專利名稱：用于檢測mll相關(guān)融合基因的多重實時定量pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測MLL相關(guān)融合基因的多重實時定量PCR試劑盒。
背景技術(shù)：
混合系白血病(mixed lineage leukemia, MLL)基因位于染色體llq23上，涉及l(fā)lq23的染色體易位形成的MLL相關(guān)融合基因見于白血病，其與白血病的發(fā)生相關(guān)。MLL相關(guān)融合基因(+ )的白血病具有以下特點(I)不具有類型特異性，既見于急性淋巴細胞白血病(ALL)又見于急性髓性白血病(AML)，在ALL及AML的發(fā)生率均不超過10%，不過超過70%的嬰兒ALL具有MLL融合基因，因此無論是ALL還是AML均需要篩查MLL融合基因；(2 )伙伴基因眾多，目前已發(fā)現(xiàn)其伙伴基因超過50種，因此采用單一的PCR逐一檢測各種類型的MLL 融合基因費力、耗時，不具有臨床應(yīng)用價值。盡管伙伴基因眾多但是發(fā)生率差異很大，其中最常見的前六種伙伴基因分別是AF4 (位于染色體4q21)、AF9 (位于染色體9p22)、ENL (位于染色體19pl3. 3)、AF10 (位于染色體10pl2)、AF6 (位于染色體6q27)和ELL (位于染色體19pl3. I)，這六種的發(fā)生率占到了全部MLL相關(guān)融合基因的85-90% ；(3)總體預(yù)后很差，除了其中的MLL-AF9型在2008版的WHO白血病診斷標準中被列為中度預(yù)后，其它類型均預(yù)示預(yù)后很差。因此臨床上很有必要盡快確定是否具有MLL相關(guān)融合基因以及其伙伴基因，以指導(dǎo)臨床選擇合適的治療方案，盡早開始治療。多重PCR的原理是在一個PCR反應(yīng)管中含有針對多種融合基因的多對引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件來保證擴增的特異性和靈敏度，一旦有陽性擴增條帶再通過分管分別擴增來最終確定融合基因類型。因此這種PCR尤其適合分布廣泛但發(fā)生率不高的多個基因的同時篩查，既省力、省時又經(jīng)濟。而MLL融合基因正好符合這個特點，因此采用多重PCR適于對白血病患者進行MLL相關(guān)融合基因的初篩?；赥aqMan探針的實時定量PCR (RQ-PCR)在過去的十年里得到了廣泛的推廣和應(yīng)用，它與普通PCR相比，除了實現(xiàn)了真正意義的定量之外還具有以下優(yōu)點(I)特異性增強、靈敏度提高；(2)擴增過程中閉管操作，實時收集數(shù)據(jù)，降低了污染機會，減少假陽性結(jié)果；(3)無需電泳，縮短了操作時間；(4)通過定量內(nèi)參基因來評價樣本質(zhì)量，減少了假陰性結(jié)果。如果基于TaqMan探針的RQ-PCR與多重PCR相結(jié)合，就能兼具多重PCR和RQ-PCR的優(yōu)點，在多重PCR基礎(chǔ)上既增加了特異性和敏感性，又更加快速簡單，因此是很具有臨床應(yīng)用價值的MLL相關(guān)融合基因檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測MLL相關(guān)融合基因mRNA的實時定量PCR試劑盒，所述試劑盒中含有用于實時定量PCR檢測MLL相關(guān)融合基因mRNA的上游引物I、下游引物I和TaqMan探針I(yè) ;所述上游引物I由序列表序列1、2和3所示的三種單鏈DNA組成，分別位于MLL基因外顯子7、9和8上；所述TaqMan探針I(yè)由序列表序列19、20和21所示的三種單鏈DNA組成，分別位于MLL基因外顯子7、9和8上；所述下游引物I由如下I) —6)下游引物組合中的六種、任意五種、任意四種、任意二種、任意兩種或任一種組成I)由序列表序列4、5和6所示的三種單鏈DNA組成，分別位于AF4基因外顯子7和8、5和6上；2)由序列表序列7和8所示的兩種單鏈DNA組成，分別位于AF6基因外顯子3和2上；3)由序列表序列9、10、11和12所示的四種單鏈DNA組成，分別位于AF9基因外顯 子11、6、5和9上；4)由序列表序列13、14和15所示的三種單鏈DNA組成,分別位于AFlO基因外顯子8和9、20和12上；5)由序列表序列16所示的單鏈DNA組成,位于ELL基因外顯子2上；6)由序列表序列17和18所示的兩種單鏈DNA組成，分別位于ENL基因外顯子7和2上。在上述試劑盒中，還可含有實時定量PCR檢測內(nèi)參基因ABL mRNA的上游引物II、下游引物II和TaqMan探針I(yè)I ;所述上游引物II為序列表序列22所示的單鏈DNA ;所述下游引物II為序列表序列23所示的單鏈DNA ;所述TaqMan探針I(yè)I的核苷酸序列如序列表序列24所示。在上述試劑盒中，所述TaqMan探針I(yè)和II的5’端連接有熒光報告基團FAM，3’端連接有熒光淬滅基團TAMRA。在上述試劑盒中，還可含有獨立包裝的熒光PCR的Master Mix。在上述試劑盒中，還可含有陽性對照和/或陰性對照；所述陰性對照為來源于健康人外周血單個核細胞的cDNA ；所述陽性對照為來源于MLL/AF4型白血病患者外周血單個核細胞的cDNA，和/或來源于MLL/AF6型白血病患者外周血單個核細胞的cDNA，和/或來源于MLL/AF9型白血病患者外周血單個核細胞的cDNA，和/或來源于MLL/AF10型白血病患者外周血單個核細胞的cDNA，和/或來源于MLL/ENL型白血病患者外周血單個核細胞的cDNA，和/或來源于MLL/ELL型白血病患者外周血單個核細胞的cDNA;所述MLL/AF4型白血病患者為llq23染色體發(fā)生易位后形成的融合基因中包含了MLL和AF4基因的部分或全部；所述MLL/AF6型白血病患者為llq23染色體發(fā)生易位后形成的融合基因中包含了MLL和AF6基因的部分或全部；所述MLL/AF9型白血病患者為llq23染色體發(fā)生易位后形成的融合基因中包含了MLL和AF9基因的部分或全部；所述MLL/AF10型白血病患者為llq23染色體發(fā)生易位后形成的融合基因中包含了 MLL和AFlO基因的部分或全部；所述MLL/ENL型白血病患者為llq23染色體發(fā)生易位后形成的融合基因中包含了MLL和ENL基因的部分或全部；所述MLL/ELL型白血病患者為llq23染色體發(fā)生易位后形成的融合基因中包含了MLL和ELL基因的部分或全部。本發(fā)明所提供的試劑盒具有以下優(yōu)點I、覆蓋 面廣本試劑盒包含最常見的六種MLL相關(guān)融合基因，覆蓋了 85%的全部MLL相關(guān)融合基因。2、準確可靠本試劑盒采用的是基于TaqMan探針的RQ-PCR,保證了擴增的特異性；此外，在利用多重RQ-PCR體系檢測到陽性結(jié)果后，進一步分管操作分別檢測，來確定融合基因類型，同時起到對多重結(jié)果的驗證作用。3、操作簡便、省時，成本低采用一管多重RQ-PCR體系同時篩查最常見的6種MLL相關(guān)融合基因，若為陰性，無需再分管操作，即可獲得最終結(jié)果；擴增結(jié)束即可知道結(jié)果，無需電泳過程；此外,實驗體系僅為10 μ 1，亦降低了成本。本發(fā)明所提供的試劑盒可用于急性白血病患者MLL相關(guān)融合基因的快速準確篩查，為幫助臨床疾病的確診、治療方案的確定、尋找用于療效評價的特異性分子標志及預(yù)后提供了重要的依據(jù)。


圖I為利用實施例I試劑盒檢測9例來自不同患者的待測樣品擴增產(chǎn)物的測序及比對結(jié)果。其中，A-I分別代表9例來自不同患者的結(jié)果。圖2為利用實施例I試劑盒檢測I號患者cDNA樣品的結(jié)果。其中，a圖為擴增體系I的結(jié)果，b圖為擴增體系I -I的結(jié)果。圖3為利用實施例I試劑盒的擴增體系I檢測3號患者cDNA樣品的靈敏度。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。突光PCR的Master mix :購自美國ABI公司。實施例I、檢測MLL相關(guān)融合基因的多重實時定量PCR試劑盒一、MLL相關(guān)融合基因的實時定量PCR (RQ-PCR)擴增體系I、多重MLL相關(guān)融合基因的實時定量PCR (RQ-PCR)擴增體系I組成I)上游引物I :3條位于MLL基因上的引物1、2及3，反應(yīng)終濃度各為0.3μΜ;2)下游引物I :15條分別位于六個伙伴基因上的引物4一 18，反應(yīng)終濃度各為O. 3μΜ ；3) TaqMan探針I(yè) :3條位于MLL基因上的TaqMan探針19一21，反應(yīng)終濃度各為O. 2μΜ ；4)突光 PCR 的 Master mix。2、MLL-AF4融合基因的RQ-PCR擴增體系I -I組成I)上游引物I :3條位于MLL基因上的引物1、2及3，反應(yīng)終濃度各為0.3μΜ;2)下游引物I -I :3條位于AF4基因上的引物4一 6，反應(yīng)終濃度各為O. 3μΜ ;
3) TaqMan探針I(yè) :3條位于MLL基因上的TaqMan探針19一21，反應(yīng)終濃度各為O. 2μΜ ；4)突光 PCR 的 Master mix。3、MLL-AF6融合基因的RQ-PCR擴增體系I _2組成I)上游引物I :3條位于MLL基因上的引物1、2及3，反應(yīng)終濃度各為0.3μΜ;2)下游引物I -2 2條位于AF6基因上的引物7和8，反應(yīng)終濃度各為O. 3 μ M ;3) TaqMan探針I(yè) :3條位于MLL基因上的TaqMan探針19一21，反應(yīng)終濃度各為O. 2μΜ ；
4)突光 PCR 的 Master mix。4、MLL-AF9融合基因的RQ-PCR擴增體系I _3組成I)上游引物I :3條位于MLL基因上的引物1、2及3，反應(yīng)終濃度各為0.3μΜ;2)下游引物I -3 :4條位于AF9基因上的引物9—12，反應(yīng)終濃度各為O. 3μΜ;3) TaqMan探針I(yè) :3條位于MLL基因上的TaqMan探針19一21，反應(yīng)終濃度各為O. 2μΜ ；4)突光 PCR 的 Master mix。5、MLL-AFlO融合基因的RQ-PCR擴增體系I _4組成I)上游引物I :3條位于MLL基因上的引物1、2及3，反應(yīng)終濃度各為O. 3μΜ;2)下游引物I -4:3條位于AFlO基因上的引物13-15，反應(yīng)終濃度各為O. 3μ M ;3)TaqMan探針I(yè) :3條位于MLL基因上的TaqMan探針19_21，反應(yīng)終濃度各為O. 2μΜ ；4)突光 PCR 的 Master mix。6、MLL-ELL融合基因的RQ-PCR擴增體系I _5組成I)上游引物I :3條位于MLL基因上的引物1、2及3，反應(yīng)終濃度各為O. 3μΜ;2)下游引物I -5:1條位于AFlO基因上的引物16，反應(yīng)終濃度各為O. 3μ M ;3) TaqMan探針I(yè) :3條位于MLL基因上的TaqMan探針19一21，反應(yīng)終濃度各為O. 2μΜ ；4)突光 PCR 的 Master mix。7、MLL-ENL融合基因的RQ-PCR擴增體系I _6組成I)上游引物I :3條位于MLL基因上的引物1、2及3，反應(yīng)終濃度各為0.3μΜ;2)下游引物I -6 :2條位于ENL基因上的引物17和18，反應(yīng)終濃度各為O. 3μ M ;3) TaqMan探針I(yè) :3條位于MLL基因上的TaqMan探針19一21，反應(yīng)終濃度各為O. 2μΜ ；4)突光 PCR 的 Master mix。上述引物1-18及探針19-21的序列如表I所示。表I. MLL相關(guān)融合基因RQ-PCR擴增的引物及探針序列
引物I名稱 I序列(5’ -3’)WmM~[S
IMLLFl CGCCTCAGCCACCTACTACAG 序列 I MLL 的外顯子 7 上
權(quán)利要求
1.用于檢測MLL相關(guān)融合基因mRNA的實時定量PCR試劑盒，其特征在于所述試劑盒中含有用于實時定量PCR檢測MLL相關(guān)融合基因mRNA的上游引物I、下游引物I和TaqMan探針I(yè) ; 所述上游引物I由序列表序列1、2和3所示的三種單鏈DNA組成； 所述TaqMan探針I(yè)由序列表序列19、20和21所示的三種單鏈DNA組成； 所述下游引物I由如下I) —6)下游引物組合中的六種、任意五種、任意四種、任意三種、任意兩種或任一種組成 O由序列表序列4、5和6所示的三種單鏈DNA組成； 2)由序列表序列7和8所示的兩種單鏈DNA組成； 3)由序列表序列9、10、11和12所示的四種單鏈DNA組成； 4)由序列表序列13、14和15所示的三種單鏈DNA組成； 5)由序列表序列16所示的單鏈DNA組成； 6)由序列表序列17和18所示的兩種單鏈DNA組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中含有實時定量PCR檢測內(nèi)參基因ABL mRNA的上游引物II、下游引物II和TaqMan探針I(yè)I ; 所述上游引物II為序列表序列22所示的單鏈DNA ;所述下游引物II為序列表序列23所示的單鏈DNA ;所述TaqMan探針I(yè)I的核苷酸序列如序列表序列24所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的試劑盒，其特征在于所述TaqMan探針I(yè)和II的5’端連接有熒光報告基團FAM，3’端連接有熒光淬滅基團TAMRA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的試劑或試劑盒，其特征在于所述試劑盒中含有獨立包裝的熒光PCR的Master Mix。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的試劑或試劑盒，其特征在于所述試劑盒中含有陽性對照和/或陰性對照。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測MLL相關(guān)融合基因的多重實時定量PCR試劑盒。該試劑盒中含有由序列表序列1、2和3所示的三種單鏈DNA組成的上游引物，由序列表序列19、20和21所示的三種單鏈DNA組成的TaqMan探針和由序列表序列4—18所示的十六種單鏈DNA組成的下游引物。本發(fā)明所提供的試劑盒可檢測最常見的六種MLL相關(guān)融合基因，檢測結(jié)果準確可靠，操作簡便、省時，成本低；可用于急性白血病患者MLL相關(guān)融合基因的快速準確篩查，為幫助臨床疾病的確診、治療方案的確定、尋找用于療效評價的特異性分子標志及預(yù)后提供了重要的依據(jù)。
文檔編號C12Q1/68GK102876799SQ201210397680
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月18日
發(fā)明者秦亞溱, 劉艷榮, 李金蘭, 主鴻鵠, 李玲娣, 賴悅云, 黃曉軍 申請人:北京大學(xué)人民醫(yī)院