嵌合染料、擴(kuò)增引物、擴(kuò)增緩沖液和dN(U)TP等，dN(U)TP即為dNTP混合液。PCR反應(yīng)程序在熒光PCR儀上運(yùn)行并讀取檢測(cè)結(jié)果。I、氨基糖苷類藥物性耳聾易感基因檢測(cè)引物設(shè)計(jì)根據(jù)位點(diǎn)特異性引物設(shè)計(jì)原理，將突變位點(diǎn)設(shè)為引物的3’端，并在3’端的第2、3、4位引入點(diǎn)突變以提高特異性。最終從20條引物中篩選出了 5條可以使用的位點(diǎn)特異性引物，其中針對(duì)1555位點(diǎn)兩條，針對(duì)1494位點(diǎn)三條。突變位點(diǎn)的位置對(duì)引物的特異性至關(guān)重要，一些突變位點(diǎn)不能夠阻遏引物對(duì)正常模板的擴(kuò)增；或者由于過強(qiáng)的擴(kuò)增抑制作用，造成突變模板亦不能擴(kuò)增。要確保篩選得到的引物在一定的擴(kuò)增系統(tǒng)中僅能擴(kuò)增突變模板，而對(duì)正常模板不擴(kuò)增。同時(shí)，篩選10條1494和1555共同的下游的引物，使得C1494T、A1555G突變模板的PCR產(chǎn)物的Tm值能夠在熔解曲線分析時(shí)分離，Tm值分離才能夠通過判斷Tm值達(dá)到分型的目的；同時(shí)必須避免副產(chǎn)物的發(fā)生，副產(chǎn)物會(huì)產(chǎn)生非特異的Tm峰值，對(duì)結(jié)果的判讀造成干擾。選擇基因組上的管家基因beta-actin，作為擴(kuò)增體系驗(yàn)證的內(nèi)控。最終，選定一條1555位點(diǎn)特異性引物、一條1494位點(diǎn)特異性引物、一條兩位點(diǎn)公用的下游引物和一對(duì)beta-actin引物。經(jīng)過篩選后的引物序列如表I所示。
權(quán)利要求
1.一種氨基糖苷類藥物性耳聾易感基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括PCR反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品；所述PCR反應(yīng)液包括引物、PCR Buffer、dNTP混合液、飽和熒光染料、Taq酶、UNG酶；所述dNTP混合液為dATP、dCTP、dGTP和dUTP的混合液；所述引物包括1494位點(diǎn)特異性引物T，所述引物T的序列為SEQ ID NO: I ；1555位點(diǎn)特異性引物G，所述引物G的序列為SEQ ID NO: 2 ；兩位點(diǎn)公用的下游引物R，所述引物R的序列為SEQ ID NO:3 ；一對(duì)內(nèi)參beta-actin引物Al和引物A2，所述引物Al的序列為SEQ ID N0:4，所述引物A2的序列為SEQ ID NO: 5。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的氨基糖苷類藥物性耳聾易感基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液中引物終濃度為50-500nM，PCR Buffer中的MgC12終濃度為I. 5_9mM，所述dNTP混合液的各組分終濃度為100-300nM，Taq酶終濃度為1_7. 5IU/反應(yīng)，UNG酶終濃度為O. 05-0. 3IU/反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的氨基糖苷類藥物性耳聾易感基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述飽和熒光染料為EvaGreen染料、LC Green PLUS染料、ResoLight染料或SYTO 9染料。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的氨基糖苷類藥物性耳聾易感基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的PCR反應(yīng)液各組分含量為去離子水16. 14μ L ；IOXPCR buffer 2. 5μ L ；IOmM dATP、dCTP、dGTP、dUTP 的等體積混合液2 μ L ;IOmM dUTP 0. 5μ L ；100 μ M 弓丨物 Al 0. 01 μ L ；100 μ M 弓丨物 Α2 0. 01 μ L ；100y]\^_G:0· 04μ L ；100 μ M 引物 T 0. 03μ L ；100 μ M <51^ R 0. 02μ L ；20XEvagreen 1. 25 μ L ；5U/yL 超純 Taq 酶0.2yL;lU/μ L UNG :0. 3 μ L。
5.一種氨基糖苷類藥物性耳聾易感基因檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟(1)采用權(quán)利要求I至4任一項(xiàng)所述的氨基糖苷類藥物性耳聾易感基因檢測(cè)試劑盒對(duì)樣品的模板DNA的目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2)對(duì)PCR產(chǎn)物的目的基因的突變位點(diǎn)進(jìn)行熔解曲線分析。
6.根據(jù)權(quán)利要求書5所述的氨基糖苷類藥物性耳聾易感基因檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(I)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為50°C>I-IOmin ；90-95°C> IOmin ；95°C> 5-30s，50-65 °C、30_90s，30-45 個(gè)循環(huán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求書6所述的氨基糖苷類藥物性耳聾易感基因檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(I)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件具體為50°C>5min ；90-95°C> IOmin ；95°C、15s，60°C、30s，72°C、30s，35 個(gè)循環(huán)。
8.根據(jù)權(quán)利要求書5所述的氨基糖苷類藥物性耳聾易感基因檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(2) PCR產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析的程序?yàn)?0°C -90°C連續(xù)檢測(cè)，15次/s。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及熒光PCR-熔解曲線法對(duì)氨基糖苷類藥物性耳聾易感基因進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒及方法。本發(fā)明的技術(shù)方案為提供一種氨基糖苷類藥物性耳聾易感基因檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括PCR反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品，所述PCR反應(yīng)液包括引物、PCR Buffer、dNTP混合液、飽和熒光染料、Taq酶、UNG酶。本發(fā)明根據(jù)氨基糖苷類藥物性耳聾易感基因SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異的PCR引物，能在同一PCR反應(yīng)中檢測(cè)2個(gè)氨基糖苷類藥物性耳聾易感位點(diǎn)，一管操作，檢測(cè)范圍廣并且快速、準(zhǔn)確。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102925562SQ20121039386
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月17日
發(fā)明者王小薇, 劉晶晶, 危林耿, 任維 申請(qǐng)人:亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司