專利名稱：奶山羊乳房炎病原菌多重pcr檢測(cè)試劑盒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種奶山羊乳房炎病原菌多重PCR檢測(cè)試劑盒的制備方法。背景技術(shù)：
羊奶及其奶制品有著優(yōu)良的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和巨大的經(jīng)濟(jì)效益，而在羊奶的重要來(lái)源奶山羊養(yǎng)殖業(yè)中，乳房炎是一種廣泛流行的傳染性疾病，降低原奶產(chǎn)量及其質(zhì)量，甚至帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。引起乳房炎的重要原因是致病菌感染乳房，主要的乳房炎致病菌有金黃色葡萄{Staphylococcus aureus, S. aureus) (Escherichia coli,E. coli)、季 L 房
{.Streptococcus uberis，S. uberi5)>iStreptococcus dysgalactiae，
S.dysgalactiae ){Streptococcus agalactiae, S. aga/aciiae1)、克雷伯氏爆{Klebsiella pneumonia, K. 應(yīng)o/ ia)。對(duì)乳房炎致病菌的檢測(cè)、鑒定,不僅是判斷產(chǎn)奶母畜是否患有乳房炎的重要依據(jù)，而且為臨床預(yù)防、治療乳房炎提供有效的信息。傳統(tǒng)的致病菌檢測(cè)以細(xì)菌分離、生化鑒定實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，假陰性率高且耗時(shí)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種奶山羊乳房炎病原菌多重PCR檢測(cè)試劑盒的制備方法，對(duì)提高乳房炎的檢測(cè)、監(jiān)控水平，保障羊奶及其奶制品食品安全具有重要意義。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種奶山羊乳房炎病原菌多 重PCR檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于所述的制備方法為
1)待檢樣本DNA提??；
2)設(shè)置PCR檢測(cè)試劑盒由PCR試劑管、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、TaqDNA聚合酶、溴酚藍(lán)上樣緩沖液(常規(guī)使用濃度)組成；
3)PCR擴(kuò)增在PCR檢測(cè)管中加入預(yù)處理的DNA樣本及Taq DNA聚合酶，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性、陰性對(duì)照，微量移液器吹打混勻后瞬間高速離心，PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；
4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，與陽(yáng)性、陰性對(duì)照比較待檢樣本所出現(xiàn)的電泳條帶，以判斷待檢樣品是否為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、克雷伯氏菌的單一或混合感染。所述的步驟3)中的PCR進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)循環(huán)條件為95 °C預(yù)變性4 min，94°C變性I min，60. 5 °C退火90 sec, 72 °C延伸I min，30個(gè)循環(huán)后72 °C延伸8 min，保存PCR產(chǎn)物于4 °C待檢。所述的多重PCR檢測(cè)試劑盒是以原有的PCR檢測(cè)技術(shù)為基礎(chǔ)，將多個(gè)單一 PCR置于同一反應(yīng)體系、同一反應(yīng)條件中進(jìn)行，同時(shí)達(dá)到對(duì)多種致病菌的檢測(cè)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和效果如下
I、一種對(duì)奶山羊金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、克雷伯氏菌單一或混合感染乳房，引起乳房炎的多重PCR檢測(cè)方法，可快速、高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)出待檢個(gè)體是否為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、克雷伯氏菌致病菌的單一或混合感染，此外本試劑盒也可用于奶山羊感染金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、克雷伯氏菌的分子流行病學(xué)調(diào)查及療效監(jiān)測(cè)。本方法以分子生物學(xué)知識(shí)為基礎(chǔ)，避免了傳統(tǒng)檢測(cè)方法鏡檢時(shí)的細(xì)菌、雜質(zhì)顆粒干擾，從而大大提聞了診斷準(zhǔn)確率。2、本發(fā)明建立6種乳房炎主要致病菌的多重PCR快速檢測(cè)試劑盒，可同時(shí)達(dá)到對(duì)多種致病菌的檢測(cè)，是一種省時(shí)、高效的檢測(cè)方法，可為臨床、亞臨床乳房炎的治療提供科學(xué)依據(jù)，而且對(duì)提高乳房炎的檢測(cè)、監(jiān)控水平，保障羊奶及其奶制品食品安全具有重要意義。四

圖I為各個(gè)菌種的單重PCR檢測(cè)結(jié)果圖(M: 100 bp DNA ladder; I :大腸桿菌；2:停乳鏈球菌；3:金黃色葡萄球菌；4:無(wú)乳鏈球菌；5:乳房鏈球菌；6:克雷伯氏菌；7:陰性對(duì)照)；
圖2為多重PCR凝膠電泳結(jié)果圖。五具體實(shí)施例方式 本發(fā)明多重PCR檢測(cè)，是以原有的PCR檢測(cè)技術(shù)為基礎(chǔ)，將多個(gè)單一 PCR置于同一反應(yīng)體系、同一反應(yīng)條件中進(jìn)行，可同時(shí)達(dá)到對(duì)多種致病菌的檢測(cè)，
所選擇的多重PCR克隆基因，基于以下事實(shí)大腸桿菌基因?qū)儆诨虼?，其編碼一種跨膜蛋白，初始腸道細(xì)菌共同抗原和O-抗原脂多糖的生物合成。金黃色葡萄球菌nuc基因編碼該菌種特異性的耐熱性核酸酶，具有核酸內(nèi)切酶活性，可降解DNA及RNA，在100°C時(shí)仍可維持酶活性I h。無(wú)乳鏈球菌基因編碼CAMP因子，該因子是無(wú)乳鏈球菌的主要毒力因子，可引起CAMP現(xiàn)象及降低宿主免疫系統(tǒng)功能。乳房鏈球菌基因編碼PauA蛋白，該蛋白與血漿酶原結(jié)合形成血漿酶原復(fù)合物，繼而刺激形成血纖維溶解酶，是研究鏈球菌疫苗的候選抗原之一。克雷伯氏菌基因編碼溶血素蛋白，可裂解紅細(xì)胞，也是克雷伯氏菌的主要毒力因子之一。與16s或23s核糖體基因相比，16S-23S間隔區(qū)序列面臨的進(jìn)化選擇壓力更小，變異程度更高，故而可用于不同的種屬鑒定。本發(fā)明主要是一種同時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、克雷伯氏菌單個(gè)或多個(gè)混合感染的臨床樣品進(jìn)行診斷鑒定的多重PCR方法，通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
1)、待檢樣本DNA提?。?br> 2)、設(shè)置PCR檢測(cè)試劑盒由PCR試劑管、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、TaqDNA聚合酶、溴酚藍(lán)上樣緩沖液(常規(guī)使用濃度)組成；
3)PCR擴(kuò)增在PCR檢測(cè)管中加入預(yù)處理的DNA樣本及Taq DNA聚合酶，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性、陰性對(duì)照，微量移液器吹打混勻后瞬間高速離心，PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)循環(huán)條件為95 °C 預(yù)變性 4 min, 94 °C 變性 I min，60.5 °C 退火 90 sec, 72 °C 延伸 I min，30 個(gè)循環(huán)后72 °C延伸8 min，保存PCR產(chǎn)物于4 °C待檢； 4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，與陽(yáng)性、陰性對(duì)照比較待檢樣本所出現(xiàn)的電泳條帶，以判斷待檢樣品是否為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、克雷伯氏菌的單一或混合感染；
步驟2)中PCR檢測(cè)管中內(nèi)含10 X PCR緩沖液，脫氧核糖核酸(dNTP)，12條引物，其中12條引物分別為如下(表I)堿基序列人工合成的DNA片段
權(quán)利要求
1.一種奶山羊乳房炎病原菌多重PCR檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在 于所述的制備方法為 1)待檢樣本DNA提?。? 2)設(shè)置PCR檢測(cè)試劑盒由PCR試劑管、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、TaqDNA聚合酶、溴酚藍(lán)上樣緩沖液(常規(guī)使用濃度)組成； 3)PCR擴(kuò)增在PCR檢測(cè)管中加入預(yù)處理的DNA樣本及Taq DNA聚合酶，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性、陰性對(duì)照，微量移液器吹打混勻后瞬間高速離心，PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)； 4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，與陽(yáng)性、陰性對(duì)照比較待檢樣本所出現(xiàn)的電泳條帶，以判斷待檢樣品是否為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、克雷伯氏菌的單一或混合感染。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種奶山羊乳房炎病原菌多重PCR檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于所述的步驟3)中的PCR進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)循環(huán)條件為95 °C預(yù)變性4 min,94 °C變性 I min，60.5 °C退火 90 sec, 72 °C延伸 I min，30 個(gè)循環(huán)后 72 °C延伸 8 min，保存PCR產(chǎn)物于4 °C待檢。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種奶山羊乳房炎病原菌多重PCR檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于所述的多重PCR檢測(cè)試劑盒是以原有的PCR檢測(cè)技術(shù)為基礎(chǔ)，將多個(gè)單一 PCR置于同一反應(yīng)體系、同一反應(yīng)條件中進(jìn)行，同時(shí)達(dá)到對(duì)多種致病菌的檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種奶山羊乳房炎病原菌多重PCR檢測(cè)試劑盒的制備方法。一種奶山羊乳房炎病原菌多重PCR檢測(cè)試劑盒的制備方法為1)待檢樣本DNA提?。?)設(shè)置PCR檢測(cè)試劑盒；3)PCR擴(kuò)增；4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析。本發(fā)明對(duì)提高乳房炎的檢測(cè)、監(jiān)控水平，保障羊奶及其奶制品食品安全具有重要意義。
文檔編號(hào)C12R1/22GK102851390SQ20121039443
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月17日
發(fā)明者陳德坤, 姚運(yùn)亮, 田婷婷, 許君艷, 趙燕青, 羅軍, 曹斌云 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)