專利名稱：與神經(jīng)遷移功能相關(guān)的大鼠源miRNA、相應(yīng)的miRNA前體和反義寡核苷酸及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)專業(yè)領(lǐng)域，涉及與神經(jīng)遷移功能相關(guān)的大鼠源miRNA、miRNA前體和其反義寡核苷酸序列，以及在制備治療神經(jīng)再生藥物中的用途。
背景技術(shù)：
周圍神經(jīng)損傷是常見的臨床病癥，而周圍神經(jīng)損傷后能夠再生。miRNA(microRNA,微RNA)是ー類具有19 25nt的RNA分子，由其前體分子在酶的作用下加工生成，其前體序列一般為70 120nt，廣泛存在于生物體中。由于miRNA在各種生物體中具有保守性，因此普遍認為miRNA的功能是參與生命的ー些基本過程；在動物機體，miRNA通過轉(zhuǎn)錄后 調(diào)控許多基因和蛋白的表達，在發(fā)育、分化、増殖、細胞的存活與癌變以及神經(jīng)系統(tǒng)等發(fā)揮重要作用?；A(chǔ)和臨床研究表明，miRNA無論在正常生理過程還是在疾病過程中都是重要的調(diào)節(jié)因子。許多miRNA呈現(xiàn)組織特異性表達，因此在調(diào)控組織特異性和組織特異性基因的功能中發(fā)揮重大作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)miRNA與神經(jīng)再生有著極為密切的關(guān)系，例如，miRNA在軸突生長及突觸功能和可塑性等方面具有調(diào)控作用。雖然已經(jīng)在各種生物發(fā)現(xiàn)了相當(dāng)數(shù)量的miRNA，但仍不斷有許多新的miRNA被挖掘，特別是那些在特定組織或特定階段表達的miRNA。周圍神經(jīng)損傷和再生過程中，許多基因和蛋白的表達水平發(fā)生改變，而單個miRNA能夠調(diào)控成千上百個靶基因的表達，因此作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的miRNA的發(fā)現(xiàn)和功能鑒定對基于miRNA的周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
由于各種意外造成的神經(jīng)損傷的發(fā)病率逐年増加；而神經(jīng)損傷后，再生能力差，致殘率高，因此本發(fā)明針對神經(jīng)損傷和治療的生物分子的發(fā)現(xiàn)具有重要的應(yīng)用價值。本發(fā)明以大鼠坐骨神經(jīng)離斷后的L4-6背根神經(jīng)節(jié)和近端神經(jīng)為材料進行miRNA的Solexa測序。測序結(jié)果經(jīng)過SOAP軟件與大鼠基因組序列比對，MIREAP軟件分析miRNA前體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，濾掉自由能大于-20 kcal/mol的候選miRNA,基于miRBasel7. O過濾掉已報道的miRNA，MiPred軟件進一步過濾掉功能上非保守的虛擬的miRNA前體等生物信息學(xué)分析，并進ー步通過RT-PCR驗證。然后對這些新的miRNA進行功能篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了與遷移有關(guān)的miRNA。本發(fā)明所提供的miRNA克隆自大鼠坐骨神經(jīng)離斷后的L4-6背根神經(jīng)節(jié)和近端神經(jīng)，成熟miRNA序列長度約為22nt，其前體序列具有miRNA前體典型的ニ級結(jié)構(gòu)，符合miRNA的結(jié)構(gòu)特征。本發(fā)明的目的是提供一種與神經(jīng)遷移功能相關(guān)的大鼠源miRNA、miRNA前體和其反義寡核苷酸序列，以及該發(fā)明所涉及的miRNA、miRNA前體和其反義寡核苷酸在制備神經(jīng)損傷藥物中的用途。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下
本發(fā)明所提供的與神經(jīng)遷移功能相關(guān)的大鼠源miRNA序列如下miRNA-sx7 5’ -UGUCUGGGAGCAGCCAAGGACA-3’ 染色體定位 16pl6。據(jù)此，本發(fā)明所提供的與神經(jīng)遷移功能相關(guān)的大鼠源miRNA的前體RNA序列如下
5，- CG⑶UU⑶AC腳CUGGGAGCAGCCAAGGACAA⑶UACCUCU腳CUU CUGUCCUUGGCCUUCCUAGGUGUCCAAGCUCACGCAGGCUGGGAGCCA -3，。據(jù)此，本發(fā)明所提供的與神經(jīng)遷移功能相關(guān)的大鼠源miRNA的反義寡核苷酸序列如下
miRNA-sx7 反義寡核苷酸 5’ - TGTCCTTGGCTGCTCCCAGACA -3’。
本發(fā)明提供的miRNA及其前體序列、反義寡核苷酸序列也可采用化學(xué)合成的方法得到；為增強其穩(wěn)定性、生物利用度、組織靶向性等藥學(xué)特征，可對其進行硫代修飾或甲氧基修飾，也可采取兩種方法結(jié)合修飾。本發(fā)明提供的miRNA及其前體序列、反義寡核苷酸序列可用于制備治療周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的藥物?？梢砸云鋮g獨或混合形式為有效組分配制成非腸道給藥制劑，依據(jù)給藥模式、受害者的體征以適量劑量給藥，也可采用基因治療的方法，以治療或病毒為表達載體，使其在周圍神經(jīng)損傷部位高效表達。


圖I為本發(fā)明所述的miRNA及其前體和反義寡核苷酸序列。圖2為本發(fā)明所述的miRNA RT-PCR電泳結(jié)果。圖3為本發(fā)明所述的miRNA轉(zhuǎn)染施萬細胞后對施萬細胞遷移的影響圖示。圖4為本發(fā)明所述的miRNA轉(zhuǎn)染施萬細胞后對施萬細胞遷移的影響結(jié)果。圖5為本發(fā)明所述的miRNA的靶基因雙報告基因系統(tǒng)分析結(jié)果。
具體實施例方式以下通過實施例說明本發(fā)明的具體エ藝步驟，但不受實施例限制。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非另有說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體實施例并參照數(shù)據(jù)進ー步詳細描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。實施例I動物模型構(gòu)建和樣品制備
成年雄性 SD 大鼠(180 220g)被麻醉后(10 mg/kg xylazine, 95 mg/kg keUamine,acepromazine 0. 7 mg/kg),左后肢外側(cè)坐骨神經(jīng)被切開ー個I cm長的切ロ，然后皮膚被縫合。動物飼養(yǎng)在合適的溫度和濕度條件下進行，每天12 h光照，自由飲水和采食。坐骨神經(jīng)切斷后的0，I, 4，7和14天，處死大鼠，取大鼠坐骨神經(jīng)離斷后的L4-6背根神經(jīng)節(jié)和坐骨神經(jīng)缺ロ處向上O. 5 cm的近端神經(jīng)用于分析。實施例2 RNA提取和Solexa測序 (I) RNA提取
取大鼠近端神經(jīng)樣品，用Trizol試劑盒(Invitrogen)提取總RNA,操作步驟按Trizol試劑盒自帶說明書進行。使用Ultrospec 3000型紫外分光光度計(AmershamBiosciences)測定提取的RNA在260nm (OD260)和280nm (OD28tl)波長的吸光度值以確定RNA的純度和濃度。質(zhì)量合格的RNA濃度應(yīng)在I μ g/ μ I以上，0D26(l/0D28(l的比值在I. 8-2. O之間，且經(jīng)電泳檢測條帶清晰，無明顯降解和DNA污染。(2)小RNA文庫的構(gòu)建
將質(zhì)量合格的大鼠總RNA用于構(gòu)建小RNA文庫，構(gòu)建好的文庫采用Solexa測序高通量測序(北京基因組研究所)。18 30 nt的小RNA經(jīng)過凝膠純化，連接到Solexa測序接頭，連接產(chǎn)物被純化、逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)過凝膠純化后進行測序，測序得到的圖像文件被轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號，在移去雜質(zhì)信號和接頭序列后，結(jié)果被計算機分析處理。(3) miRNA 的篩選
從Solexa測序得到的小分子RNA序列首先用SOAP軟件與大鼠基因組序列比對(LiRj Li Y， Kristiansen K， Wang J. 2008. SOAP: short oligonucleotide alignmentprogram. Bioinformatics 24:713-714) ；MIREAP 用來分析候選 miRNA 的發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Chen X，Li Qj Wang Jj Guo X，Jiang X，Ren Zj Weng C，Sun Gj Wang X，Liu Y，Ma Lj Chen JYj Wang Jj Zen K，Zhang Jj Zhang CY. 2009. Identification andcharacterization οι novel amphioxus microRNAs by Solexa sequencing, genomeBiol 10:R78);濾掉自由能大于-20 kcal/mol 的候選 miRNA (Wang X，Zhang J，Li F，GuJj He Tj Zhang X，Li Y. 2005. MicroRNA identification based on sequence andstructure alignment. Bioinformatics 21:3610-3614);基于 miRBasel7. 0，過濾掉已報道的 miRNA (Griffiths-Jones S，Saini HKj van DSj Enright AJ. 2008. miRBase:tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res 36:D154_D158) ;MiPred進ー步過濾掉功能上非保守的虛擬的 miRNA 前體(pre-miRNA) ( Jiang P，Wu H，Wang Wj Ma Wj SunX， Lu Z. 2007. MiPred: classification of real and pseudo microRNA precursorsusing random forest prediction model with combined features. Nucleic Acids Res35:W339-W344)。(4) RT-PCR 分析
同Solexa測序的小分子RNA用來進行定量RT - PCR分析；10 ng的RNA用莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物(RT-miRNA-sx8)和TaqMan反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ABI)逆轉(zhuǎn)錄到cDNA。然后進行PCR實驗，用三蒸水作為陰性模板對照，進行PCR分析，PCR條件為94°C 30 sec，60°C I min，72°C 20sec, 30 cycle。本發(fā)明所述的miRNA及其前體以及反義寡核苷酸的引物序列如下，圖2為對應(yīng)電
泳結(jié)果。引物序列如下
權(quán)利要求
1.與神經(jīng)遷移功能相關(guān)的大鼠源miRNA，具有如下核苷酸序列 miRNA-sx7 5’ -UGUCUGGGAGCAGCCAAGGACA-3’ 染色體定位 16pl6。
2.如權(quán)利要求I所述的大鼠源miRNA的前體RNA，具有如下核苷酸序列 miRNA-sx7 前體 5，- CG⑶UU⑶AC腳CUGGGAGCAGCCAAGGACAA⑶UACCUCU腳CUU CUGUCCUUGGCCUUCCUAGGUGUCCAAGCUCACGCAGGCUGGGAGCCA -3'
3.如權(quán)利要求I所述的大鼠源miRNA的反義寡核苷酸，具有如下核苷酸序列 miRNA-sx7 反義寡核苷酸 5’ - TGTCCTTGGCTGCTCCCAGACA-3 ’。
4.如權(quán)利要求1-3所述的核苷酸，其特征在于對該序列進行了硫代修飾、甲氧基修飾或兩者的結(jié)合修飾。
5.如權(quán)利要求1-3所述的核苷酸，其特征在于該序列通過化學(xué)合成獲得。
6.如權(quán)利要求1-3所述的核苷酸，其特征在于該序列通過構(gòu)建真核細胞表達載體進行表達獲得。
7.如權(quán)利要求6所述的核苷酸，其特征在于所述載體為質(zhì)粒載體或病毒載體。
8.如權(quán)利要求3所述的反義寡核苷酸，該核苷酸選自DNA或RNA。
9.如權(quán)利要求1-3所述核苷酸序列在制備治療周圍神經(jīng)損傷藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了與大鼠坐骨神經(jīng)離斷過程中神經(jīng)遷移功能相關(guān)的大鼠源miRNA、其前體序列和反義寡核苷酸序列，以及其在制備治療周圍神經(jīng)損傷藥物中的用途。
文檔編號C12N15/113GK102864148SQ20121039422
公開日2013年1月9日 申請日期2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月24日
發(fā)明者于彬, 顧曉松, 丁斐, 楊宇民, 姚登兵, 湯欣, 王勇軍 申請人:南通大學(xué)