專利名稱：來源于棉花的miRNA-GhmiRnE及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及一種來源于棉花的HiiRNA-GhmiRnE及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
miRNA (microRNA,微小RNA)是一類長度約為20_24nt的內(nèi)源單鏈非編碼小分子 RNA,在生物體中廣泛存在(Bartel D P. MicroRNAs:genomics, biogenesis, mechanisms, and function. Cell, 2004，116:281-297.)。近年來大量研究表明，miRNA 能夠調(diào)控生物體中許多基因的表達(dá)，在調(diào)節(jié)生長發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡、抵御環(huán)境脅迫等諸多方面發(fā)揮重要作用(Bushati N, Cohen S M. MicroRNA functions. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. , 2007, 23:175-205.;金龍國，王川，劉進(jìn)元·植物MicroRNA.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2006，22:609-614.)。植物miRNA主要通過切割靶基因mRNA，或抑制靶mRNA翻譯，來調(diào)控植物個(gè)體生長發(fā)育并影響其生理過程，是一種新的基因調(diào)控模式，具有重要的石開究意義(Voinnet 0. Origin, biogenesis, and activity of plant microRNAs.Cell,2009, 136:669-687.)。棉花是世界最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，同時(shí)棉花纖維也是研究單細(xì)胞伸長的良好模型。與擬南芥、水稻等模式生物相比，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的棉花miRNA數(shù)量可謂寥寥無幾，因此通過高通量測序技術(shù)，有望挖掘出更多的棉花miRNA，這對于全面了解棉花乃至整個(gè)植物miRNA的形成過程、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能機(jī)制具有現(xiàn)實(shí)意義。另外，棉花中miRNA可能在諸多生理過程(如纖維的起始與伸長等)發(fā)揮重要功能，但棉花中關(guān)于miRNA的生物學(xué)功能研究甚少，因此，通過關(guān)注特定發(fā)育時(shí)期、特定組織中的miRNA，有望闡明棉花miRNA參與的生理過程，以及在該過程中具體發(fā)揮的作用。我國是世界上主要的棉花生產(chǎn)和消費(fèi)國，棉花對于我國具有舉足輕重的地位。國內(nèi)外除了利用常規(guī)育種手段之外，逐步運(yùn)用基因工程技術(shù)對棉花纖維產(chǎn)量、品質(zhì)、抗蟲等進(jìn)行遺傳改良已經(jīng)成為了一種趨勢。由于miRNA對植物有廣泛的調(diào)控作用，很可能成為植物遺傳改良的重點(diǎn)研究基因之一，因此迫切需要通過大規(guī)模測序方法充分挖掘和開發(fā)屬于本國知識產(chǎn)權(quán)的新的miRNA基因，從而為后期定向改良和培育優(yōu)質(zhì)性狀的棉花品種奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供來源于棉花的HiiRNA-GhmiRnE及其應(yīng)用。本發(fā)明提供miRNA-GhmiRnE，為單鏈RNA,為序列表的序列I所示的RNA，序列如下(5，一 3，)UUGGUAUGGAGGAUGGAAAAG 本發(fā)明還提供miRNA-GhmiRnE前體(pre_GhmiRnE),為單鏈RNA,為序列表的序列2 所示的 RNA，序列如下(5’ 一 3’)AAGCCUUGCUUUGGUAUGGAGGAUGGAAAAGAGUGAAGAUGGAAAAUUUAUUAAUCAAAAGGCCAAGAUUCACAAUCACUUUCCUACUUUGUAACUUAACCAUUAGAUUGACAAAUUUUCUAUCCUACCUCUUUUCCAUCCUUC⑶ACCAAACAAAGCUUA。序列I所示RNA或序列2所示的RNA在抑制乙酰輔酶A羧化酶β亞基基因(TC229767)表達(dá)中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述乙酰輔酶A羧化酶β亞基的氨基酸序列為序列表的序列3。所述乙酰輔酶A羧化酶β亞基基因的核苷酸序列為序列表的序列4或序列表中序列4自5’末端第708-2201位核苷酸。序列I所示RNA或序列2所示的RNA在促進(jìn)乙酰輔酶A羧化酶β亞基基因的mRNA降解中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述乙酰輔酶A羧化酶β亞基的氨基酸序列為序列表的序列3 ;所述乙酰輔酶A羧化酶β亞基基因的核苷酸序列為序列表的序列4或序列表中序列4自5’末端第708-2201位核苷酸。其中，促進(jìn)乙酰輔酶A羧化酶β亞基基因的mRNA降解為切割乙酰輔酶A羧化酶β亞基基因的mRNA。序列I所示RNA或序列2所示的RNA在棉花纖維品質(zhì)改良中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
·
Solexa克服了常規(guī)miRNA克隆技術(shù)的缺點(diǎn)，具有靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，能夠檢測出最少一個(gè)小RNA分子，并且準(zhǔn)確性高，檢出的小RNA分子堿基錯(cuò)誤率極低。HiSeq 2000是Illumina公司2010年推出的一款新的測序儀，采用穩(wěn)定的可逆終止法邊合成邊測序技術(shù)。該技術(shù)使用4種含有末端阻斷基團(tuán)和不同熒光信號的堿基進(jìn)行模板互補(bǔ)鏈的合成，不僅確保了測序的高精確性和高順序性，而且排除了由重復(fù)序列和同聚物導(dǎo)致的測序錯(cuò)誤。融合了最新的光學(xué)系統(tǒng)和制造工藝，該光學(xué)系統(tǒng)采用2個(gè)激光源對Flowcell進(jìn)行掃描，并使用4臺照相機(jī)對4種堿基分別進(jìn)行記錄，大幅度減少了不同堿基之間的信號干擾，提高了測序系統(tǒng)的準(zhǔn)確度。同時(shí)，HiSeq 2000使用了新穎的雙表面成像技術(shù)，增加了 Flowcell的有效面積,從而提高測序產(chǎn)量和降低成本。每個(gè)文庫的測序量至少達(dá)到1500萬條小RNA序列以上。基于這種最新的測序手段，將有望識別棉花中特定發(fā)育時(shí)期特定組織特異表達(dá)的新miRNAo本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明采用國際上先進(jìn)的Solexa高通量測序技術(shù)，最新的HiSeq 2000測序儀結(jié)合生物信息學(xué)分析、5' RACE等多種生物學(xué)手段，首次從基因組水平鑒定到miRNA-GhmiRnE，并且證實(shí)GhmiRnE的靶基因?yàn)橐阴］o酶A羧化酶β亞基，該基因參與了棉花纖維伸長和次生壁增厚的發(fā)育調(diào)控。這都將為棉花的品質(zhì)育種(如提高棉纖維產(chǎn)量)提供寶貴的基因資源，帶來一定的研究價(jià)值和社會效益，并最終用于實(shí)際生產(chǎn)。本發(fā)明提供的miRNA廣泛參與了棉花多種生命活動的調(diào)節(jié)，具有重要的生物學(xué)意義和潛在應(yīng)用價(jià)值。


圖I為小RNA測序數(shù)據(jù)中分離和鑒定新miRNA的流程圖。圖2為棉花開花后5天、10天、15天、20天和25天纖維小RNA庫中GhmiRnE的測序數(shù)；所有數(shù)字均代表歸一化為每1，000萬“干凈”序列(“干凈”序列見小RNA文庫中新的miRNA的鑒定部分中的解釋)中的數(shù)目。圖3為GhmiRnE的前體二級結(jié)構(gòu)圖。圖4為GhmiRnE的靶基因5' RACE驗(yàn)證；序列上方的箭頭表示發(fā)生切割的位點(diǎn)，數(shù)值表示該切點(diǎn)處發(fā)生切割的克隆數(shù)與克隆總數(shù)比值。
圖5為實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測靶基因的表達(dá)；誤差線表示相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的％,如無特殊說明,均為質(zhì)量百分含量。以下實(shí)施例中所用棉花品種均為陸地棉中棉35 (Gossypium hirsutumcv. CRI35)，棉花種子來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所。編號國審棉990005。實(shí)施例I、miRNA-GhmiRnE 的發(fā)現(xiàn) 一、樣品采集棉花于每年四月下旬種植于田間，常規(guī)作業(yè)，開花前一天花苞套袋，防止花粉傳播造成異花傳粉，開花當(dāng)天除袋，并掛牌標(biāo)記。分別收取開花后5、10、15、20、25天的棉鈴，去除棉鈴殼，將種子及纖維迅速凍存于液氮，保存于-80°C備用。二、miRNA-GhmiRnE 的發(fā)現(xiàn)I、RNA 提取用研杵在裝有液氮的研缽中敲擊棉花纖維及種子，進(jìn)而將纖維和種子剝離，取出種子，研磨纖維，研磨過程中加入PVP(按1/5質(zhì)量比)以防止酚類氧化，用PureLinkTMPlant RNA Reagent (Invitrogen)提取總 RNA,操作步驟如下(以 O. Ig 材料為例，相應(yīng)試劑量可根據(jù)材料量按比例調(diào)整)①磨好的纖維粉末加入到Iml提取緩沖液中，加20 μ I β -巰基乙醇，混勻后置于室溫10-15分鐘。4度12000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)至新的離心管，加入100 μ I5MNaCl，混勻后加入300 μ I氯仿，充分混勻，4度12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)至新的離心管；②將轉(zhuǎn)出的溶液依次用氯仿、酚、酚氯仿(I :1)、氯仿抽提，經(jīng)四次抽提后的上清液轉(zhuǎn)入新的離心管，加入100 μ I多糖去除劑(北京華越洋生物科技有限公司)，混勻后加入200 μ I氯仿，充分混勻，4度12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)至新的離心管；③加入等體積的異丙醇，混勻后置-20度I小時(shí)以上，4度12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄上清，離心得到的沉淀用75%的乙醇洗滌，晾干后溶于適量的DEPC水中，得到總RNA。使用Ultrospec 3000型紫外分光光度計(jì)(Amersham Biosciences)測定提取的RNA在260nm (OD260)和280nm (OD280)波長的吸光度值以確定RNA的純度和濃度。質(zhì)量合格的RNA濃度應(yīng)在I μ g/μ I以上，0D26(i/0D28(i的比值在I. 8-2. O之間，且經(jīng)電泳檢測條帶清晰，無明顯降解和DNA污染。2、小RNA文庫的構(gòu)建將質(zhì)量檢驗(yàn)合格的棉花纖維總RNA用于構(gòu)建小RNA文庫。5個(gè)不同時(shí)期的纖維樣品提取的RNA各取10 μ g，分別用于構(gòu)建小RNA文庫。小RNA文庫的構(gòu)建按照IlluminaSample Preparation Protocol文庫構(gòu)建方法進(jìn)行,構(gòu)建好的文庫采用Illumina公司新一代高通量測序儀HiSeq 2000測序(北京華大基因研究中心)，獲得高質(zhì)量的18_30nt的小RNA序列。
3、小RNA文庫中新的miRNA的鑒定參考之前國外文獻(xiàn)對高通量測序數(shù)據(jù)分析的成功方法(Jones-RhoadesM W， Bartel D P.Computational identification of plant miRNAs and theirtargets, including a stress-induced miRNA. Mol. Cell，2004，14:787-799.)，建立一套計(jì)算機(jī)分析方法用來發(fā)現(xiàn)和鑒定測序數(shù)據(jù)中的棉花miRNA (分析流程如圖I所示)。①將獲得的5個(gè)小RNA文庫中的原始序列通過計(jì)算機(jī)方法去掉:V接頭，并過濾掉序列長度在ISnt以下的序列，獲得所謂的“干凈”序列庫；②將“干凈”的序列與國際權(quán)威的miRNA數(shù)據(jù)庫 miRBase (19) (http://microrna. sanger.ac.uk/sequences/)中公布的 miRNA 成熟序列進(jìn)行BLAST，從而發(fā)現(xiàn)哪些序列來自于已知的miRNA，已知miRNA超過2個(gè)錯(cuò)配的序列再進(jìn)入下一步分析將排除了保守miRNA的序列再與其它非編碼RNA數(shù)據(jù)庫Rfam(10. I)進(jìn)行序列比對，從而發(fā)現(xiàn)哪些序列來自于rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA等非編碼RNA，過濾掉這些序列，剩下的序列中可能含有新的miRNA，稱為潛在miRNA序列庫； 將潛在miRNA序列庫中的序列與已有的棉花數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST，數(shù)據(jù)庫包括棉花EST(http://C0mpbi0.dfci. harvard, edu)、棉花GSS (NCBI)、以及已有的部分雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii) 的基因組序列。將找到的棉花數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)的序列進(jìn)行下一步分析。⑥使用miRNA前體結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件 mireap O. 2 (http: //sourceforge. net/pro jects/mireap)，對獲取的棉花數(shù)據(jù)庫中有小RNA對應(yīng)的序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析,若能形成類似miRNA前體(pre-miRNA)的良好莖環(huán)結(jié)構(gòu)則該序列可以認(rèn)為是候選的新miRNA 對候選的新的miRNA繼續(xù)進(jìn)行篩選，考察候選的新miRNA序列所在的莖環(huán)結(jié)構(gòu)前體的小RNA分布特征，若主要分布在候選的新miRNA區(qū)域以及對應(yīng)的miRNA*區(qū)域,則認(rèn)為該候選的新miRNA序列高度可信,是真實(shí)的 miRNA 序列(Meyers B C，Axtell M J, Bartel B, Bartel D P, Baulcombe D, Bowman JL, Cao X, Carington J C, Chen X, Green P J, et al. Criteria for annotation of plantmicroRNAs. Plant Cell, 2008, 20:3186-3190.)。鑒定到I個(gè)新的miRNA，命名為GhmiRnE。GhmiRnE 的序列如下(5' —3' ) :UUGGUAUGGAGGAUGGAAAAG (序列 I)。開花后5、10、15、20和25天5個(gè)獨(dú)立的棉花纖維小RNA文庫中能夠獨(dú)立鑒定到GhmiRnE序列，測序數(shù)分別為187，645，516，332和33 (經(jīng)歸一化處理后每1，000萬測序數(shù)中的數(shù)目)。結(jié)果見圖2。miRNA前體(pre_miRNA)序列的二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)是miRNA基因最顯著的特點(diǎn)之一,也是所有miRNA鑒定方法都不可逾越的重要規(guī)則。 GhmiRnE 前體(pre-GhmiRnE)序列如下(5' — 3' ) AAGCCUUGCUUUGGUAUGGAGGAUGGAAAAGAGUGAAGAUGGAAAAUUUAUUAAUCAAAAGGCCAAGAUUCACAAUCACUUUCCUACUUUGUAACUUAACCAUUAGAUUGACAAAUUUUCUAUCCUACCUCUUUUCCAUCCUUCGUACCAAACAAAGCUUA (序列表的序列 2 )。pre-GhmiRnE能形成良好的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，成熟的miRNA從miRNA前體的莖部產(chǎn)生，完全符合miRNA前體的結(jié)構(gòu)特征(圖3，紅色部分(左側(cè)加深)指示成熟miRNA所在的位置。)。實(shí)施例2、miRNA的靶基因預(yù)測與驗(yàn)證由于植物miRNA與靶基因mRNA近乎完全互補(bǔ)，因此可以通過生物信息學(xué)方法預(yù)測 GhmiRnE 的祀基因。采用在線軟件 psRNATarget (http://plantgrn. noble, org/psRNATarget/)在棉花EST數(shù)據(jù)庫CGIll中尋找到能與miRNA序列近乎完全互補(bǔ)的cDNA或基因，即為miRNA的靶標(biāo)；參數(shù)設(shè)置為=PsRNATarget程序參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置，靶標(biāo)的功能通過NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)同源性檢索，以同源性最高的已知功能基因進(jìn)行注釋。預(yù)測結(jié)果見表I。表IGhmiRnE的靶基因及功能
——miRNA名稱預(yù)測靶靶苺W功能一
乙Itt輔ΛΙ A羧化ftH'MlUt GhmiRnETC229767(Acetyle-CoA carboxylase beta
subunit, ACCD)GhmiRnE的靶基因?yàn)橐阴］o酶A羧化酶β亞基(ACXD)基因TC229767 (基因序列為序列表的序列4，其編碼基因?yàn)樾蛄斜碇行蛄?自5’末端第708-2201位核苷酸，其編碼的蛋白見序列表的序列3)。該類基因能夠調(diào)節(jié)脂肪酸生物合成，促進(jìn)棉花纖維的伸長和次生壁增厚的發(fā)育調(diào)控(Peng L, Kawagoe Y, Hogan P, Delmer D. 2002.Sitosterol—beta—glucoside as primer for cellulose synthesis in plants. Science295:147-150. ；Sasaki Y, Nagano Y. 2004. Plant acetyl-CoA carboxylase:structure, biosynthesis, regulation, and gene manipulation for plant breeding. BiosciBiotechnol Biochem 68:1175-1184. ；Gou JY，Wang LJ, Chen SP, Hu WL, Chen XY. 2007.Gene expression and metabolite profiles of cotton fiber during cell elongationand secondary cell wall synthesis. Cell Res 17:422-434·)。實(shí)施例3、miRNA對靶基因mRNA的切割GhmiRnE對靶基因TC229767(見序列表的序列4)mRNA的切割用5' RACE方法進(jìn)行驗(yàn)證(Jones-Rhoades M ff, Bartel D P. Computational identification of plant miRNAsand their targets, including a stress-induced miRNA. Mol. Cell, 2004, 14:787-799·)。靶基因mRNA被miRNA切割后，其較為穩(wěn)定的3'切割產(chǎn)物5'端核苷酸磷酸基團(tuán)暴露，用T4RNA連接酶在該切割產(chǎn)物5'端連接上5' RACE專用接頭；通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA ;通過靶基因特異的巢式外引物和試劑盒所帶的巢式外引物進(jìn)行第一輪PCR，靶基因特異的巢式內(nèi)引物和試劑盒所帶的巢式內(nèi)引物進(jìn)行第二輪PCR ;將5' RACE獲得的PCR產(chǎn)物連接到pMD 19-T載體(TaKaRa)后測序，就能知道精確的靶基因mRNA切割位點(diǎn)。I、分別提取實(shí)施例I的步驟一制備的各種棉花纖維樣品的總RNA。2、按Firstchoice RLM-RACE試劑盒(Ambion)操作說明進(jìn)行Y RACE，靶基因特異的巢式外引物的序列為ACCTTTTTCGTAAAATCTCGTCTA，靶基因特異的巢式內(nèi)引物的序列為GGATGGGTAGAAGAAGTTGTGATGCT。3、得到90bp PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，回收特異條帶。4、將回收的PCR產(chǎn)物連接到pMD 19-T載體(TaKaRa)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。5、挑單克隆測序，根據(jù)測序結(jié)果確定靶基因mRNA的切割位點(diǎn)。測序結(jié)果顯示的切割位點(diǎn)見圖4。GhmiRnE的靶基因在與其互補(bǔ)的區(qū)域發(fā)生了切害I]，這個(gè)結(jié)果強(qiáng)有力的證明了 TC229767確實(shí)是GhmiRnE體內(nèi)真正調(diào)控的靶基因。實(shí)施例4、靶基因的表達(dá)量分析為了進(jìn)一步考察GhmiRnE的功能，用實(shí)時(shí)定量RT-PCR分別檢測靶基因TC229767在開花后5、10、15、20和25天的棉花纖維中的表達(dá)情況。I、分別提取實(shí)施例I的步驟一制備的各棉花纖維樣品的總RNA。2、總RNA加入DNase I (TaKaRa)，室溫放置30min以除去基因組DNA的污染。3、加入終止緩沖液(50mM EDTA)后，70°C加熱IOmin以變性DNase I和RNA。4、采用TaKaRa RNA PCR KU，用RNA合成cDNA模板，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。5、米用 Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)在 iCycler iQ5 Multicolor實(shí)時(shí)定量PCR檢測儀(Bio-Rad)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，通過比較CT值法(Λ ACT值法)(Schmittgen T D. Real-Time Quantitative PCR. Methods, 2001，25:383-385.)計(jì)算靶基因在不同樣品中的相對表達(dá)量(對照組基因的表達(dá)量設(shè)定為I)。靶基因的檢測設(shè)置3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值。以棉花UBQ10基因作為內(nèi)參(ffalford S A. , Wu Y R·，LlewellynD J and Dennis E S. (2011)GhMYB25-like:a key factor in early cotton fibredevelopment. Plant J, 65(5), 785-97)。擴(kuò)增靶基因TC229767的引物如下(5' — )上游弓I 物AATAAAAGACTAAACACAACTC ；下游引物GCCAAAAGGACAACATACAGGA。擴(kuò)增UBQ10基因引物如下(5^ — 3'):上游引物CCAGAAGGAATCCACTTTGC；下游引物CCAGCTCACATCAGCATACG。結(jié)果見圖5，靶基因TC229767在纖維發(fā)育過程中表達(dá)量發(fā)生了明顯的變化，通過和GhmiRnE在5個(gè)小RNA庫中測序數(shù)的表達(dá)(圖2)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)TC229767的表達(dá)和GhmiRnE的表達(dá)呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)性,在開花后5天到15天的纖維中GhmiRnE表達(dá)主要呈明顯上調(diào)的趨勢，TC229767的表達(dá)量呈現(xiàn)明顯下調(diào)的趨勢；15天到20天，GhmiRnE呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢，TC229767表達(dá)量上調(diào)；這與miRNA對靶基因的負(fù)調(diào)控作用是完全一致的，20天之后，次生壁起始，棉花纖維細(xì)胞內(nèi)的代謝流向纖維素合成，miRNA與TC229676同時(shí)下降。實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果進(jìn)一步證明了 TC229767確實(shí)是GhmiRnE的靶基因。
權(quán)利要求
1.序列表的序列I所示的RNA。
2.序列表的序列2所示的RNA。
3.權(quán)利要求I或2所述RNA在抑制乙酰輔酶A羧化酶β亞基基因表達(dá)中的應(yīng)用；所述乙酰輔酶A羧化酶β亞基的氨基酸序列為序列表的序列3。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述乙酰輔酶A羧化酶β亞基基因的核苷酸序列為序列表的序列4或序列表中序列4自5’末端第708-2201位核苷酸。
5.權(quán)利要求I或2所述RNA在促進(jìn)乙酰輔酶A羧化酶β亞基基因的mRNA降解中的應(yīng)用；所述乙酰輔酶A羧化酶β亞基的氨基酸序列為序列表的序列3。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述乙酰輔酶A羧化酶β亞基基因的核苷酸序列為序列表的序列4或序列表中序列4自5’末端第708-2201位核苷酸； 所述促進(jìn)乙酰輔酶A羧化酶β亞基基因的mRNA降解為切割乙酰輔酶A羧化酶β亞基基因的mRNA。
7.權(quán)利要求I或2所述RNA在棉花纖維品質(zhì)改良中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了來源于棉花的miRNA-GhmiRnE及其應(yīng)用。本發(fā)明保護(hù)的GhmiRnE是序列表的序列1所示的RNA。本發(fā)明保護(hù)的GhmiRnE前體(pre-GhmiRnE)是序列表的序列2所示的RNA。本發(fā)明還保護(hù)序列1所示RNA在抑制乙酰輔酶A羧化酶β亞基基因表達(dá)和/或促進(jìn)乙酰輔酶A羧化酶β亞基基因的mRNA降解中的應(yīng)用。所述乙酰輔酶A羧化酶β亞基如序列表的序列3所示。所述乙酰輔酶A羧化酶β亞基基因如序列表的序列4所示。應(yīng)用miRNA-GhmiRnE有望獲得在棉花纖維長度，強(qiáng)度有重要表型的植株，具有重要的生物學(xué)意義和潛在應(yīng)用價(jià)值，將為棉花的品質(zhì)育種(如培育抗逆性棉花)提供寶貴的基因資源，帶來一定的研究價(jià)值和社會效益，并最終用于實(shí)際生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/113GK102899326SQ201210398840
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月19日
發(fā)明者劉進(jìn)元, 薛偉, 王正明 申請人:清華大學(xué)