專利名稱：甘蔗褐銹病菌pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甘蔗病原菌的檢測方法，具體涉及甘蔗褐銹病菌PCR檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甘鹿褐銹病(Sugarcane brown rust disease)屬真菌性病害，由屬于黑頂柄銹菌的甘鹿褐銹病菌me I anocephal a)弓\起。該病主要由夏孢子傳播,借風(fēng)力附著在蔗葉表面，經(jīng)氣孔侵入。該病在美國、澳大利亞、印度和毛里求斯等國家普遍發(fā)生并多次爆發(fā)流行，不僅造成蔗莖產(chǎn)量損失，還對蔗糖分積累造成影響，影響程度因品種抗病性不同而有差異，嚴(yán)重時減產(chǎn)可高達(dá)40 %，并導(dǎo)致蔗糖分降低，幅度在10-36 %之間。
甘蔗褐銹病主要發(fā)生在葉片上，其發(fā)生與溫度密切相關(guān)，16-22 °C為發(fā)病最適宜 溫度。初次侵染源主要來自甘蔗本身或其他中間寄主。受褐銹病菌侵染后，初期甘蔗葉片上長出黃色小斑點，色澤呈褐色至橙褐色，周圍有黃色暈環(huán)，后期病斑因夏孢子堆呈膿皰狀，最后病斑變黑色，葉組織壞死，使甘蔗葉片失去光合能力，表現(xiàn)早衰。培育抗病品種，提高目標(biāo)甘蔗品種的抗褐銹病性，并避免栽種感病品種，是控制甘蔗褐銹病的最經(jīng)濟有效的措施。在甘蔗抗褐銹病育種過程中，如何檢測目標(biāo)甘蔗品種中是否含有甘蔗褐銹病菌以及檢測的的效率和準(zhǔn)確性直接影響甘蔗抗褐銹病育種的進(jìn)程和效果。目前，一般采取兩種方法判斷種莖是否帶菌一種是采用分離培養(yǎng)技術(shù)，在建立純培養(yǎng)物的基礎(chǔ)上，根據(jù)培養(yǎng)物所產(chǎn)生孢子的形態(tài)特征進(jìn)行鑒定，黑頂柄銹菌夏孢子橙色或橙褐色，卵圓形至梨形，大小24. I 34. 9X18. I 25.3 ( μ m)，具3 4個芽孔。夏孢子壁四周均勻加厚。冬孢子雙細(xì)胞，壁光滑，頂壁常加厚，棍棒狀，蒼白至磚色，大小28. 9 45. 8X14. 5 21. 7 ( μ m);另一種是基于該病害表型癥狀，因為甘蔗受褐銹病菌侵染后，病害癥狀表現(xiàn)為受侵染葉片出現(xiàn)褐色條紋病斑，葉片背面表皮破裂，產(chǎn)生銹色膿包，病情嚴(yán)重的葉片枯死，因此，可以采用種莖種植后，觀察是否發(fā)生甘蔗褐銹病判斷待檢測甘蔗品種是否含有褐銹病菌。但是，上述的第一種方法由于分離培養(yǎng)以及最終建立純培養(yǎng)物需要時間長，加上分離過程雜菌污染等，都會影響分離效果，檢出效率不高；第二種方法則只有當(dāng)甘蔗、環(huán)境條件和病原菌三個因素都具備，病害才能發(fā)生，換句話說，即便田間有病原、甘蔗基因型也是感病的，要發(fā)生病害，還需要合適的環(huán)境條件，三者缺一不可，因此，田間基于誘發(fā)的抗病性鑒定方法，鑒定結(jié)果難以預(yù)料。不同地點、不同年份間的鑒定結(jié)果有較大的差異，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性不夠，何況還需要長達(dá)幾個月的漫長時間。顯然，目前已有的技術(shù)方法，對于判斷種莖是否帶菌是不適用的，急需建立一種能夠?qū)崿F(xiàn)“快速”與“準(zhǔn)確”目標(biāo)要求的甘蔗褐銹病菌的檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種甘蔗褐銹病菌PCR檢測方法，可用于田間甘蔗褐銹病菌的早期診斷及檢測。本發(fā)明的甘蔗褐銹病菌PCR檢測方法，包括基因組DNA的提取、PCR檢測體系建立和PCR擴增產(chǎn)物的檢測，其特征在于
1、PCR檢測體系的建立:PCR擴增體系為總體積25μ 1，內(nèi)含2. 5 μ I IOXPCR緩沖液，2. 5 μ I 25 mmol/L MgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP, 10 μ mol/L 的檢測引物 PCR-F和 PCR-R 各 I. O μ 1，I. 25 U Taq DNA Polymerase, 20-30 ng 基因組 DNA，ddH20 補足到 25μ I ； PCR 擴增程序如下94 0C 4 min ；94 °C I min, 58 °C 45 S，72 °C I min，35 個循環(huán)；72 °C 8 min ;所述 10XPCR緩沖液組成成分為 100 mmol/L pH8. 5 Tris_HCl，500 mmol/L KCl 和 15 mmol/L MgCl2 ；
所述檢測引物如下
PCR-F :5’-GAGCATCAAGGAAAGTAGCAATA-3’，
PCR-R :5’-GAAGATGGTTCGAGCCACAATTA-3'； 2、PCR擴增產(chǎn)物的檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測的PCR擴增圖譜中，在分子量為483bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，為甘蔗褐銹病菌存在的標(biāo)志。本發(fā)明的應(yīng)用效果
本發(fā)明的甘蔗褐銹病菌PCR檢測方法，具有靈敏度高，所需要的DNA用量少的特點；與常規(guī)的根據(jù)病菌培養(yǎng)后的孢子形態(tài)特征鑒定或根據(jù)田間種植后病害表型癥狀鑒定的方法相比，具有實用性好、準(zhǔn)確性高和操作簡便快速等優(yōu)點。I、實用性好直接從待檢測甘蔗品種中檢測甘蔗褐銹病菌具有重要的實際應(yīng)用價值。目前，在甘蔗品種及其種質(zhì)資源交換過程中，甘蔗褐銹病菌的檢測方法是根據(jù)病菌培養(yǎng)物所產(chǎn)生孢子的形態(tài)特征鑒定或根據(jù)田間種植后病害表型癥狀鑒定，無法滿足快速檢疫的需要。為了使我們的檢疫方法具有實際的應(yīng)用價值，我們采用直接從待檢測甘蔗品種中提取DNA后直接進(jìn)行PCR擴增，可在5 6小時內(nèi)完成對甘蔗褐銹病菌的檢測。因此本方法大大提聞了檢測的效率。2、準(zhǔn)確性高傳統(tǒng)的甘蔗褐銹病菌檢測技術(shù)是根據(jù)病原物孢子的形態(tài)特征或者根據(jù)田間種植后病害表型癥狀鑒定來確定檢疫對象，無法排除人為因素的干擾，很難區(qū)分形態(tài)相似種或容易受環(huán)境條件的影響，從而導(dǎo)致準(zhǔn)確性不高；同時，形態(tài)學(xué)檢測在近緣菌內(nèi)的不同種之間可區(qū)別的特征較少，有些甚至沒有什么差異，同時還需要判斷者具有豐富的知識和經(jīng)驗，方可作出準(zhǔn)確的判斷。而本發(fā)明根據(jù)甘蔗褐銹病菌的特異性序列，選擇甘蔗褐銹病菌特有的一段保守序列設(shè)計特異引物，根據(jù)變異序列設(shè)計特異性引物進(jìn)行擴增比較，為病原菌的檢測和鑒定提供準(zhǔn)確的靶標(biāo)位點。經(jīng)過與甘蔗褐銹病菌以及其它不同植物中近緣病原菌的比較，該引物的準(zhǔn)確率高。3、操作簡便快速應(yīng)用本發(fā)明方法，提取待檢測植株DNA、PCR擴增和常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳即可判定檢測結(jié)果，無須對病原菌進(jìn)行培養(yǎng)或田間種植鑒定，一般檢測過程可在5 6小時完成。本發(fā)明為甘蔗褐銹病菌的鑒定，提供了高靈敏度的快速檢測體系，可用于田間甘蔗褐銹病菌的早期診斷及檢測，對我國抗褐銹病甘蔗育種和抗褐銹病甘蔗種質(zhì)資源的保護(hù)具有重要的意義。


圖I為使用甘蔗PCR-F和PCR-R檢測引物鑒定6個待檢測甘蔗品種是否受甘蔗褐銹病菌侵染(即是否含有甘蔗褐銹病菌)的PCR擴增圖譜。其中各泳道中，M代表分子量標(biāo)準(zhǔn)；(代表以水作為模板的空白對照；P代表對應(yīng)甘蔗品種中含有甘蔗褐銹病菌；N代表對應(yīng)甘蔗品種中不含甘蔗褐銹病菌；1_6代表6個甘蔗品種。
具體實施例方式為了進(jìn)一步闡明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明，以下結(jié)合實施例加以說明。實施例I甘蔗褐銹病菌PCR檢測方法 甘蔗褐銹病菌PCR檢測方法，包括以下步驟
I、基因組DNA的提取 (1)取5克待檢測甘蔗植株的葉片組織，置研缽，加入液氮磨碎成粉末，并在解凍前轉(zhuǎn)入50 ml的離心管中；
(2)加入15ml,65 °C預(yù)熱的SDS提取液，混勻后在65 1水浴保溫40 min ；
(3)加8 ml 3 mol/L KAC 混勻后，冰浴 30 min ；
(4)25000 g，4 °C離心，20 min ;收集上清液，并加入12 ml于4 1預(yù)冷的異丙醇；
(5)-20°C放置30 min后，鉤出漂浮在液面的DNA，置于一干凈的I. 5 ml離心管中，晾干后加入750 μ I TE溶液；加等體積的平衡飽和酚，搖勻，12000 g，4 °C離心，10 min ；
(6)轉(zhuǎn)移上清至另一干凈的I.5 ml離心管中，加等體積的氯仿，12000 g，4 °C，離心10min后移出上層水相；
(7)在水相中加2倍體積的無水乙醇，12000g，4 °C離心10 min，留沉淀，用體積濃度為70 %的乙醇清洗2次，并晾干；
(8)加滅菌后的TE溶液200μ I溶解后，置-20 °C冰箱中保存?zhèn)溆谩?、PCR檢測體系的建立
PCR擴增體系為總體積25 μ 1，內(nèi)含2. 5 μ I 10XPCR緩沖液，2. 5 μ I 25 mmol/LMgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP，10 μ mol/L 的檢測引物 PCR-F 和 PCR-R各 I. 0 μ I, I. 25U Taq DNA Polymerase, 20-30 ng待檢測甘蔗品種基因組DNA，ddH20補足到25 μ I。PCR擴增程序如下94 0C 4 min ；94 °C I min, 58 °C 45 s，72 °C I min，35 個循環(huán)；72 0C 8 min。所述檢測引物PCR-F和PCR-R，是采用ITS-PCR技術(shù)，經(jīng)過大量的篩選試驗，獲得了甘蔗褐銹病菌的特異DNA片段，以此片段的DNA序列為基礎(chǔ)，設(shè)計甘蔗褐銹病菌檢測引物。所述檢測引物PCR-F和PCR-R具體如下
PCR-F :5’-GAGCATCAAGGAAAGTAGCAATA-3’，
PCR-R : 5’-GAAGATGGTTCGAGCCACAATTA-3'。3、PCR擴增產(chǎn)物的檢測
具體的檢測方法為，取PCR擴增產(chǎn)物10 μ I，加5 μ I含有溴酚藍(lán)的上樣緩沖液，混勻后點樣于含有0. 5 μ g/ml溴化乙錠的I. 5 %瓊脂糖凝膠上，于0. 5 X TBE緩沖液中，10 V/cm恒定電壓下電泳1.5 h，結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)上成像并進(jìn)行凝膠分析。PCR產(chǎn)物的檢測結(jié)果采用檢測引物PCR-F和PCR-R對待檢測甘蔗品種的基因組DNA進(jìn)行PCR擴增，結(jié)果如圖I所示，受甘蔗褐銹病菌侵染(即含有甘蔗褐銹病菌)的樣品出現(xiàn)483 bp的DNA條帶，而沒有受到甘蔗褐銹病菌侵染(即不含甘蔗褐銹病菌)的樣品則不出現(xiàn)483 bp的DNA條帶。我們?nèi)?個待檢測甘蔗品種用PCR檢測和病原菌分離培養(yǎng)后的形態(tài)特征判別方法鑒定的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果是一致的。如圖I所示，出現(xiàn)分子量為483 bp的DNA條帶的樣品所代表的甘蔗品種，經(jīng)病原菌培養(yǎng)后的孢子形態(tài)特征鑒定均含甘蔗褐銹病菌；未出現(xiàn)分子量為483 bp的DNA條帶的樣品所代表的甘蔗品種，經(jīng)病原菌培養(yǎng)后的孢子形態(tài)特征鑒定結(jié)果顯示均不含甘蔗褐銹病菌。本發(fā)明采用的主要試劑如下(所有化學(xué)試劑均為分析純)
1、SDS提取液NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4 I. 44 g、KH2 PO4 0. 24 g、SDS 2 g、甘油50 ml,滅菌去離子I L, pH值7· 4 ;
2、TE溶液10 mmol/L Tris-HCl, I mmol/L EDTA ； 3、上樣緩沖液0.I %溴酚藍(lán)，40 %蔗糖；
4、0.5 X TBE 緩沖液44. 5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HBO3,1 mmol/L EDTA ；
5、PCR擴增試劑購自大連寶生物公司。本發(fā)明所使用的儀器主要如下
1、PCR擴增儀德國Eppendorf5331 PCR擴增儀；
2、電泳儀北京六一儀器廠DYCZ-20ADNA序列分析電泳儀；
3、離心機德國Eppendorf5810/5810R多功能臺式離心機；
4、凝膠成像系統(tǒng)美國BIO-RADGel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
權(quán)利要求
1.一種甘蔗褐銹病菌的PCR檢測方法，包括基因組DNA的提取、PCR檢測體系建立和PCR擴增產(chǎn)物的檢測，其特征在于 (1)PCR檢測體系的建立PCR擴增體系為總體積25 μ 1，內(nèi)含2. 5 μ I IOXPCR緩沖液，2. 5 μ I 25 mmol/L MgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP, 10 ymol/L 的檢測引物PCR-F和 PCR-R 各 I. O μ 1，I. 25 U Taq DNA Polymerase, 20-30 ng 基因組 DNA，ddH20 補足到 25μ I ； PCR 擴增程序如下94 °C 4 min ；94 °C I min, 58 °C 45 s，72 °C I min，35 個循環(huán)；72 °C 8 min ;所述 10XPCR緩沖液組成成分為 100 mmol/L pH8. 5 Tris_HCl，500 mmol/L KCl和15 mmol/L MgCl2 ;所述檢測引物如下PCR-F :5’-GAGCATCAAGGAAAGTAGCAATA-3’，PCR-R :5’-GAAGATGGTTCGAGCCACAATTA-3'； (2)PCR擴增產(chǎn)物的檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測的PCR擴增圖譜中，在分子量為483bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，為甘蔗褐銹病菌存在的標(biāo)志。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種甘蔗褐銹病菌的PCR檢測方法，包括基因組DNA的提取、PCR檢測體系建立和PCR擴增產(chǎn)物的檢測。本發(fā)明的甘蔗褐銹病菌PCR檢測方法，具有靈敏度高，所需要的DNA用量少的特點；與常規(guī)的根據(jù)病菌培養(yǎng)后的孢子形態(tài)特征鑒定或根據(jù)田間種植后病害表型癥狀鑒定的方法相比，具有實用性好、準(zhǔn)確性高和操作簡便快速等優(yōu)點。為甘蔗褐銹病菌的鑒定，提供了高靈敏度的快速檢測體系，可用于田間甘蔗褐銹病菌的早期診斷及檢測，對我國抗褐銹病甘蔗育種和抗褐銹病甘蔗種質(zhì)資源的保護(hù)具有重要的意義。
文檔編號C12R1/645GK102876797SQ20121039694
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月18日
發(fā)明者闕友雄, 許莉萍, 羅俊, 黃寧, 袁照年, 郭晉隆, 徐景升, 陳如凱 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)