專利名稱：位點特異性絲氨酸重組酶和它們的使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及用于在細(xì)胞基因組中進行多核 苷酸的位點特異性整合、刪除、倒位、交換和易位的組合物和方法。本發(fā)明也涉及酶、多核苷酸、多肽和載體構(gòu)建物。
背景技術(shù)：
許多噬菌體和整合型質(zhì)粒編碼位點特異性重組系統(tǒng)，這使得能夠?qū)⑺鼈兊幕蚪M穩(wěn)定地整合入它們宿主的基因組中，并將它們的基因組從宿主基因組切除。在這些系統(tǒng)中，對于重組反應(yīng)的最小要求是重組酶和兩個重組位點，其中重組酶催化重組事件(Sadowski(1986)J. Bacteriol. 165:341-347 ；Sadowski(1993)FASEB J.7:760-767)。對于噬菌體整合系統(tǒng)而言，這些是指附著(att)位點，來自噬菌體DNA的attP元件以及在細(xì)菌基因組中存在的attB元件。這兩個附著位點可能共有少至幾個堿基對的序列同一性。重組酶蛋白與兩個att位點結(jié)合，并催化DNA鏈的保守性和互換性交換，這導(dǎo)致環(huán)狀噬菌體或質(zhì)粒DNA整合入宿主DNA。也可能需要其他噬菌體或宿主因子，諸如DNA結(jié)合蛋白IHF、整合宿主因子，以獲得有效率的反應(yīng)(Friedman(1988)CelI 55:545-554;Finkel& Johnson(1992)Mol. Microbiol. 6:3257-3265)。在噬菌體生長循環(huán)的裂解階段，噬菌體整合酶，與其他宿主和/或噬菌體因子聯(lián)合起來，也將噬菌體基因組從細(xì)菌基因組切割下來。已經(jīng)開發(fā)出若干方法，從而使得能對哺乳動物基因組進行操作，以便闡明特定的感興趣基因的相關(guān)性和功能。在這些方法中，轉(zhuǎn)基因小鼠株和基因靶向技術(shù)的開發(fā)已經(jīng)證明是特別有用的(Brandon, E. P. , Idzerda, R. L. and McKnight, G. S. (1995) CurrBiol, 5, 625-34 ; Brandon, E. P. , Idzerda, R. L. and McKnight, G. S. (1995) Curr Biol,5，758-65)。伴隨著位點特異性重組酶的表征和應(yīng)用，這些技術(shù)已經(jīng)取得了新的進步(Kilby, N. J. , Snaith, M. R. and Murray, J. A. (1993) Trends Genet, 9, 413-21)。位點特異性重組酶可以分為兩個主要家族。第一個家族(Int家族或酪氨酸重組酶家族)包括這些酶，它們催化或者位于相同DNA分子中的位點之間的重組(分子內(nèi)重組，導(dǎo)致分離、切除或倒位)或位于不同DNA分子中的位點之間的重組(分子間重組，導(dǎo)致整合)(Sauer, B. (1993)Methods EnzymoI, 225, 890-900 ；Dymecki, S.Μ. (1996)Proc Natl Acad Sci USA, 93, 6191-6 ；Abremski, K. and Hoess, R. (1984)J BiolChem, 259, 1509-14 ；Nash, H. A. (1996)in Escherichia coli and Salmonella cellularand molecular biology. , ed. F. C. Neidhart, R.1. Curtis, J. L.1ngraham, E. C. C. Lin, K.B. Low, B. Magasanik, ff. S. Rezaikof f, M. Ri ley, M. Schaechter and H. E. Umbager (A.S. M. Press, Washington D. C.)，pp. 2363-7)。后一特性已被開發(fā)利用，使得能將特異性序列革巴向插入到精確的位置(Sauer, B. and Henderson, N. (1990) The New Biologist, 2，441-9 ；Fukushige, S. and Sauer, B. (1992) Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 89, 7905-9)。已被用于操作哺乳動物基因組的重組酶主要是Cre蛋白和Flp蛋白，它們屬于Int家族(Kilby，N.J. , Snaith, M. R. and Murray, J. A. (1993) Trends Genet, 9, 413-21)。這些酶的目標(biāo)序列，對于Cre酶而言稱為IoxP位點，對于Flp酶而言稱為FRT,由短的反向重復(fù)組成，蛋白與反向重復(fù)結(jié)合。在基因組的長距離(高達(dá)70kb)上，重組過程是可操作的。通過使用這些酶，有若干作者已經(jīng)報道了在鼠模型中的位點特異性和組織特異性DNA重組(DiSanto, J. P.，Muller, W.，Guy, G. D.，F(xiàn)ischer, A. and Rajewsky, K. (1995)Proc NatlAcad Sci USA, 92, 377-81 ；Gu, H. , Marth, J. D. , Orban, P. C, Mossmann, H. and Rajewsky, K.(1994) Science, 265, 103-6 ；Kuhn, R. , Schwenk, F. , Aguet, M. and Rajewsky, K. (1995)Science, 269, 1427-9 ；Orban, P. C, Chui, D. and Marth, J. D. (1992) Proc. Natl. Acad. Sc1.USA, 89, 6861-5),植物和動物中的染色體異位(Deursen, J. v. , Fornerod, Μ. , Rees, B.ν. and Grosveld, G. (1995) Proc. Natl. Acad Sc1. USA, 92, 7376-80 ；Medberry, S. L. , Dale, E. , Qin, M. and Ow, D. ff. (1995) Nucleic Acids Res, 23, 485-90 ；0sborne, B. L, ffirtz, U. and Baker, B. (1995) Plant J，7，687-701)，特定基因的靶向誘導(dǎo)(Pichel, J.G. , Lakso, M. and ffestphal, Η. (1993) Oncogene, 8, 3333-42)。Cre-1oxP 系統(tǒng)已經(jīng)與誘導(dǎo)型啟動子，如干擾素Y誘導(dǎo)型啟動子聯(lián)合應(yīng)用，用于促進在肝臟中高效率地進行基因敲除，但使得基因敲除在其他組織中處于較小程度(Kuhn, R.，Schwenk, F.，Aguet, M. andRajewsky, K. (1995) Science, 269, 1427-9)。然而，位點特異性重組系統(tǒng)在相同的基因組中僅僅使誘導(dǎo)數(shù)量減少的重組事件成為可能。鑒于每一重組反應(yīng)將處于基因組的交換位點處的目標(biāo)序列交給重組酶處理，并且因為重組酶(例如Cre和Flp)能夠催化分子間重組，所以整個過程可能導(dǎo)致不期望的染色體重排。重組酶的第二個家族統(tǒng)稱為解離酶/轉(zhuǎn)化酶家族或絲氨酸家族(Grindley，N.D. F. (1994)于 Nucleic Acids and Molecular Biology, ed. F. Eckstein and D. M. J. Lilley (Springer-Verlag, Berlin), pp. 236-67 中；(Smith, M. C. and Thorpe, Η. M. (2000)Mol.Microbiol.，44，299-307))。這些位點特異性重組酶，其包括催化分子內(nèi)和分子間反應(yīng)的酶，比起Int重組酶家族可能具有優(yōu)勢。催化噬菌體整合的絲氨酸重組酶(整合酶)特別適合用作基因工程的工具。到目前為止，在哺乳動物中，已經(jīng)研究了三種絲氨酸重組酶OC31、R4 和 TP901-1 (Groth, A. C. and Calos, Μ. P. (2004) J. Mol. Biol. 335，667-678)。觀察到這些重組酶是自主的，具有簡單的att序列并有能力在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)揮功能。因為除了attP或attB之外，觀察到在任何位點的組合之間鮮有或沒有重組，整合是單向性的，并且具有高的整合頻率。比起利用了重組酶Int家族的成員的現(xiàn)有重組系統(tǒng)，絲氨酸重組酶提供了明顯的優(yōu)勢。這些酶具有眾多的應(yīng)用。一個途徑是將att位點置于生物體的基因組中，并用作重組的靶標(biāo)。申請人:已經(jīng)鑒定了新型絲氨酸重組酶，該酶展示了在各種哺乳動物細(xì)胞和在植物細(xì)胞中具有強力活性，也展示了將多核苷酸穩(wěn)定整合入宿主細(xì)胞基因組或從宿主細(xì)胞基因組切除多核苷酸的能力。發(fā)明概述本發(fā)明提供在真核細(xì)胞中獲得穩(wěn)定的位點特異性重組的方法和組合物。與之前描述的位點特異性重組的方法相反地，本重組酶和它們的使用方法提供穩(wěn)定的、不可逆的位點特異性重組。本發(fā)明組合物提供重組酶多肽，該重組酶多肽介導(dǎo)第一重組位點和第二重組位點之間的位點特異性重組。在一些實施方式中，核酸還包括重組酶多肽識別的重組位點。本發(fā)明涉及提供包含第一重組位點和第二重組位點的真核細(xì)胞，其中該第二重組位點能充當(dāng)與第一重組位點進行重組的底物。將第一和第二重組位點與原核重組酶多肽接觸，導(dǎo)致在重組位點之間產(chǎn)生重組。重組位點之一或兩者能在真核細(xì)胞的染色體中存在。在一些實施方式中，重組位點的其中之一存在于染色體中，而另一重組位點則包含在欲被整合入該染色體的核酸中。
本發(fā)明也提供了含有原核重組酶多肽或編碼原核重組酶的核酸的真核細(xì)胞。在這些實施方式中，重組酶能夠介導(dǎo)第一重組位點和第二重組位點之間的位點特異性重組，其中第二重組位點充當(dāng)與第一重組位點發(fā)生重組的底物。在優(yōu)選的實施方式中，重組酶選自單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)曬菌體、化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)卩遼菌體、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtil is)卩遼菌體、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)卩遼菌體和恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)噬菌體。更優(yōu)選地，重組酶選自Al 18重組酶、SF370.1重組酶、SP β c2重組酶、Φ Rvl重組酶和Bxbl重組酶。在其他實施方式中，本發(fā)明提供獲得具有穩(wěn)定整合的多核苷酸序列的真核細(xì)胞的方法。這些方法涉及將核酸引入真核細(xì)胞，該真核細(xì)胞含有第一重組位點一其中所述核酸包含感興趣的轉(zhuǎn)基因，和第二重組位點一其充當(dāng)與第一重組位點重組的底物。第一重組位點和第二重組位點與原核重組酶多肽接觸。重組酶多肽催化第一重組位點和第二重組位點之間的重組,導(dǎo)致核酸整合在第一重組位點。噬菌體重組酶在活細(xì)胞中特異性地且有效地指導(dǎo)DNA序列之間的重組的能力，使得它們在多種基因工程應(yīng)用中具有潛在的用處。這樣的應(yīng)用包括多核苷酸序列的整合、切除、倒位、易位和盒式交換。
附圖簡述

圖1 描述了瞬時分子內(nèi)重組試驗(Transient Intramolecular RecombinationAssay (TIRA))的示意圖，用于測定在目標(biāo)或試驗卩遼菌體上重組酶檢測attP和attB位點之間的重組的能力，如實施例所述。圖2示出了在人胚胎腎(human embryonic kidney (HEK293))細(xì)胞中進行的各種重組酶的TIRA結(jié)果。圖3示出了在小鼠NIH3T3細(xì)胞中進行的各種重組酶的TIRA結(jié)果。圖4示出了在中國倉鼠卵(CHO)細(xì)胞中進行的各種重組酶的TIRA結(jié)果。圖5示出了在人HeLa細(xì)胞中進行的各種重組酶的TIRA結(jié)果。圖6示出了在大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞中進行的各種重組酶的TIRA結(jié)果。圖7示出了在小鼠神經(jīng)干細(xì)胞中進行的各種重組酶的TIRA結(jié)果。圖8示出了在煙草BY2細(xì)胞中進行的Al 18重組酶的TIRA結(jié)果。
圖9描述了將含有attP或attB序列的質(zhì)粒DNA穩(wěn)定整合入含attB或attP位點的HEK293染色體的示意圖。圖10示出了在將含有attP或attB序列的質(zhì)粒DNA穩(wěn)定整合入含attB或attP位點的HEK293細(xì)胞染色體之后，對attL和attR位點的PCR擴增結(jié)果。圖11描述了由重組酶引起的穩(wěn)定整合的STOP序列的切除和熒光素酶活性的激活的示意圖。圖12示出了由重組酶引起的穩(wěn)定整合的STOP序列的切除和熒光素酶活性的激活的結(jié)果。圖13描述了將含有attP或attB重組位點的質(zhì)粒插入或整合入HEK293細(xì)胞中存在的天然假attB或假attP位點的示意圖。圖14示出了在HEK293細(xì)胞中鑒定到的SF370.1和SP β c2重組酶的天然假attB位點的核苷酸序列。
優(yōu)選實施方式的描述 定義在本公開中，使用了許多術(shù)語和縮寫。下面提供了定義，應(yīng)該有助于理解本發(fā)明的范圍和實踐。在具體的實施方案中，術(shù)語“大約”或“近似地”是指在一個給定的值或范圍的20%內(nèi)、優(yōu)選10%內(nèi)、更優(yōu)選5%內(nèi)和甚至更優(yōu)選1%范圍內(nèi)。本文所用的“重組酶(Recombinase)”指能夠促進確定位點之間的位點特異性重組的一組酶，其中所述位點在單個DNA分子上物理分開，或其中所述位點駐留在分開的DNA分子上。確定的重組位點的DNA序列不必是相同的。重組的起始依靠蛋白質(zhì)-DNA相互作用，在該組內(nèi)，有大量的蛋白質(zhì)，它們催化噬菌體整合和切除(例如λ整合酶，Φ031)、環(huán)狀質(zhì)粒的分離(例如Τη3、Y δ、Cre, Flp)、替代基因表達(dá)的DNA倒位(例如Hin, Gin、Pin)、發(fā)育期間基因的裝配(例如Anabaena固氮基因)、以及轉(zhuǎn)座(例如S607轉(zhuǎn)座子)。基于進化和機械論相關(guān)性，大部分位點特異性重組酶落入這兩個家族之一中。它們是λ整合酶家族或酪氨酸重組酶(例如Cre、Flp、Xer D)，和解離酶/整合酶家族或絲氨酸重組酶家族(例如，Φ〇31、ΤΡ901-1、Τη3、γ δ ) 0“重組附著位點(Recombination attachment site)”是被本文所述的重組酶識別的特異性多核苷酸序列。典型地，牽涉到兩種不同的位點(稱為“互補位點(complementarysites) ”)，一種存在于目標(biāo)核酸中(例如，真核生物或原核生物的染色體或附加體)，另一種存在于待被整合在所述目標(biāo)重組位點上的核酸中。術(shù)語“attB”和“attP”分別指來源于細(xì)菌目標(biāo)和噬菌體供體的附著(或重組)位點，它們被用于本文，盡管特定酶的重組位點可能有不同的名稱。重組位點典型地包括被核心區(qū)域或間隔區(qū)域隔開的左右臂。因此，attB重組位點由BOB’組成，其中B和B’分別是左臂和右臂，O是核心區(qū)域。類似地，attP是POP’，其中P和P’是臂，O還是核心區(qū)域。一旦在attB和attP位點之間發(fā)生重組，以及在目標(biāo)上伴隨著發(fā)生核酸整合之后，整合的DNA側(cè)翼的重組位點稱為“attL”和“attR”。通過使用上面的術(shù)語，attL和attR位點因此分別由Β0 Ρ’和Ρ0Β’組成。在本文的一些表述中，“O”被省略，例如attB和attP分別以BB’和PP，指代。術(shù)語“基本上無(substantially free)”是指當(dāng)組合物中按重量計約75%的蛋白、DNA、載體(取決于A和B所屬的物質(zhì)種類)是“A”時，包含“A”(其中“A”是單一的蛋白、DNA分子、載體、重組宿主細(xì)胞等)的該組合物基本上無“B”(其中“B”包括一種或多種污染蛋白、DNA分子、載體等)。優(yōu)選地，按組合物中A+B物質(zhì)的重量計算，“A”占至少約90%，最優(yōu)選地按重量計算占至少約99%。而且，優(yōu)選地，基本上無污染的組合物僅僅包含單一分子量的物質(zhì)，該物質(zhì)具有感興趣的物質(zhì)活性或特征。對于本發(fā)明的目的而言，術(shù)語“分離的”是指已從其原始環(huán)境(其自然存在的環(huán)境)中移出的生物物質(zhì)(核酸或蛋白質(zhì))。例如，以自然狀態(tài)存在于植物或動物中的多核苷酸不是分離的，然而，與它自然存在時的相鄰核酸分離開的同樣的多核苷酸則被認(rèn)為是“分離的”。術(shù)語“純化的”并不要求該物質(zhì)以表現(xiàn)出絕對純、不存在其他化合物的形式存在。它只是一個相對的定義。在將起始材料或天然材料純化至少一個數(shù)量級、優(yōu)選2 個或3個數(shù)量 級,優(yōu)選4個或5個數(shù)量級之后，多核苷酸便是處于“純化的”狀態(tài)?！昂怂帷笔怯晒矁r連接的稱之為核苷酸的亞基組成的聚合化合物。核酸包括多核糖核酸(RNA)和多脫氧核糖核酸(DNA)，兩者都可以是單鏈或雙鏈的。DNA包括但是不限于cDNA、基因組DNA、質(zhì)粒DNA、合成DNA和半合成DNA。DNA可以是線性的、環(huán)狀的或超螺旋的。“核酸分子”是指核糖核苷(腺苷、鳥苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)，或脫氧核糖核苷(脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷或脫氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式，或其任何磷酸酯類似物，如硫代磷酸酯和硫酯，其或者為單鏈形式或者為雙鏈螺旋。可以是雙鏈DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RnA螺旋體。術(shù)語核酸分子，特別是DNA或RNA分子，僅指該分子的一級和二級結(jié)構(gòu)，并不將之限于任何特定的三級結(jié)構(gòu)形式。因此，該術(shù)語包括雙鏈DNA，尤其存在于線性或環(huán)狀DNA分子(例如限制性片段)、質(zhì)粒和染色體中。在論述特定的雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)時，本文中序列可以根據(jù)常規(guī)慣例進行描述，僅給出沿著DNA的非轉(zhuǎn)錄鏈(即，與mRNA具有序列對應(yīng)性的鏈)從5’至3’方向的序列?！爸亟MDNA分子”是指經(jīng)過分子生物學(xué)操作的DNA分子。術(shù)語“片段”將被理解為是指長度比參考核酸短的核苷酸序列，并且在共同部分上包含與參考核酸相同的核苷酸序列。如果合適的話，根據(jù)本發(fā)明的這樣的核酸片段可以被包含在更大的多核苷酸中，該片段是該更大的多核苷酸的組成成分。這樣的片段包括長度在本發(fā)明的核酸的至少 6、8、9、10、12、15、18、20、21、22、23、24、25、30、39、40、42、45、48、50、51、54、57、60、63、66、70、75、78、80、90、100、105、120、135、150、200、300、500、720、900、1000或1500個連續(xù)核苷酸范圍內(nèi)的寡核苷酸，或可選地由這樣的寡核苷酸組成。如本文中使用地，“分離的核酸片段”是指單鏈或雙鏈的RNA或DNA聚合物，可選地包含合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。DNA聚合物形式的分離的核酸片段可以包括cDNA、基因組DNA或合成的DNA中的一個或多個片段?！盎颉笔侵妇幋a多肽的核苷酸的裝配物，包括cDNA和基因組DNA核酸?！盎颉币仓副磉_(dá)特定蛋白或多肽的核酸片段，包括編碼序列之前(5’非編碼序列)和之后(3’非編碼序列)的調(diào)控序列?！疤烊换颉笔侵柑烊话l(fā)現(xiàn)的具有它自己的調(diào)控序列的基因?！扒逗匣颉笔侵覆皇翘烊换虻娜魏位?，其包含在天然條件下不在一起的調(diào)控序列和/或編碼序列。因此，嵌合基因可以包含不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或相同來源但以與天然發(fā)現(xiàn)的不同的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列。嵌合基因可以包括不同來源的編碼序列，和/或不同來源的調(diào)控序列?！皟?nèi)源基因”是指在生物體的基因組中的天然位置的天然基因?！巴鈦怼被蚧颉爱愒础被蚴侵冈谡Ｇ闆r下不在宿主生物體中的基因，而是通過基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)入宿主生物體的基因。外來基因可以包括插入到非天然生物中的天然基因或嵌合基因?！稗D(zhuǎn)基因”是通過轉(zhuǎn)化程序被導(dǎo)入到基因組中的基因?！爱愒础盌NA是指不是天然位于細(xì)胞中或不是天然位于細(xì)胞染色體位點中的DNA。優(yōu)選地，異源DNA包括對該細(xì)胞而言為外來的基因。術(shù)語“基因組”包括染色體以及線粒體、葉綠體和病毒DNA或RNA。當(dāng)在合適的溫度和溶液離子強度條件下，單鏈形式的核酸分子能夠與其他核酸分子退火，那么該核酸分子便與另一核酸分子如cDNA、基因組DNA或RNA是可雜交的(參見Sambrook et &1.，1989下文)。雜交條件和洗漆條件是眾所周知的，并在 Sambrook, J. , Fritsch, E. F.和 Maniatis,T.Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor (1989)中示例性說明，特別是在其中的第11章和表11.1 (該文獻(xiàn)整體并入本文作為參考)。溫度和離子強度條件決定了雜交的“嚴(yán)格性”?？梢哉{(diào)整嚴(yán)格性條件以篩選中等程度類似的片段例如來自關(guān)系遠(yuǎn)的生物的同源序列，至高度相似的片段例如來自關(guān)系近的生物的同樣功能的酶的基因。對于同源核酸的初篩，可以使用低嚴(yán)格性的雜交條件，對應(yīng)于55°C的Tm，例如5XSSC、0. 1%SDS、0. 25%牛奶，無甲酰胺；或30%甲酰胺、5XSSC、0. 5%SDS)。中度嚴(yán)格性雜交條件對應(yīng)于較高的Tm，例如40%甲酰胺、以及5X或6XSCC。高度嚴(yán)格性雜交條件對應(yīng)于最高的Tm，例如50%甲酰胺、5X 或 6XSCC。雜交要求兩條核酸含有互補序列，盡管取決于雜交的嚴(yán)格性，堿基之間還是可能會發(fā)生錯配。術(shù)語“互補”被用于描述能夠相互雜交的核苷酸堿基之間的關(guān)系。例如，對于DNA，腺嘌呤與胸腺嘧啶互補，胞嘧啶與鳥嘌呤互補。因此，本發(fā)明也包括與公開于此或使用于此的全序列以及那些基本上類似的核酸序列互補的分離的核酸片段。在本發(fā)明的特定實施方案中，通過使用包括Tm為55°C的雜交步驟的雜交條件并利用上述的條件，檢測多核苷酸。在優(yōu)選的實施方案中，！ 為60°C，在更優(yōu)選的實施方案中，Tm為63 °C，在更為優(yōu)選的實施方案中，Tm為65V。雜交后的洗滌也決定嚴(yán)格性條件。一組優(yōu)選的條件使用一系列的洗滌步驟以6XSSC、0. 5%SDS室溫中進行15分鐘起始，然后2 X SSC、0. 5%SDS在45°C進行30分鐘，重復(fù)洗滌；然后O. 2XSSC、0. 5%SDS在50°C進行30分鐘，重復(fù)兩次。更優(yōu)選的一組嚴(yán)格性條件使用更高的溫度，其中洗滌步驟與上述步驟相同，除了在O. 2XSSC、0. 5%SDS中進行最后兩次30分鐘洗滌的溫度增加到60°C。另一組優(yōu)選的高嚴(yán)格性條件是在65°C，在O.1 X SSC,O. P/oSDS中進行最后2次洗滌。雜交要求兩條核酸含有互補序列，盡管取決于雜交的嚴(yán)格性，堿基之間還是可能會錯配。使核酸雜交的合適的嚴(yán)格性取決于核酸的長度和互補程度，這些是本領(lǐng)域熟知的變量。兩條核苷酸序列之間的相似性或同源性程度越大，具有那些序列的核酸雜交體的Tm值越大。核酸雜交的相對穩(wěn)定性(對應(yīng)于較高的Tm)按照下列次序降低RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNAο對于長度大于100個核苷酸的雜交體，已經(jīng)推導(dǎo)出計算Tm的公式(參見Sambrooket al.，上文，9. 50-0. 51)。對于較短核酸即寡核苷酸的雜交，錯配的位置變得更加重要，寡核苷酸的長度決定其特異性(參見Sambrook et al.，上文，11. 7-11. 8)。在本發(fā)明特定的實施方案中，利用包括小于500mM鹽和至少37°C的雜交步驟以及在2XSSPE和至少華氏溫度63度的洗滌步驟的雜交條件，來檢測多核苷酸。在優(yōu)選的實施方案中，雜交條件包括小于200mM鹽和至少華氏溫度37度的雜交步驟。在更優(yōu)選的實施方案中，雜交條件包括2 X SSPE和華氏溫度63度的雜交和洗滌步驟。在一個實施方案中，可雜交核酸的長度為至少約10個核苷酸。優(yōu)選地，可雜交核酸的最小長度為至少約15個核苷酸；更優(yōu)選至少約20個核苷酸；最優(yōu)選地長度為至少30個核苷酸。而且，技術(shù)人員將認(rèn)識到，溫度和洗滌溶液的鹽濃度可以根據(jù)各種因素例如探針長度作必要的調(diào)整。術(shù)語“探針”是指單鏈核酸分子，其可以與互補的單鏈目標(biāo)核酸進行堿基配對，形成雙鏈分子。如在此所使用，術(shù)語“寡核苷酸”是指通常至少18個核苷酸的核酸，其可以與基因·組DNA分子、cDNA分子、質(zhì)粒DNA或mRNA分子雜交。寡核苷酸可以被標(biāo)記，例如用32P-核苷酸或采用已經(jīng)與標(biāo)記物如生物素共價偶聯(lián)的核苷酸進行標(biāo)記。標(biāo)記的寡核苷酸可以用作探針來檢測核酸的存在。寡核苷酸(其中之一或兩者可以被標(biāo)記)可以用作PCR引物，用于克隆全長核酸或核酸片段，或者用于檢測核酸的存在。寡核苷酸也可以用于與DNA分子形成三螺旋。一般而言，寡核苷酸通過合成制得，優(yōu)選在核酸合成儀上合成。因此，寡核苷酸可以用非天然存在的磷酸酯類似鍵例如硫酯鍵等制備?！耙铩笔侵冈诤线m的條件下與目標(biāo)核酸序列雜交、從而產(chǎn)生可以充當(dāng)DNA合成起點的雙鏈核酸區(qū)域的寡核苷酸。這樣的引物可以用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)?！熬酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)”縮寫為PCR，是指酶促擴增特定核酸序列的體外方法。PCR涉及一系列反復(fù)的溫度循環(huán)，每一循環(huán)包括三個階段對模板核酸變性以分開目標(biāo)分子的鏈，將單鏈PCR寡核苷酸引物與模板核酸退火，用DNA聚合酶延伸退火的引物。PCR提供了檢測目標(biāo)分子存在與否的手段，并且在定量或半定量條件下，可以確定目標(biāo)分子在原始核酸庫中的相對數(shù)量?！澳孓D(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”的縮寫是RT-PCR，是指由RNA分子或多個RNA分子酶法產(chǎn)生目標(biāo)cDNA分子或多個分子、然后如上所述酶法擴增目標(biāo)cDNA分子或多個分子內(nèi)的特定核酸序列或多個序列的體外方法。RT-PCR也提供了檢測目標(biāo)分子存在與否的手段，并且在定量或半定量條件下，可以確定目標(biāo)分子在起始核酸庫中的相對數(shù)量。DNA “編碼序列”是雙鏈DNA序列，該序列當(dāng)置于合適的調(diào)控序列的控制下時在細(xì)胞中以體外或體內(nèi)的方式被轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽?！昂线m的調(diào)控序列”是指位于編碼序列的上游(5’非編碼序列)、之內(nèi)或下游(3’非編碼序列)的核苷酸序列，它們影響相關(guān)聯(lián)的編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性、或翻譯。調(diào)控序列可以包括啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、多腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應(yīng)物結(jié)合位點和莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。編碼序列的邊界由5’(氨基)端的起始密碼子和3’(羧基)端的翻譯終止密碼子確定。編碼序列可以包括但是不限于原核序列、mRNA產(chǎn)生的cDNA、基因組DNA序列、甚至合成的DNA序列。如果編碼序列欲在真核細(xì)胞中表達(dá)，多腺苷酸化信號序列和轉(zhuǎn)錄終止序列通常將位于該編碼序列的3’端?！伴_放閱讀框”縮寫為0RF，是指一定長度的核酸序列，其是DNA、cDNA或者RNA，包括翻譯起始信號或起始密碼子，例如ATG或AUG，和終止密碼子，并且潛在地能夠翻譯成多肽序列。術(shù)語“頭對頭”在此被用于描述兩條多核苷酸序列彼此之間的定向。當(dāng)一條多核苷酸的編碼鏈的5’端與另一條多核苷酸的編碼鏈的5’端相鄰時，這兩條多核苷酸以頭對頭的方向定位，因此，各條多核苷酸的轉(zhuǎn)錄方向以遠(yuǎn)離另一條多核苷酸的5’端的方式進行。術(shù)語“頭對頭”可以縮寫為(5’)_對_(5’)，也可以用符號(一一)或(3’ 一 5’5’ 一 3’)表
/Jn ο術(shù)語“尾對尾”在此被用于描述兩條多核苷酸序列彼此之間的定向。當(dāng)一條多核苷酸的編碼鏈的3’端與另一條多核苷酸的編碼鏈的3 ’端相鄰時，這兩條多核苷酸以尾對尾的方向定位，因此，各條多核苷酸的轉(zhuǎn)錄方向朝著另一條多核苷酸的方向進行。術(shù)語“尾對尾”可以縮寫為(3’)_對_(3’)，也可以用符號(一一)或(5’ 一3’3’ 一5’)表示。術(shù)語“頭對尾”在此被用于描述兩條多核苷酸序列彼此之間的相對定向。當(dāng)一條多核苷酸的編碼鏈的5’端與另一條多核苷酸的編碼鏈的3’端相鄰時，這兩條多核苷酸以頭對尾的方向定位，因此，各條多核苷酸的轉(zhuǎn)錄方向以與另一條多核苷酸相同的方向進行。術(shù)語“頭對尾”可以縮寫為(5’)_對_(3’)，也可以用符號(一一)或(5’ 一3’5’ 一3’)表
/Jn ο術(shù)語“下游”是指位于參考核苷酸序列3’端的核苷酸序列。特別地，下游核苷酸序列通常涉及轉(zhuǎn)錄起始點之后的序列。例如，基因的翻譯起始密碼子位于轉(zhuǎn)錄起始位點的下游。術(shù)語“上游”是指位于參考核苷酸序列5’端的核苷酸序列。特別地，上游核苷酸通常涉及位于編碼序列或轉(zhuǎn)錄起始點的5’側(cè)的序列。例如，大部分的啟動子位于轉(zhuǎn)錄起始位點的上游。術(shù)語“限制性核酸內(nèi)切酶”和“限制性酶”是指結(jié)合并切割雙鏈DNA內(nèi)的特定核苷酸序列的酶?！巴粗亟M”是指將外來DNA序列插入另一 DNA分子，例如將載體插入染色體。優(yōu)選地，載體靶向于特定的染色體位點進行同源重組。對于特異性的同源重組，載體將含有與染色體的序列同源的足夠長的區(qū)域，以允許載體進行互補性結(jié)合并整合入染色體。較長的同源區(qū)域和較高的序列相似性程度，可以提高同源重組的效率。本領(lǐng)域已知的若干方法可以用于增殖本發(fā)明的多核苷酸。一旦建立合適的宿主系統(tǒng)和生長條件，可以定量增殖和制備重組表達(dá)載體。如在此所描述，可以使用的表達(dá)載體包括但是不限于下述載體或它們的衍生物人或動物病毒例如牛痘病毒或腺病毒；昆蟲病毒例如桿狀病毒；酵母載體；噬菌體載體(例如λ噬菌體載體)以及質(zhì)粒和粘粒DNA載體，以這些為例?！拜d體”是指用于克隆核酸和/或?qū)⒑怂徂D(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞的任何工具。載體可以是另一 DNA片段可以連接到其上從而使得該被連接的片段可被復(fù)制的復(fù)制子?！皬?fù)制子”是指作為在體內(nèi)的自主DNA復(fù)制單元而發(fā)揮功能，即能夠在它自己的控制下進行復(fù)制的任何遺傳元件(例如質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、染色體、病毒)。術(shù)語“載體”包括用于體外、離體或體內(nèi)將核酸導(dǎo)入細(xì)胞的病毒和非病毒工具。本領(lǐng)域已知的大量載體可以被用于操作核酸、將應(yīng)答元件和啟動子整合入基因等。可能的載體包括例如質(zhì)?；蛐揎椀牟《?，包括例如細(xì)菌噬菌體，如λ衍生物，或質(zhì)粒如pBR322或pUC質(zhì)粒衍生物,或Bluescript載體。例如,通過將合適的DNA片段連接入具有互補粘性末端的選擇載體，可以將對應(yīng)于應(yīng)答元件和啟動子的DNA片段插入合適的載體中?？蛇x擇地，DNA分子的末端可以通過酶法修飾，或者可以通過將核苷酸序列(接頭)連接到該DNA末端產(chǎn)生任何位點。這樣的載體可以進行工程改造，以含有選擇性標(biāo)記基因，用于選擇已經(jīng)將該標(biāo)記整合入細(xì)胞基因組的細(xì)胞。這樣的標(biāo)記允許鑒定和/或選擇整合并表達(dá)由該標(biāo)記編碼的蛋白的宿主細(xì)胞。病毒載體，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，已經(jīng)在細(xì)胞以及活的動物對象中用于各種各樣的基因傳遞應(yīng)用中。可以使用的病毒載體包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒、痘病毒、桿狀病毒、牛痘病毒、單純皰疹病毒、EB病毒、腺病毒、雙生病毒和花椰菜花葉病毒載體。非病毒載體包括質(zhì)粒、脂質(zhì)體、帶電荷脂質(zhì)(細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑(cytofectins))、DNA_蛋白質(zhì)復(fù)合體和生物聚合物。除了核酸外，載體還可以包括一個或多個調(diào)控區(qū)域，和/或選擇性標(biāo)記，這些標(biāo)記可用于選擇、測定和監(jiān)控核酸轉(zhuǎn)移結(jié)果(轉(zhuǎn)移到哪些組織，表達(dá)的持續(xù)時間等)。術(shù)語“質(zhì)粒”是指染色體外元件，它們常常攜帶不是作為細(xì)胞的中心代謝的一部分 的基因，并且常常是環(huán)狀雙鏈DNA分子的形式。這樣的元件可以是來自任何來源的自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，線性、環(huán)狀或超螺旋的，單鏈或雙鏈DNA或RNA，其中許多核苷酸序列已經(jīng)被連接入或重組入獨特的結(jié)構(gòu)中，該結(jié)構(gòu)能夠?qū)⑨槍λx的基因產(chǎn)物的啟動子片段和DNA序列以及合適的3’端非翻譯序列導(dǎo)入細(xì)胞?！翱寺≥d體”是“復(fù)制子”，為核酸的單元長度，優(yōu)選是DNA，它按順序復(fù)制，并包含復(fù)制起點，例如質(zhì)粒、噬菌體或粘粒，其上可以連接另一核酸片段從而復(fù)制該被連接的片段。克隆載體可以具有在一種細(xì)胞類型中復(fù)制并在另一細(xì)胞類型中表達(dá)的能力(“穿梭載體”)。載體可以通過本領(lǐng)域已知的方法導(dǎo)入期望的宿主細(xì)胞，例如轉(zhuǎn)染、電穿孔、微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀、脂轉(zhuǎn)染(溶酶體融合)、使用基因槍或DNA載體轉(zhuǎn)運蛋白(參見例如 Wu et al·，1992，J. Biol. Chem. 267:963-967 ;Wu 和 Wu, 1988，J.Biol. Chem. 263:14621-14624 ;和 Hartmut et al.，1990 年 3 月 15 日提交的加拿大專利申請 2，012，311)。本發(fā)明的多核苷酸也可以通過脂轉(zhuǎn)染體內(nèi)導(dǎo)入。在過去10年中，使用脂質(zhì)體體外包囊和轉(zhuǎn)染核酸一直在增加。設(shè)計用來限制脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染所遇到的困難和危險的合成陽離子脂質(zhì)，可以用于制備脂質(zhì)體，用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染編碼標(biāo)記的基因(Feigner etal. , 1987, Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 84:7413 ；Mackey, et al. , 1988, Proc. Natl. Acad.Sc1. U.S. A. 85:8027-8031 ;和 Ulmer et al.，1993，Science 259:1745-1748)。使用陽離子脂質(zhì)可以促進帶負(fù)電荷的核酸的包囊，還可以促進與帶負(fù)電的細(xì)胞膜的融合(Feigner andRingold, 1989，Science 337:387-388)。國際專利出版物 TO95/18863 和 TO96/17823 以及在美國專利5，459，127中描述了可用于轉(zhuǎn)移核酸的特別有用的脂質(zhì)化合物和組合物。利用脂轉(zhuǎn)染將外源基因體內(nèi)導(dǎo)入特定的器官具有某些實踐優(yōu)點。脂質(zhì)體對特定細(xì)胞的分子靶向代表了一個方面的益處。明顯的是，針對特定的細(xì)胞類型進行轉(zhuǎn)染在具有細(xì)胞異質(zhì)性的組織例如胰腺、肝臟、腎臟和腦中將是特別優(yōu)選的。脂質(zhì)可以用化學(xué)的方法偶聯(lián)到其他分子以用于靶向的目的(Mackey，et al.，1988，上文)。被靶向的肽例如激素或神經(jīng)遞質(zhì)，以及蛋白質(zhì)例如抗體，或非肽分子可以通過化學(xué)方法偶聯(lián)到脂質(zhì)體。其他分子也可用于幫助進行核酸的體內(nèi)轉(zhuǎn)染，例如陽離子寡肽(例如W095/21931)、衍生自DNA結(jié)合蛋白的肽(例如W096/25508)或陽離子聚合物(例如W095/21931)。將載體作為裸DNA質(zhì)粒體進行內(nèi)導(dǎo)入也是可能的(參見美國專利5，693，622、5，589，466和5，580, 859)。也可以使用受體介導(dǎo)的DNA傳遞方法(Curiel etal.，1992，Hum. Gene Ther. 3:147-154 ;和 Wu 和 Wu, 1987，J. Biol. Chem. 262:4429-4432)。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”是指細(xì)胞攝取外源或異源RNA或DNA。當(dāng)外源或異源RNA或DNA已被引入細(xì)胞內(nèi)時，該細(xì)胞便被這樣的RNA或DNA “轉(zhuǎn)染”。當(dāng)轉(zhuǎn)染的RNA或DNA影響表型變化時，該細(xì)胞便被外源或異源RNA或DNA “轉(zhuǎn)化”。轉(zhuǎn)化RNA或DNA可以被整合入(共價連接入)構(gòu)成細(xì)胞基因組的染色體DNA?！稗D(zhuǎn)化”是指將核酸片段轉(zhuǎn)移入宿主生物的基因組，產(chǎn)生遺傳上穩(wěn)定的遺傳。含有轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主生物稱為“轉(zhuǎn)基因”或“重組”或“轉(zhuǎn)化的”生物。術(shù)語“遺傳區(qū)域”將指包含編碼多肽的基因的核酸分子區(qū)域或核苷酸序列。 此外，包含本發(fā)明的多核苷酸的重組載體可以包括一個或多個用于在細(xì)胞宿主中復(fù)制的起點(在該細(xì)胞宿主中謀求多核苷酸的擴增或表達(dá))、標(biāo)記或選擇性標(biāo)記。術(shù)語“選擇性標(biāo)記”是指鑒定性因子，通常是抗生素或化學(xué)品抗性基因、比色標(biāo)記、酶、熒光標(biāo)記和類似物，其中抗性基因能夠基于標(biāo)記基因的效應(yīng)，即對抗生素的抗性、對除草劑的抗性進行選擇，其中，所述效應(yīng)被用于追蹤感興趣的核酸的遺傳性，和/或鑒定遺傳有感興趣的核酸的細(xì)胞或生物。本技術(shù)領(lǐng)域已知并被使用的選擇性標(biāo)記基因的例子包括提供對氨芐青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、潮霉素、雙丙氨磷除草劑、磺胺和類似物的抗性的基因；用作表型標(biāo)記的基因，即花色素苷調(diào)控基因、異戊烯轉(zhuǎn)移酶基因和類似物。術(shù)語“報道基因”是指編碼能夠基于該報道基因的效應(yīng)而被鑒定的鑒定性因子的核酸，其中所述效應(yīng)被用于追蹤感興趣的核酸的遺傳性，鑒定遺傳有感興趣的核酸的細(xì)胞或生物，和/或測定基因表達(dá)誘導(dǎo)或轉(zhuǎn)錄。本技術(shù)領(lǐng)域已知并被使用的報道基因的例子包括熒光素酶(Luc)、綠色熒光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶(CAT)、β_半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡糖醛酸酶(Gus)和類似物。選擇性標(biāo)記基因也可以考慮用作報道基因?！皢幼印笔侵改軌蚩刂凭幋a序列或功能性RNA的表達(dá)的DNA序列。一般而言，編碼序列位于啟動子序列的3’端。啟動子可以整體源自天然基因，或由源自天然發(fā)現(xiàn)的不同啟動子的不同元件組成，或甚至包括合成的DNA片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，不同的啟動子可以指導(dǎo)基因在不同的組織或細(xì)胞類型中，或在發(fā)育的不同階段，或應(yīng)答于不同的環(huán)境或生理條件進行表達(dá)。導(dǎo)致基因在大多數(shù)細(xì)胞類型中在大多數(shù)的時間被表達(dá)的啟動子通常稱為“組成型啟動子”。導(dǎo)致基因在特定的細(xì)胞類型中被表達(dá)的啟動子通常稱為“細(xì)胞特異性啟動子”或“組織特異性啟動子”。導(dǎo)致基因在特定的發(fā)育或細(xì)胞分化階段被表達(dá)的啟動子通常稱為“發(fā)育特異性啟動子”或“細(xì)胞分化特異性啟動子”。在將細(xì)胞暴露于誘導(dǎo)啟動子的藥劑、生物分子、化學(xué)品、配體、光或類似物，或用這些物質(zhì)對細(xì)胞進行處理之后，被誘導(dǎo)并導(dǎo)致基因被表達(dá)的啟動子通常被稱為“誘導(dǎo)型啟動子”或“調(diào)控型啟動子”。還應(yīng)該認(rèn)識的是，因為在大多數(shù)情況下，調(diào)控序列的準(zhǔn)確界限還沒有完全限定，所以不同長度的DNA片段可能具有相同的啟動子活性。“啟動子序列”是能夠結(jié)合細(xì)胞中RNA聚合酶，并啟動下游(3’方向)編碼序列的轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)控區(qū)域。為了定義本發(fā)明的目的，啟動子序列的范圍被界定為其3’端至轉(zhuǎn)錄起始位點，并向上游(5’方向)延伸，包括以高于背景的可檢測水平啟動轉(zhuǎn)錄所必需的最小數(shù)目的堿基或元件。在啟動子序列內(nèi)，將發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始位點(該位點例如可以通過用核酸酶SI作圖方便地確定)和負(fù)責(zé)結(jié)合RNA聚合酶的蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(共有序列)。當(dāng)RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后mRNA進行反式RNA剪接(如果該編碼序列含有內(nèi)含子的話)，并翻譯成由該編碼序列編碼的蛋白時，該編碼序列便在細(xì)胞中處于轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列的“控制之下”。“轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列”是DNA調(diào)控序列，例如啟動子、增強子、終止子、和類似物，其使得編碼序列能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)。在真核細(xì)胞中，多腺苷酸化信號是控制序列。術(shù)語“應(yīng)答元件”是指一個或多個順式作用DNA元件，其賦予啟動子通過與第一嵌合基因的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的相互作用介導(dǎo)的應(yīng)答性。該DNA元件可以在其序列中具有回文結(jié)構(gòu)(精確的或不精確的)，或由被可變數(shù)目的核苷酸隔開的序列基序或半位點組成。半位點可以是相似的或相同的，并以同向重復(fù)或反向重復(fù)排列，或以單個半位點或相鄰半 位點串聯(lián)形成的多聚體排列。取決于應(yīng)答元件將要被整合入的細(xì)胞或生物的屬性，該應(yīng)答元件可以包含分離自不同生物的最小的啟動子。在配體存在或不存在的情況下，第一雜合蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合應(yīng)答元件的DNA序列，從而在該應(yīng)答元件的調(diào)控下啟動或抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄。天然蛻皮激素受體的應(yīng)答元件的DNA序列的例子包括RRGG/TTCANTGAC/ACYY(參見 Cherbas L. , et. al. , (1991), Genes Dev. 5, 120-131) ;AGGTCAN(n)AGGTCA，其中N(n)可以是一個或多個間隔核苷酸(參見D’Avino PP. , et. al. , (1995), Mol. Cell.Endocrinol, 113，1-9);和 GGGTTGAATGAATTT(參見 Antoniewski C.，et. al.，(1994). Mol.Cell Biol.14，4465-4474)。術(shù)語“可操作性連接”是指核酸序列連接在單個核酸片段上，從而一條核酸序列的功能受到其他核酸序列的影響。例如，當(dāng)啟動子能夠影響編碼序列的表達(dá)時(即，編碼序列在啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下)，則啟動子可操作性地與編碼序列連接。編碼序列可以以有義或反義方向與調(diào)控序列可操作性地連接。如本文中所用，術(shù)語“表達(dá)”是指來自核酸或多核苷酸的有義(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積聚。表達(dá)也可以指mRNA翻譯成蛋白或多肽。術(shù)語“盒”、“表達(dá)盒”和“基因表達(dá)盒”是指可以在特定的限制性位點或通過同源重組插入核酸或多核苷酸的DNA片段。DNA片段包含編碼感興趣的多肽的多核苷酸，該盒和限制性位點經(jīng)過設(shè)計以確保能夠?qū)⒃摵胁迦胝_的轉(zhuǎn)錄和翻譯閱讀框?！稗D(zhuǎn)化盒”是指包含編碼感興趣的多肽的多核苷酸并且除了所述多核苷酸外還具有幫助轉(zhuǎn)化特定宿主細(xì)胞的元件的特定載體。本發(fā)明的盒、表達(dá)盒、基因表達(dá)盒和轉(zhuǎn)化盒也可以包含增強編碼感興趣的多肽的多核苷酸在宿主細(xì)胞中的表達(dá)的元件。這些元件可以包括但不限于啟動子、最小啟動子、增強子、應(yīng)答元件、終止子序列、多腺苷酸化序列和類似元件。術(shù)語“調(diào)節(jié)”是指誘導(dǎo)、減少或抑制核酸或基因表達(dá)，分別導(dǎo)致蛋白或多肽生產(chǎn)的誘導(dǎo)、減少或抑制。本發(fā)明的質(zhì)粒或載體還可以包含適于驅(qū)使基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的至少一個啟動子。術(shù)語“表達(dá)載體”是指被設(shè)計成使得插入的核酸序列在轉(zhuǎn)化入宿主后能夠表達(dá)的載體、質(zhì)?；蛎浇?。克隆的基因，即，插入的核酸序列，通常被置于控制元件例如啟動子、最小啟動子、增強子或類似控制元件的控制之下。啟動控制區(qū)域或啟動子可用于驅(qū)使核酸在期望的宿主細(xì)胞中表達(dá)，它們數(shù)量眾多，并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉。事實上，能夠驅(qū)動這些基因的任何啟動子都適合于本發(fā)明，包括但不限于病毒啟動子、細(xì)菌啟動子、動物啟動子、哺乳動物啟動子、合成啟動子、組成型啟動子、組織特異性啟動子、發(fā)育特異性啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、光調(diào)控啟動子；CYC1、HIS3、GAL1、GAL4、GAL10、ADH1、PGK、PH05、GAPDH、ADC1、TRPU URA3、LEU2、ENO, TP1、堿性磷酸酶啟動子(用于在酵母屬(Saccharomyces)中的表達(dá))；A0X1啟動子(用于在畢赤酵母(Pichia)中的表達(dá))；β_內(nèi)酰胺酶、lac、ara、tet、trp、lPL、lPR、T4、tac和trc啟動子(用于在大腸桿菌(Escherichia coli)中的表達(dá))；光調(diào)控的、種子特異性的、花粉特異性的、子房特異性的、發(fā)病機理或疾病相關(guān)的、花椰菜花葉病毒35S、CMV 35S最小、木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)、葉綠素a/b結(jié)合蛋白、核酮糖1，5- 二磷酸羧化酶、芽枝特異性的、根特異性的、幾丁質(zhì)酶、應(yīng)激誘導(dǎo)型的、水稻東格魯桿狀病毒、植物超級啟動子(plant super-promoter)、馬鈴薯亮氨酸氨肽酶、硝酸鹽還原酶、甘露氨酸合成酶、胭脂氨酸合成酶、泛蛋白、玉米醇溶蛋白和花色苷啟動子(用于在植物細(xì)胞中的表達(dá))；本領(lǐng)域已知的動物和哺乳動物啟動子包括但不限于SV40早期(SV40e)啟動子區(qū)域、包含在勞斯肉瘤病毒(RSV)的3’長末端重復(fù)(LTR)中的啟動子、腺病毒(Ad)的ElA或主要晚期啟動子(MLP)基因的啟動子、巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動子、單純皰疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)啟動子、桿狀病毒IEl啟動子、延伸因子I a (EFl)啟動子、磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子、泛蛋白(Ubc)啟動子、白蛋白啟動子、小鼠金屬硫蛋白的調(diào)控序列L啟動子和轉(zhuǎn)錄控制區(qū)、遍在啟動子(HPRT、波形蛋白、α -肌動蛋白、微管蛋白和類似物)、中間纖維的啟動子(結(jié)蛋白、神經(jīng)纖絲蛋白、角蛋白、GFAP和類似物)、治療性基因的啟動子(MDR、CFTR或VIII類因子和類似物的啟動子)、發(fā)病或疾病相關(guān)啟動子，以及顯示出組織特異性并已用于轉(zhuǎn)基因動物的啟動子，例如在胰腺腺泡細(xì)胞中具有活性的彈性蛋白酶I基因控制區(qū)；在胰腺β細(xì)胞中具有活性的胰島素基因控制區(qū)；在淋巴細(xì)胞中具有活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)；在睪丸、乳房、淋巴和肥大細(xì)胞中具有活性的小鼠乳腺腫瘤病毒控制區(qū)域；在肝臟中具有活性的白蛋白基因、Apo Al和Apo AII控制區(qū)；在肝臟中具有活性的α-甲胎蛋白基因控制區(qū)；在肝臟中具有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制區(qū)；在骨髓細(xì)胞中具有活性的β_球蛋白基因控制區(qū)；在腦的少突膠質(zhì)細(xì)胞中具有活性的髓磷脂堿蛋白基因控制區(qū)；在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(qū)，以及在下丘腦中具有活性的促性腺激素釋放激素基因控制區(qū)，丙酮酸激酶啟動子，絨毛蛋白啟動子，脂肪酸結(jié)合腸蛋白的啟動子，平滑肌細(xì)胞α-肌動蛋白的啟動子和類似物。此外，通過加入增強子或調(diào)控序列和類似物,這些表達(dá)序列可以被修飾。可以用于本發(fā)明的實施方案的增強子包括但不限于SV40增強子、巨細(xì)胞病毒(CMV)增強子、延伸因子I(EFl)增強子、酵母增強子、病毒基因增強子和類似物。終止控制區(qū)，S卩，終止子或多腺苷酸化序列，也可以來自對于優(yōu)選的宿主而言為天然的各種基因?？蛇x地，終止位點并非必需，然而，最優(yōu)選的情況是包括終止位點。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，終止控制區(qū)域可以包括或來自合成序列、合成的多腺苷酸化信號、SV40晚期多腺苷酸化信號、SV40多腺苷酸化信號、牛生長激素(BGH)多腺苷酸化信號、病毒終止子序列或類似物。術(shù)語“3’非編碼序列”或“3’非翻譯區(qū)(UTR) ”是指位于編碼序列下游(3’) 的DNA序列，并且可以包含多腺苷酸化[多(A)]識別序列和編碼能夠影響mRNA加工或基因表達(dá)的調(diào)控信號的其他序列。多腺苷酸化信號通常是通過以將多腺苷酸序列段加入到mRNA前體的3’末端為特征?！罢{(diào)控區(qū)域”是指調(diào)控第二核酸序列的表達(dá)的核酸序列。調(diào)控區(qū)域可以包括在自然情況下負(fù)責(zé)表達(dá)特定核酸的序列(同源區(qū)域)，或可以包括負(fù)責(zé)表達(dá)不同的蛋白或甚至合成蛋白的不同來源的序列(異源區(qū)域)。特別地，序列可以是以特異性或非特異性方式和以誘導(dǎo)型或非誘導(dǎo)型方式刺激或抑制基因轉(zhuǎn)錄的原核、真核或病毒基因序列或衍生的序列。調(diào)控區(qū)域包括復(fù)制起點、RNA剪接位點、啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄終止序列和指導(dǎo)多肽進入目標(biāo)細(xì)胞的分泌途徑的信號序列。“異源來源”的調(diào)控區(qū)域是與被表達(dá)的核酸并不天然連接的調(diào)控區(qū)域。異源調(diào)控區(qū)域包括來自不同種的調(diào)控區(qū)域、來自不同基因的調(diào)節(jié)區(qū)域、雜合調(diào)控序列和在天然情況下并不存在而是由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員設(shè)計出的調(diào)控區(qū)域。
“RNA轉(zhuǎn)錄物”是指經(jīng)RNA聚合酶催化由DNA序列轉(zhuǎn)錄而得的產(chǎn)物。當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄物是DNA序列的精確互補的拷貝時，它被稱為初級轉(zhuǎn)錄物，或者它可以是對初級轉(zhuǎn)錄物進行轉(zhuǎn)錄后加工所產(chǎn)生的RNA序列，這被稱為成熟RNA?！靶攀筊NA (mRNA) ”是指無內(nèi)含子、并可以被細(xì)胞翻譯成蛋白的RNA。“cDNA”是指與mRNA互補并源自mRNA的雙鏈DNA。“有義”RNA是指包括mRNA并因此可以被細(xì)胞翻譯成蛋白的RNA轉(zhuǎn)錄物?！胺戳xRNA”是指與目標(biāo)初級轉(zhuǎn)錄物或mRNA的全部或部分互補并且阻斷目標(biāo)基因表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄物。反義RNA的互補性可以在特定的基因轉(zhuǎn)錄物的任何部分，即，在5’非編碼序列、3’非編碼序列或編碼序列?！肮δ躌NA”是指反義RNA、核酶RNA或不被翻譯但對細(xì)胞過程有影響的其他RNA?！岸嚯摹笔怯晒矁r連接的氨基酸殘基組成的聚合化合物。氨基酸具有下述通用結(jié)構(gòu)
H
R-^-CQOE
I
Wa根據(jù)側(cè)鏈R，氨基酸被分為七組(I)脂肪族側(cè)鏈，(2)含有羥基(OR)基團的側(cè)鏈，
(3)含有硫原子的側(cè)鏈，(4)含有酸性基團或酰胺基團的側(cè)鏈，(5)含有堿性基團的側(cè)鏈，
(6)含有芳香環(huán)的側(cè)鏈，和(7)脯氨酸，一種側(cè)鏈與氨基基團稠合的亞氨酸。本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含至少大約14個氨基酸。“蛋白質(zhì)”是在活細(xì)胞中發(fā)揮結(jié)構(gòu)或功能作用的多肽。“分離的多肽”或“分離的蛋白”是基本上沒有那些在其天然狀態(tài)下通常與其相隨的化合物(例如，其他蛋白或多肽、核酸、碳水化合物、脂類)的多肽或蛋白?！胺蛛x的”并不旨在排除與其他化合物形成的人工或合成的混合物，或并不排除存在有不干擾生物活性以及例如因不徹底的純化、加入穩(wěn)定劑或混合形成藥學(xué)上可接受的制劑而可能存在的雜質(zhì)。多肽或蛋白的“變體”是源自多肽或蛋白并保留該多肽或蛋白的至少一種生物學(xué)特性的任何類似物、片段、衍生物或突變體。多肽或蛋白的不同變體可以存在于自然界中。這些變體可以是由編碼蛋白的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列中的差異表征的等位基因突變體，或可以涉及差異性剪接或翻譯后修飾。技術(shù)人員可以制備具有單個或多個氨基酸置換、刪除、添加或替代的變體。這些變體可以包括(a)其中一個或多個氨基酸殘基被保守的或非保守的氨基酸置換的變體；(b)其中一個或多個氨基酸被加入到多肽或蛋白的變體；(C)其中一個或多個氨基酸包括取代基團的變體；和(d)其中多肽或蛋白與另一多肽例如血清白蛋白融合的變體；等等。獲得這些變體的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知曉的，包括遺傳技術(shù)(抑制、剔除、突變等)、化學(xué)技術(shù)和酶技術(shù)?！爱愒吹鞍住笔侵覆⒎羌?xì)胞天然產(chǎn)生的蛋白?！俺墒斓鞍住笔侵阜g后加工得到的多肽，S卩，初級翻譯產(chǎn)物中存在的任何前肽或肽原已從其中被去除的一種多肽?！扒绑w”蛋白是指mRNA的初級翻譯產(chǎn)物；即，前肽和肽原依然存在。前肽和肽原可以是但不限于胞內(nèi)定位信號。術(shù)語“信號肽”是指分泌的成熟蛋白前面的 氨基端多肽。信號肽與成熟蛋白割裂開，因此成熟蛋白中沒有信號肽。信號肽具有將分泌的蛋白引導(dǎo)并轉(zhuǎn)運通過細(xì)胞膜的功能。信號肽也稱作信號蛋白?！靶盘栃蛄小北话ㄔ趯⒈槐磉_(dá)在細(xì)胞表面的蛋白的編碼序列的開始位置。該序列編碼成熟多肽的N-端的信號肽，信號肽指導(dǎo)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)運多肽。術(shù)語“轉(zhuǎn)運信號序列”在此用來指代這類信號序列?？梢园l(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)運信號序列與真核和原核細(xì)胞中天然的各種蛋白相聯(lián)系，并常常在兩類生物中具有功能。術(shù)語“同源性”是指兩個多核苷酸或兩個多肽部分之間的同一性百分比。利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)可以測定一個部分與另一部分的序列之間的對應(yīng)性。例如，通過比對序列信息并使用容易獲取的計算機程序，對兩個多肽分子之間的序列信息直接進行比較，可以確定同源性。作為選擇，通過在同源區(qū)域之間形成穩(wěn)定的雙鏈體的條件下對多核苷酸進行雜交，然后用單鏈特異性核酸酶消化并測定消化的片段的大小，可以確定同源性。如在此所使用，術(shù)語“同源”所有的語法形式和拼寫變化形式是指擁有“共同進化起源”的蛋白之間的關(guān)系，包括來自超家族(例如免疫球蛋白超家族)的蛋白和來自不同種的同源蛋白(例如肌球蛋白輕鏈等)(Reeck et al.，1987，Cell 50:667·)。這樣的蛋白(和它們的編碼基因)具有序列同源性，正如它們高度的序列相似性所反映。然而，在通常的用法和本申請中，當(dāng)用副詞例如“高度的”來修飾術(shù)語“同源”時，該術(shù)語可以指序列相似性而不是共同的進化起源。因此，術(shù)語“序列相似性”所有的語法形式是指可以或不必享有共同進化起源的蛋白的核酸或氨基酸序列之間的同一性或?qū)?yīng)性程度(參見Reeck et al.，1987，Cell50:667)。在特定的實施方案中，當(dāng)在限定長度的DNA序列范圍內(nèi)，有至少大約50% (優(yōu)選至少大約75%、最優(yōu)選地至少大約90或95%)的核苷酸匹配時，這兩個DNA序列“實質(zhì)上同源”或“實質(zhì)上相似”。通過使用可從序列數(shù)據(jù)庫中獲取的標(biāo)準(zhǔn)軟件進行序列比較，或在例如針對特定系統(tǒng)所限定的嚴(yán)格條件下進行的Southern雜交試驗中，可以鑒定基本上同源的序列。限定合適的雜交條件是在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍之內(nèi)。參見Sambrook et al.，1989，上文。如本文所使用地，術(shù)語“實質(zhì)上相似”是指這樣的核酸片段，其中一個或多個核苷酸堿基的變化導(dǎo)致一個或多個氨基酸的置換，但是并不影響由該DNA序列編碼的蛋白的功能特性。“實質(zhì)上相似”同樣指這樣的核酸片段，其中一個或多個核苷酸堿基的變化并不影響該核酸片段通過反義或共抑制技術(shù)介導(dǎo)改變基因表達(dá)的能力?！皩嵸|(zhì)上相似”也指對本發(fā)明的核酸片段進行的修飾，例如刪除或插入一個或多個核苷酸堿基，這并不實質(zhì)上影響到所得轉(zhuǎn)錄物的功能特性。因此可以理解的是，本發(fā)明所包含的不僅僅是這些特定的示例性序列。各種提議的修飾都完全在本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)的范圍內(nèi)，測定被編碼的產(chǎn)物的生物學(xué)活性的保留也是如此。此外，技術(shù)人員認(rèn)識到本發(fā)明所包含的實質(zhì)上相似的序列也由它們在嚴(yán)格條件(O. 1XSSC,0. 1%SDS，65°C 和用 2 X SSC, O. 1%SDS 洗滌，再用 O.1 X SSC, O. 1%SDS 洗滌)下與在此示例的序列的雜交能力來限定。本發(fā)明的實質(zhì)上相似的核酸片段是那些其DNA序列與在此報告的核酸片段的DNA序列具有至少70%同一性的核酸片段。本發(fā)明的優(yōu)選的實質(zhì)上相似的核酸片段是那些其DNA序列與在此報告的核酸片段的DNA序列具有至少80%同一性的核酸片段。更優(yōu)選的核酸片段與在此報告的核酸片段的DNA序列具有至少90%同一性。甚至更優(yōu)選的是與在此報告的核酸片段的DNA序列具有至少95%同一性的核酸片段。當(dāng)大約40%以上的氨基酸相同，或60%以上氨基酸相似(功能上相同)時，這兩個氨基酸序列是“實質(zhì)上同源”或“實質(zhì)上相似”。優(yōu)選地，通過使用例如GCG(GenetiCS ComputerGroup, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin)堆積程序進行比對，鑒定相似或同源的序列。
術(shù)語“對應(yīng)于”用于本文是指相似的或同源的序列，無論該確切的位置與同其進行相似性或同源性測量的分子相同或不同。核酸或氨基酸序列比對可以包括空位。因此，術(shù)語“對應(yīng)于”是指序列相似性，而不是氨基酸殘基或核苷酸堿基的編號。氨基酸或核苷酸序列的“實質(zhì)部分”包括多肽足夠的氨基酸序列或基因足夠的核苷酸序列，從而足以推測性地鑒定那個多肽或基因，這通過本領(lǐng)域技術(shù)人員對序列進行手工評價來進行,或者通過使用算法諸如BLAST (Basic Local Alignment Search Tool ；Altschul, S. F. , et al. , (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410 ;也參見www. ncb1. nlm. nih. gov/BLAST/)進行計算機自動化序列比較和鑒定來進行。一般而言，為了推測性地鑒定與已知的蛋白或基因同源的多肽或核酸序列，10個或更多個連續(xù)氨基酸或30個或更多個核苷酸的序列是必需的。而且，對于核苷酸序列，包含20-30個連續(xù)核苷酸的基因特異性寡核苷酸探針可以用于序列依賴性的基因鑒定方法(例如Southern雜交)和基因分離方法(例如細(xì)菌菌落或噬菌體噬菌斑的原位雜交)。此外，12-15個堿基的短的寡核苷酸可以用作PCR的擴增引物，以便獲得包含所述引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“實質(zhì)部分”包含足夠的序列，足以特異性地鑒定和/或分離包含該序列的核酸片段。如本領(lǐng)域所知道的，術(shù)語“同一性百分比”是指兩條或更多多肽序列之間或兩條或更多多核苷酸序列之間的關(guān)系，正如通過比較序列所確定的。在該技術(shù)領(lǐng)域，“同一性”也指多肽或多核苷酸序列之間的序列相關(guān)性程度，這種情況時，可以通過這些序列的鏈之間的匹配來測定?！巴恍浴焙汀跋嗨菩浴笨梢杂靡阎姆椒ㄈ菀椎赜嬎?，包括但不限于描述于下述文獻(xiàn)中的方法Computational Molecular Biology (Lesk, A. Μ. , ed. ) Oxford UniversityPress, New York(1988) ；Biocomputing:1nformatics and Genome Projects(Smith, D.ff. , ed. ) Academic Press, New York(1993) ；Computer Analysis of Sequence Data,PartI(Griffin, A. M.和 Griffin, H. G.，eds. ) Humana Press, New Jersey (1994) ；SequenceAnalysis in Molecular Biology (von Heinje, G.，ed. ) Academic Press (1987)；和Sequence Analysis Primer(Gribskov, M.和 Devereux, J.，eds. ) Stockton Press, NewYork(1991) 0測定同一性的優(yōu)選方法被設(shè)計以便得到測試序列之間的最佳匹配。測定同一性和相似性的方法編入公開可獲得的計算機程序中?？梢詰?yīng)用LASERGENE bioinformaticscomputing suite 的Megalign 程序(DNASTAR Inc. ,Madison, WI)進行序列比對并計算同一性百分比?？梢詰?yīng)用帶有默認(rèn)參數(shù)(GAP PENALTY= I O, GAP LENGTH PENALTY= 10)的Clustal比對方法(Higgins和Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153)進行多序列比對。使用Clustal方法的配對比對的默認(rèn)參數(shù)可以被選擇KTUPLE 1，GAP PENALTY=3，WIND0W=5和DIAGONALSSAVED=50術(shù)語“序列分析軟件”是指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何計算機算法或軟件程序?！靶蛄蟹治鲕浖笨梢酝ㄟ^商業(yè)途經(jīng)獲得或獨立開發(fā)。典型的序列分析軟件將包括但不限于GCG程序組(Wisconsin Package Version 9. O, GeneticsComputer Group (GCG)，Madison, WI)、BLASTP, BLASTN、BLASTX (Altschul et al.，J. Mol.Biol.215:403-410(1990)和 DNASTAR(DNASTAR, Inc. 1228S. Park St. Madison, WI 53715USA)。在本申請的上下文中，應(yīng)該理解，當(dāng)序列分析軟件用于分析時，分析的結(jié)果將基于所參考的程序的“默認(rèn)值”，除非另外指出。如本文中所使用的，“默認(rèn)值”指當(dāng)?shù)谝淮晤A(yù)置時軟件最初加載的任何一組值或參數(shù)。
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“合成基因”可以由使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的程序化學(xué)合成的寡核苷酸構(gòu)建模塊裝配而成。這些構(gòu)建模塊被連接起來并退火，從而形成基因片段，然后將基因片段酶法裝配以構(gòu)建整個基因?！盎瘜W(xué)合成”，當(dāng)涉及DNA序列時，是指核苷酸組分在體外被裝配。使用充分建立的程序可以完成DNA的人工化學(xué)合成，或者使用許多商業(yè)上可得的機器中的一種可以進行自動化化學(xué)合成。因此，基于為了反映出宿主細(xì)胞的密碼子偏愛性的核苷酸序列優(yōu)化，基因可以被修改以獲得最佳的基因表達(dá)。如果使密碼子使用偏向于宿主所喜好的那些密碼子，技術(shù)人員將有可能成功地進行基因表達(dá)?；趯碜孕蛄行畔⒖色@得的宿主細(xì)胞的基因的調(diào)查，可以確定優(yōu)選的密碼子。
本發(fā)明本發(fā)明提供用于在真核細(xì)胞中獲得位點特異性重組的組合物和方法。更具體地，本發(fā)明利用原核重組酶，諸如單向性的噬菌體重組酶，原因是它們能夠催化兩互補重組位點之間的重組，但是不能催化由該重組形成的雜合位點之間的重組。本發(fā)明鑒定了新型重組酶，每一個重組酶僅僅介導(dǎo)細(xì)菌附著位點(attB)和噬菌體附著位點(attP)之間的重組。重組酶不能介導(dǎo)attL和attR雜合位點之間的重組,該雜合位點在attB和attP之間形成重組之時形成。因為重組酶諸如這些重組酶不能單獨催化倒位反應(yīng)，所以attB和attP重組是穩(wěn)定的。該特性是這樣的，其使得本發(fā)明的組合物和方法與現(xiàn)用于真核細(xì)胞的其他重組系統(tǒng)區(qū)別開來，諸如Cre-1ox或FLP-FRT系統(tǒng)，在這系統(tǒng)中，重組反應(yīng)是可逆的。本發(fā)明重組系統(tǒng)的運用為在真核細(xì)胞中指導(dǎo)穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因和染色體重排提供了新的機會。本發(fā)明的方法涉及將真核細(xì)胞中存在的一對重組附著位點attB和attP與相應(yīng)的重組酶接觸。重組酶然后介導(dǎo)重組附著位點之間的重組。取決于重組附著位點的相對位置，重組的結(jié)果是，可能發(fā)生許多事件中的任一事件。例如，如果重組附著位點存在于不同的核酸分子上，重組可能導(dǎo)致一個核酸分子整合入第二個分子中。因此，我們能夠?qū)⒑幸粋€重組位點的質(zhì)粒整合入包含相應(yīng)的重組位點的真核細(xì)胞染色體中。因為在本發(fā)明方法中使用的重組酶不能催化逆反應(yīng)，所以整合是穩(wěn)定的。這樣的方法例如可用于獲得在質(zhì)粒中存在的轉(zhuǎn)基因向真核染色體的穩(wěn)定整合。
重組附著位點也可以在相同的核酸分子中存在。在這種情況下，獲得的產(chǎn)物典型地依賴于附著位點的相對方向。例如，在平行或直接方向上的位點之間的重組，一般將導(dǎo)致位于重組附著位點之間的任何DNA的切除。反之，相反方向的附著位點之間的重組能夠?qū)е麻g插DNA的倒位。同樣地，獲得的重排核酸是穩(wěn)定的，原因是在不存在其他因子或許多因子時，重組是不可逆的，所述因子通常由特定的噬菌體編碼和/或由噬菌體的宿主細(xì)胞編碼，重組酶由噬菌體的宿主細(xì)胞衍生而得，其通常未見于真核細(xì)胞。本方法有用的一個應(yīng)用例子涉及在重組附著位點之間安置啟動子。如果啟動子最初處于與待被啟動子表達(dá)的編碼序列相反的方向，啟動子側(cè)翼的重組位點在反方向上，通過接觸重組附著位·點將導(dǎo)致啟動子倒位，從而將啟動子置于正確的方向，以驅(qū)動編碼序列的表達(dá)。類似地，如果啟動子最初處于用于表達(dá)的正確方向，重組附著位點在相同方向上，通過將重組附著位點與重組酶接觸，能夠?qū)е聠幼悠吻谐瑥亩K止編碼序列的表達(dá)。本發(fā)明的方法也可用于獲得染色體的易位。例如,在這些實施方式中，一個重組附著位點置于染色體上，第二重組附著位點置于第二染色體上，第二重組附著位點充當(dāng)與第一重組附著位點重組的底物。一旦重組附著位點與重組酶接觸之后,重組發(fā)生,從而導(dǎo)致兩染色體臂的交換。例如，可以構(gòu)建生物體的兩個菌株，其中一個菌株包含第一重組附著位點，第二個菌株含有第二重組附著位點。兩個菌株然后可以雜交，以獲得包含兩個重組附著位點的子代菌株。一旦將附著位點與重組酶接觸，發(fā)生染色體臂交換。
重組酶在引入靶向載體之前、同時或之后，本發(fā)明實踐中使用的重組酶可以被引入目標(biāo)細(xì)胞。例如使用脂質(zhì)體、包被顆?；蝻@微注射，重組酶可以作為蛋白質(zhì)直接引入細(xì)胞中。作為選擇，使用合適的表達(dá)載體，編碼重組酶的多核苷酸一或者DNA或信使RNA可以引入細(xì)胞中。上述的靶向載體組分可用于構(gòu)建含有編碼感興趣重組酶的序列的表達(dá)盒。然而，重組酶的表達(dá)可以用其他方式調(diào)節(jié)，例如將重組酶的表達(dá)置于可調(diào)節(jié)啟動子(即，其表達(dá)可以被選擇性誘導(dǎo)或抑制的啟動子)的控制之下。如前所述，在本發(fā)明實踐中使用的重組酶可以重組產(chǎn)生或純化。具有期望的重組酶活性的多肽可以被純化至期望的純度，這通過蛋白質(zhì)硫酸銨沉淀、純化領(lǐng)域已知的方法進行，包括但不限于大小分級、親合層析、HPLC、離子交換層析、肝素瓊脂糖親合層析(例如，Thorpe & Smith, Proc. Nat. Acad. Sc1. 95:5505-5510, 1998)。本發(fā)明的重組酶多肽和編碼重組酶多肽的核酸描述在實施例1中，并可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的常規(guī)方法獲得。在優(yōu)選的實施方式中，重組酶是分離的多核苷酸序列，其包括與選自 SEQ ID NO:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7 和 SEQ ID NO:9 的核酸序列具有至少90%同一性的核酸，其中所述核酸具有重組酶活性。更優(yōu)選地，重組酶是分離的多核苷酸序列，包括選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID N0:9的核酸序列。甚至更優(yōu)選地，重組酶是分離的多核苷酸序列，包括編碼選自SP^ c2重組酶、SF370.1重組酶、Bxbl重組酶、Al 18重組酶和(J)Rvl重組酶的核酸序列。重組酶可以被引入含有重組附著位點的真核細(xì)胞，在該重組附著位點，重組是任何合適的方法所期望的。例如通過顯微注射或其他方法將功能蛋白質(zhì)引入細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的。純化的重組酶蛋白質(zhì)的引入確保蛋白質(zhì)及其功能的瞬時存在，這常常是優(yōu)選的實施方式。作為選擇，編碼重組酶的基因可以包含在用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的表達(dá)載體中，在該細(xì)胞中，所述編碼重組酶的多核苷酸被可操縱性地連接至介導(dǎo)多核苷酸在真核細(xì)胞中表達(dá)的啟動子。通過編碼重組酶多肽的信使RNA，重組酶多肽也可以引入真核細(xì)胞。一般優(yōu)選地，重組酶僅僅在這樣的時間段存在，即將核酸片段插入正被修飾的基因組所必需的時間。因此，與大部分表達(dá)載體有關(guān)的持久性的缺乏并不預(yù)期是有害的。在導(dǎo)入感興趣的外源多核苷酸之前、之后或同時，可以將重組酶引入細(xì)胞。在一個實施方式中，重組酶基因在載有待被插入的多核苷酸的載體內(nèi)存在；重組酶基因甚至可以包含在多核苷酸內(nèi)。在其他實施方式中，重組酶基因被導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因真核生物，例如轉(zhuǎn)基因植物、動物、真菌或類似生物中，其然后與含有相應(yīng)的重組位點的生物雜交?？梢灾苽滢D(zhuǎn)基因細(xì)胞或動物，其以組成型方式表達(dá)重組酶或在細(xì)胞特異性、組織特異性、發(fā)育特異性、細(xì)胞器特異性或小分子可誘導(dǎo)的或可抑制啟動子下在表達(dá)重組酶。重組酶作為可以與其他肽、蛋白質(zhì)、核酸定位信號肽、信號肽或細(xì)胞器-特異信號肽(例如，線粒體或葉綠體轉(zhuǎn)運肽，以幫助在線粒體或葉綠體中產(chǎn)生重組)形成融合蛋白的方式表達(dá)。在本發(fā)明的實施方式中，重組附著位點包含分離的多核苷酸序列，該分離的多核 苷酸序列包含與選自 SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ IDNO: 16,SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21 的核酸序列具有至少90%同一'丨生的核酸。優(yōu)選地，附著位點是分離的多核苷酸序列，包含選自SEQID NO:1USEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 17,SEQID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20 和 SEQ ID NO: 21 的核酸序列。
載體/構(gòu)建物本發(fā)明考慮的靶向構(gòu)建物可以含有其他核酸片段，諸如控制序列、標(biāo)記序列、選擇序列和類似物，如下所述。本發(fā)明也提供將感興趣的多核苷酸(或核酸序列(許多核酸序列))靶向插入基因組的方法，該方法例如如下進行(i)提供重組酶，其中所述重組酶能夠促進第一重組位點和第二重組位點之間的重組；(ii)提供具有第一重組序列和感興趣多核苷酸的靶向構(gòu)建物；(iii)將重組酶和靶向構(gòu)建物引入細(xì)胞中，該細(xì)胞的核酸中含有第二重組位點，其中所述引入步驟在在允許重組酶促進第一重組位點和第二重組位點之間的重組事件的條件下進行。本發(fā)明也涉及用于將多核苷酸序列以位點特異性的方式整合入分離的真核細(xì)胞的基因組的載體，所述載體包含感興趣的多核苷酸和第二重組attB或attP位點，其中所述第二重組attB或attP位點包含與所述分離的真核細(xì)胞的基因組中的第一重組attP或attB位點或假attP或假attB位點重組的多核苷酸序列，所述重組在位點特異性重組酶存在下發(fā)生，所述位點特異性重組酶選自單核細(xì)胞增生李斯特氏菌噬菌體重組酶、化膿性鏈球菌噬菌體重組酶、枯草芽孢桿菌噬菌體重組酶、結(jié)核分枝桿菌噬菌體重組酶、恥垢分枝桿菌曬菌體重組酶，條件是當(dāng)?shù)谝恢亟M位點是attB或假attB時,第二重組位點是attP,當(dāng)?shù)谝恢亟M位點是attP或假attP時,第二重組位點是attB。優(yōu)選地,重組酶選自Al 18重組酶、SF370.1重組酶、SP β c2重組酶、Φ Rvl重組酶和Bxbl重組酶。感興趣的多核苷酸可以包括但不限于編碼多肽產(chǎn)物的表達(dá)盒。尋靶構(gòu)建物可以是環(huán)狀的或線性的，也可以含有選擇性標(biāo)記，復(fù)制起點和其他元件。各種表達(dá)載體適合用于本發(fā)明的實踐，不但適合用于原核生物也適合用于真核生物?？傊邢驑?gòu)建物將具有一個或多個下述特征啟動子、啟動子-增強子序列、選擇標(biāo)記序列、復(fù)制起點、可誘導(dǎo)元件序列、表位-標(biāo)記序列和類似物。啟動子和啟動子-增強子序列是RNA聚合酶與之結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄的DNA序列。通過指定哪一條鏈將被轉(zhuǎn)錄，啟動子決定轉(zhuǎn)錄子的極性。細(xì)菌啟動子由共有序列、與轉(zhuǎn)錄起始相對的-35和-10核苷酸組成，它們被特異性的σ因子和RNA聚合酶結(jié)合。真核啟動子更復(fù)雜。在表達(dá)載體中使用的大部分啟動子由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄。通用轉(zhuǎn)錄因子(Generaltranscription factors (GTFS))首先結(jié)合起點附近的特異性序列，然后募集RNA聚合酶II的結(jié)合。除了這些最基本的啟動子元件之外，小序列元件被調(diào)節(jié)給定啟動子活性的模塊DNA-結(jié)合/反式作用蛋白質(zhì)(例如AP-1、SP-1)特異性識別。病毒啟動子發(fā)揮與細(xì)菌或真核啟動子相同的功能，或者提供特異性反式RNA聚合酶(噬菌體T7)，或募集細(xì)胞因子或RNA聚合酶(SV40、RSV、CMV)。優(yōu)選病毒啟動子，因為它們通常是特別強的啟動子。此外，啟動子可以是或者組成型的或者可調(diào)節(jié)的(即，可誘導(dǎo)的或可抑制的)。可 誘導(dǎo)元件是這樣的DNA序列元件，其與啟動子一起發(fā)揮作用并結(jié)合抑制物(例如，在大腸桿菌中的lacO/LAC Iq抑制物系統(tǒng))或誘導(dǎo)物(例如,在酵母中的gall/GAL4誘導(dǎo)物系統(tǒng))。在任一情況下，轉(zhuǎn)錄實質(zhì)上是“關(guān)閉的”，直到啟動子被抑制或被誘導(dǎo)，在這時轉(zhuǎn)錄被“開啟”。組成型啟動子的例子包括噬菌體λ的int啟動子、pBR322的β-內(nèi)酰胺酶基因序列的bla啟動子、pPR325的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因序列的CAT啟動子和類似啟動子。誘導(dǎo)型原核啟動子的例子包括噬菌體的主要右和左啟動子(P. sub. L和P. sub. R)，大腸桿菌(E. coli)的trp、reca、lacZ、AraC和gal啟動子,枯草芽孢桿菌的α _淀粉酶(Ulmanen Ett at. , J. Bacterid. 162:176-182, 1985)和 σ-28-特異性啟動子(Gilmanet al. , Gene sequence 32:11-20 (1984)),桿菌的卩遼菌體的啟動子(Gryczan, In:TheMolecular Biology ofthe Bacilli, Academic Press, Inc. , NY (1982)),鏈霉菌啟動子(Ward et at.，Mol. Gen. Genet. 203:468-478，1986)，和類似啟動子。GlickQ.1nd. Microtiot. 1:277-282, 1987) ；Cenatiempo(Biochimie 68:505-516,1986)；和Gottesman(Ann. Rev. Genet. 18:415-442, 1984)綜述了不例性的原核啟動子。優(yōu)選的真核啟動子包括但是不限于下述；小鼠金屬硫蛋白I基因序列的啟動子(Hamer et al. , J. Mol. Appl. Gen. 1:273-288，1982);皰疹病毒的 TK 啟動子(McKnight, Cell 31:355-365, 1982) ;SV40 早期啟動子(Benoist et al. , Nature(London) 290:304-310, 1981)；酵母 gall 基因序列啟動子(Johnston et al. , Proc.Natl. Acad. Sc1. (USA) 79 : 6971-6975，1982) ；Silver et al. , Proc. Natl. Acad. Sc1.(USA)81:5951-59SS, 1984)，CMV啟動子、EF-1啟動子、蛻皮激素-應(yīng)答性啟動子(許多啟動子)、四環(huán)素-應(yīng)答性啟動子，和類似啟動子。選擇在本發(fā)明中使用的示例性啟動子，以便它們在它們被引入的細(xì)胞類型(和/或動物或植物)中具有功能。選擇標(biāo)記在表達(dá)載體中是有價值的元件，因為它們提供了僅僅選擇那些含有載體的細(xì)胞的生長工具。這樣的標(biāo)記有兩種類型耐藥性標(biāo)記和營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記。耐藥性標(biāo)記使得細(xì)胞能夠?qū)ν庠醇尤氲乃幬锝舛荆駝t會殺死細(xì)胞。當(dāng)生長在缺少必要組分的培養(yǎng)基中時，營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記使得細(xì)胞能夠合成必要組分(通常是氨基酸)。常見的選擇性標(biāo)記基因包括那些對抗生素諸如氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素、博來霉素、鏈霉素、潮霉素、新霉素、Zeocin. TM.和類似物具有抗性的基因。選擇性營養(yǎng)缺陷型基因包括例如hisD，其允許在組氨醇存在時，能夠在無組氨酸的培養(yǎng)基中生長。在表達(dá)載體中有用的一個其他元件是復(fù)制起點。復(fù)制起點是含有多短重復(fù)序列的獨特DNA片段，它們被多聚起點-結(jié)合蛋白識別并在起點裝配DNA復(fù)制酶中發(fā)揮關(guān)鍵作用。用于本文中使用的表達(dá)載體的合適的復(fù)制起點包括大腸桿菌oriC,colEl質(zhì)粒起點,2 μ和ARS(兩者都用于酵母系統(tǒng))，sfl、SV40、EBV oriP(用于哺乳動物系統(tǒng))和類似起點。表位標(biāo)記是被表位特異性抗體識別的短肽序列。通過使用結(jié)合到層析樹脂的抗體，包含重組蛋白和表位標(biāo)記的融合蛋白可以被簡單而容易地純化。表位標(biāo)記的存在還允許重組蛋白在隨后的試驗,例如Western印跡中得以檢測，而不必產(chǎn)生對重組蛋白本身具有特異性的抗體。通常使用的表位標(biāo)記的例子包括V5、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、血凝(HA)、肽Phe-His-His-Thr-Thr、幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和類似物。在表達(dá)載體中有用的其他元件是多克隆位點或多接頭。編碼一系列限制性核酸內(nèi)切酶識別位點的合成DNA被插入質(zhì)粒載體,例如啟動子元件的下游。對這些位點進行改造，以將DNA方便地克隆入載體的特異性位點。 可以將前述元件組合起來，產(chǎn)生適合用于本發(fā)明方法的表達(dá)載體。根據(jù)本說明書的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠選擇并組合適合用于它們特定系統(tǒng)的元件。適合的原核載體包括質(zhì)粒，諸如能夠在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒(例如，pBR322、ColEl、pSClOl、PACYC184, itVX、PRSET、pBAD(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)和類似物)。Sambrook(cf. "Molecular Cloning:A Laboratory Manual, "second edition, edited bySambrook, Fritsch, & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989))公開了這樣的質(zhì)粒。桿菌質(zhì)粒包括pC194、pC221、pT127和類似物，并且被Gryczan (In: The MolecularBiology of the Bacilli, Academic Press, NY (1982), pp. 307-329)公開。合適的鏈霉菌質(zhì)粒包括 plilOl (Kendall et al.，J. Bacteriol. 169:4177-4183，1987)和鏈霉菌噬菌體諸如 Φ〇31 (Chater et al. , In:Sixth International Symposium on ActinomycetalesBiology, Akademiai Kaido, Budapest, Hungary(1986)，pp. 45-54)。John et al. (Rev.1nfect. Dis. 8:693-704，1986)和 Izaki (Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742, 1978)綜述了假單胞菌質(zhì)粒。合適的真核質(zhì)粒包括例如BPV、EBV、牛痘、SV40、2_微米環(huán)、pcDNA3.1、pcDNA3. 1/GS、pDual、pYES2/GS、pMT、pIND、pIND (Spl)、pVgRXR(Invitrogen)和類似物或它們的衍生物。這樣的質(zhì)粒是本領(lǐng)域熟知的(Botstein et al. , Miami Wntr.SyTnp. 19:265-274，1982 ;Broach, In :"The Molecular Biology of the YeastSaccharomyces: Life Cycle and Inheritance", Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring Harbor, N. Y. , p. 445-470, 1981 ；Broach, Cell 28:203-204，1982 ;Dilon et al. , J.Clin.Hematol. Oncol. 10:39-48，1980 ；Maniatis, In:Cell Biology:A ComprehensiveTreatise, Vol. 3, Gene Sequence Expression, Academic Press, NY, pp. 563-608，1980)。根據(jù)本說明書的教導(dǎo)，本文所述的尋祀盒(targeting cassette)可以用分子生物學(xué)領(lǐng)域已知的方法學(xué)構(gòu)建(參見例如Ausubel或Maniatis)。如上所述,通過向合適的載體骨架插入重組附著位點、可操縱性連接至感興趣啟動子的感興趣的多核苷酸編碼序列；和任選地編碼陽性選擇標(biāo)記的序列，裝配尋靶構(gòu)建物。獲得多核苷酸，包括合適的調(diào)節(jié)序列(例如，啟動子)的優(yōu)選方法是PCR。在MacPherson et al. , PCR:A PRACTICAL APPROACH, (IRL Press at OxfordUniversityPress, (1991))中教導(dǎo)了 PCR的通用程序。每一應(yīng)用反應(yīng)的PCR條件可以根據(jù)經(jīng)驗來決定。許多參數(shù)影響反應(yīng)的成功。在這些參數(shù)中有退火溫度和時間、延伸時間、Mg2+和ATP濃度、pH、以及引物、模板和脫氧核糖核苷酸的相對濃度。擴增之后，通過瓊脂糖凝膠電泳，然后用溴化乙啶染色和紫外線照射，檢測獲得的片段。本發(fā)明的表達(dá)盒、尋靶構(gòu)建物、載體、重組酶和重組酶-編碼序列可以配制入試劑盒。這樣的試劑盒的組分可以包括但是不限于容器、說明書、溶液、緩沖液、一次性用品和硬件。
述本發(fā)明涉及用于位點特異性重組的方法，包括提供第一重組位點和第二重組位點；將所述第一重組位點和第二重組位點與原核重組酶多肽接觸，從而在重組位點之間產(chǎn)生重組,其中重組酶多肽能夠介導(dǎo)第一重組位點和第二重組位點之間的重組,第一重組位 點是attP或attB,第二重組位點是attB或attP,重組酶選自單核細(xì)胞增生李斯特氏菌曬菌體重組酶、化膿性鏈球菌噬菌體重組酶、枯草芽孢桿菌噬菌體重組酶、結(jié)核分枝桿菌嗜菌重組酶、恥垢分枝桿菌噬菌體重組酶，條件是當(dāng)?shù)谝恢亟M附著位點是attB時，第二重組附著位點是attP,當(dāng)?shù)谝恢亟M附著位點是attP時,第二重組附著位點是attB。本發(fā)明進一步的方法是提供將位點特異性重組酶導(dǎo)入全基因組待被修飾的細(xì)胞。本發(fā)明優(yōu)選的實施方式涉及在真核細(xì)胞中獲得位點特異性重組的方法，所述方法包括提供含有第一重組附著位點和第二重組附著位點的真核細(xì)胞；將第一和第二重組附著位點與原核重組酶多肽接觸，導(dǎo)致在重組附著位點之間產(chǎn)生重組，其中重組酶多肽能夠介導(dǎo)在第一和第二重組附著位點之間的重組，第一重組附著位點是噬菌體基因組重組附著位點(attP)或細(xì)菌基因組重組附著位點(attB),第二重組附著位點是attB或attP,重組酶選自單核細(xì)胞增生李斯特氏菌噬菌體重組酶、化膿性鏈球菌噬菌體重組酶、枯草芽孢桿菌噬菌體重組酶、結(jié)核分枝桿菌噬菌體重組酶和恥垢分枝桿菌噬菌體重組酶，條件是當(dāng)?shù)谝恢亟M附著位點是attB時，第二重組附著位點是attP，當(dāng)?shù)谝恢亟M附著位點是attP時，第二重組附著位點是attB。在優(yōu)選的實施方式中，重組酶選自A118重組酶、SF370.1重組酶、SP3c2重組酶、Φ Rvl重組酶和Bxbl重組酶。在一個實施方式中，重組導(dǎo)致整合。對于許多應(yīng)用而言，將轉(zhuǎn)基因靶向整合入預(yù)定的遺傳位置是期望的目標(biāo)。首先，將位點特異性重組酶的第一重組位點插入基因組位點，或者隨機的位置或者預(yù)定的位置。隨后，細(xì)胞用攜帶感興趣基因或DNA、第二重組位點和重組酶源的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(表達(dá)質(zhì)粒、RNA、蛋白質(zhì)或病毒-表達(dá)重組酶)。第一重組位點和第二重組位點之間的重組導(dǎo)致質(zhì)粒DNA的整合。在另一個實施方式中，位點特異性重組導(dǎo)致剔除或切除。在哺乳動物遺傳學(xué)中最常見的應(yīng)用是在確定發(fā)育階段的失活或激活。待被從染色體或附加DNA剔除或切除的DNA或基因的側(cè)翼是第一重組和第二重組位點的串連(直接)重復(fù)。由于重組酶的導(dǎo)入而引發(fā)的位點之間的重組，導(dǎo)致DNA的剔除和基因失活。在另一類型的應(yīng)用中，重組酶能夠介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄終止信號(存在于啟動子和基因之間)從基因組中切除，從而將啟動子元件連接至轉(zhuǎn)基因的開放閱讀框，并激活基因表達(dá)。通過使用組成型或誘導(dǎo)型啟動子，或通過引入重組酶-表達(dá)病毒載體，重組酶能夠得以表達(dá)。在其他實施方式中，位點特異性重組導(dǎo)致倒位。以相反方向插入同樣的DNA分子的第一重組位點和第二重組位點之間的重組(分子內(nèi)重組)導(dǎo)致間插DNA部分或片段的倒位。在進一步的實施方式中，位點特異性重組導(dǎo)致DNA的交換。首先在染色體的感興趣位置產(chǎn)生盒式接納體。盒式接納體含有感興趣的DNA，常常是選擇標(biāo)記基因，在任意一邊的側(cè)翼是第一重組位點(例如attB)。第二，含有在任意一邊的側(cè)翼是重組位點(例如attP)的置換DNA盒(replacement DNA cassette)的交換載體與重組表達(dá)質(zhì)?；蛑亟M酶蛋白一起導(dǎo)入細(xì)胞。同源重組識別位點之間的雙雜交，導(dǎo)致在第一重組位點與交換載體攜帶的重組位點之間發(fā)生DNA置換。在另一例子中，第一重組位點是attP，和第二重組位點是attB。該程序常常被稱為重組酶-介導(dǎo)的盒式交換。在其他實施方式中，位點特異性重組導(dǎo)致染色體易位。對于染色體易位，第一重組位點被引入第一染色體，第二重組位點被引入第二染色體。供應(yīng)細(xì)胞以重組酶，導(dǎo)致染色體的易位。當(dāng)重組位點被靶向至非同源染色體時，產(chǎn)生易位。依靠重組位點的相對方向，重組 導(dǎo)致易位或雙著絲?；驘o著絲粒染色體。當(dāng)重組位點以與它們各自的著絲粒相對的方向定向時，發(fā)生易位。如果，重組位點在相反的方向，重組將產(chǎn)生無著絲粒和雙著絲粒染色體。本發(fā)明也包括在基因組中存在的假重組附著位點上的重組酶-介導(dǎo)的DNA插入。特異性重組酶的假重組或附著位點是在染色體上存在的天然序列，位點特異性重組酶能夠識別并用于整合含有第一或第二重組位點的質(zhì)粒DNA。在假重組位點上的整合比隨機整合常常更頻繁。這是一個單步驟的過程，在某種意義上，沒有必要將重組位點引入基因組作為第一步驟。在假位點上的整合在基因和細(xì)胞治療中都有應(yīng)用。假attB是在與attP位點重組的基因組中存在的天然重組位點。假attP是在與attB位點重組的基因組中存在的天然重組位點。因此，本發(fā)明提供了在真核細(xì)胞中獲得位點特異性重組的方法，所述方法包括提供包含第一重組位點和第二重組位點的真核細(xì)胞；將第一重組位點和第二重組位點與原核重組酶多肽接觸,產(chǎn)生重組位點之間的重組,其中重組酶多肽能夠介導(dǎo)第一重組位點和第二重組位點之間的重組，第一重組位點是attP或attB，第二重組位點是假附著位點，重組酶選自單核細(xì)胞增生李斯特氏菌噬菌體重組酶、化膿性鏈球菌噬菌體重組酶、枯草芽孢桿菌噬菌體重組酶、結(jié)核分枝桿菌噬菌體重組酶和恥垢分枝桿菌噬菌體重組酶。優(yōu)選地，重組酶選自A118重組酶、SF370.1重組酶、SPP c2重組酶、(J)Rvl重組酶和Bxbl重組酶。本發(fā)明還包括獲得具有穩(wěn)定整合的多核苷酸序列的真核細(xì)胞的方法，所述方法包括將多核苷酸導(dǎo)入包含第一重組attB或attP位點的真核細(xì)胞中，其中多核苷酸包含核酸序列和第二重組attP或attB位點；將第一和第二重組位點與原核重組酶多肽接觸，其中重組酶多肽能夠介導(dǎo)第一重組位點和第二重組位點之間的位點特異性重組,重組酶選自單核細(xì)胞增生李斯特氏菌噬菌體重組酶、化膿性鏈球菌噬菌體重組酶、枯草芽孢桿菌噬菌體重組酶、結(jié)核分枝桿菌噬菌體重組酶和恥垢分枝桿菌噬菌體重組酶，條件是當(dāng)?shù)谝恢亟M位點是attB時，第二重組位點是attP,當(dāng)?shù)谝恢亟M位點是attP時,第二重組位點是attB。在另一個實施方式中，獲得具有穩(wěn)定整合的多核苷酸序列的真核細(xì)胞的方法包括將多核苷酸導(dǎo)入含有第一重組假附著位點的真核細(xì)胞中，其中多核苷酸包含核酸序列和第二重組attP或attB位點；將第一和第二重組位點與原核重組酶多肽接觸，其中重組酶多肽能夠介導(dǎo)第一重組位點和第二重組位點之間的位點特異性重組，重組酶選自單核細(xì)胞增生李斯特氏菌噬菌體重組酶、化膿性鏈球菌噬菌體重組酶、枯草芽孢桿菌噬菌體重組酶、結(jié)核分枝桿菌噬菌體重組酶和恥垢分枝桿菌噬菌體重組酶。在優(yōu)選的實施方式中，重組酶選自A118重組酶、SF370.1重組酶、SP β c2重組酶、Φ Rvl重組酶和Bxbl重組酶。本發(fā)明還包括在真核細(xì)胞中獲得位點特異性重組的方法,所述方法包括提供包含第一重組位點和第二重組位點的真核細(xì)胞，具有側(cè)翼是第三重組位點和第四重組位點的多核苷酸序列；將重組酶位點與原核重組酶多肽接觸，從而在重組位點之間產(chǎn)生重組，其中所述重組酶多肽能夠介導(dǎo)第一和第三重組位點以及第二和第四重組位點之間的重組，所述第一和第二重組位點是attP或attB,第三和第四重組位點是attB或attP,重組酶選自單核細(xì)胞增生李斯特氏菌噬菌體重組酶、化膿性鏈球菌噬菌體重組酶、枯草芽孢桿菌噬菌體重組酶、結(jié)核分枝桿菌噬菌體重組酶和恥垢分枝桿菌噬菌體重組酶，條件是當(dāng)?shù)谝缓偷诙亟M附著位點是attB時，第三和第四重組附著位點是attP，當(dāng)?shù)谝缓偷诙亟M附著位點是attP時，第三和第四重組附著位點是attB。優(yōu)選地，重組 酶選自Al 18重組酶、SF370.1重組酶、SP β c2重組酶、Φ Rvl重組酶和Bxbl重組酶。本發(fā)明的另一個實施方式提供了將感興趣的多核苷酸以位點特異性的方式整合入轉(zhuǎn)基因?qū)ο蟮幕蚪M的方法，其中所述基因組包含第一重組attB或attP位點或假attB或假attP位點，所述方法包括引入包含感興趣的多核苷酸和第二重組attP或attB位點的核酸；將第一和第二重組位點與原核重組酶多肽接觸，其中重組酶多肽能夠介導(dǎo)第一重組位點和第二重組位點之間的位點特異性重組，重組酶選自單核細(xì)胞增生李斯特氏菌噬菌體重組酶、化膿性鏈球菌噬菌體重組酶、枯草芽孢桿菌噬菌體重組酶、結(jié)核分枝桿菌噬菌體重組酶和恥垢分枝桿菌噬菌體重組酶，條件是當(dāng)?shù)谝恢亟M位點是attB或假attB時，第二重組位點是attP,當(dāng)?shù)谝恢亟M位點是attP或假attP時,第二重組位點是attB。優(yōu)選地,重組酶選自Al 18重組酶、SF370.1重組酶、SPP c2重組酶、(J)Rvl重組酶和Bxbl重組酶。本發(fā)明的另一方法提供了在真核細(xì)胞中獲得多位點特異性重組，所述方法包括提供包含第一重組位點和第二重組位點的真核細(xì)胞，其具有第三重組位點和第四重組位點；將第一重組位點和第二重組位點與第一原核重組酶多肽接觸，將第三和第四重組位點與第二原核重組酶多肽接觸，從而導(dǎo)致第一重組位點和第二重組位點之間的重組，以及第三和第四重組位點之間的重組，其中第一重組酶多肽能夠介導(dǎo)第一重組位點和第二重組位點之間的重組，第二重組酶多肽能夠介導(dǎo)第三和第四重組位點之間的重組，第一和第二重組酶選自單核細(xì)胞增生李斯特氏菌噬菌體重組酶、化膿性鏈球菌噬菌體重組酶、枯草芽孢桿菌噬菌體重組酶、結(jié)核分枝桿菌噬菌體重組酶和恥垢分枝桿菌噬菌體重組酶，條件是第一重組酶多肽和第二重組酶多肽是不同的。該方法還包括第五重組位點和第六重組位點以及第三重組酶多肽，其中所述第三重組酶多肽能夠介導(dǎo)第五和第六重組位點之間的重組，條件是第三重組酶多肽不同于第一和第二重組酶多肽。本發(fā)明還涉及包含原核重組酶多肽或編碼原核重組酶的核酸的真核細(xì)胞，其中所述重組酶能夠介導(dǎo)第一重組位點和第二重組位點之間的位點特異性重組，所述第二重組位點能夠充當(dāng)與第一重組位點重組的底物，其中第一重組位點是attP、假attP、attB或假attB,第二重組位點是attB、假attB、attP、假attP,重組酶選自單核細(xì)胞增生李斯特氏菌噬菌體重組酶、化膿性鏈球菌噬菌體重組酶、枯草芽孢桿菌噬菌體重組酶、結(jié)核分枝桿菌噬菌體重組酶和恥垢分枝桿菌噬菌體重組酶，條件是當(dāng)?shù)谝恢亟M位點是attB時，第二重組位點是attP或假attP ;當(dāng)?shù)谝恢亟M位點是假attB時,第二重組位點是attP ;當(dāng)?shù)谝恢亟M位點是attP時，第二重組位點是attB或假attB ;當(dāng)?shù)谝恢亟M位點是假attP時，第二重組位點是attB。優(yōu)選地，重組酶選自Al 18重組酶、SF370.1重組酶、SP β c2重組酶、Φ Rvl重組酶和Bxbl重組酶。
趣適于用本發(fā)明方法修飾的細(xì)胞包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。原核細(xì)胞是缺少明確的細(xì)胞核的細(xì)胞。合適的原核細(xì)胞的例子包括細(xì)菌細(xì)胞、支原體細(xì)胞和古細(xì)菌細(xì)胞。特別優(yōu)選的原核細(xì)胞包括各種類型的試驗系統(tǒng)中有用的那些(下面有詳細(xì)討論)，或具有一些工業(yè)利用性的那些，諸如產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(乙醇生產(chǎn))、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) (丁醇生產(chǎn))和類似物(參見，Green and Bennet, Biotech& Bioengineering 58:215—221，1998 ;Ingram，et al，Biotech & Bioengineering58:204-206, 1998)。合適的真核細(xì)胞不但 包括動物細(xì)胞(諸如，來自昆蟲、嚙齒類動物、家牛、山羊、兔、綿羊、非人靈長類動物、人和類似動物)，而且包括植物細(xì)胞(諸如水稻、玉米、棉花、煙草、番茄、土豆和類似植物)。在下面詳細(xì)論述了可應(yīng)用于特定目的的細(xì)胞類型。本發(fā)明的還有另一個實施方式包括分離的遺傳工程細(xì)胞。合適的細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，如上所述。本發(fā)明的遺傳工程細(xì)胞可以是單細(xì)胞生物或可以源自多細(xì)胞生物。關(guān)于源自多細(xì)胞生物的遺傳工程細(xì)胞，“分離的”是指活體之外的細(xì)胞，無論是植物還是動物，并且是在人工環(huán)境中。術(shù)語“分離的”的使用并不意味著遺傳工程細(xì)胞是唯一存在的細(xì)胞。在一個實施方式中，本發(fā)明的遺傳工程細(xì)胞含有本發(fā)明的任一核酸構(gòu)建物。在第二實施方式中，在感興趣的核酸序列將被插入基因組的條件下，特異性識別重組序列的重組酶被引入遺傳工程細(xì)胞，該遺傳工程細(xì)胞含有本發(fā)明的其中一種核酸構(gòu)建物。因此，遺傳工程細(xì)胞具有修飾的基因組。引入此重組酶的方法是本領(lǐng)域熟知的，如上所述。本發(fā)明的遺傳工程細(xì)胞可以以各種方式使用?？梢詫渭?xì)胞生物修飾，以產(chǎn)生具有商業(yè)價值的物質(zhì)，諸如重組蛋白、工業(yè)溶劑、工業(yè)有用的酶和類似物質(zhì)。優(yōu)選的單細(xì)胞生物包括真菌，諸如酵母(例如粟酒裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)、釀酒酵母(S. cerevisiae)(諸如 INVScl)和類似酵母)、曲霉菌(Aspergillis)和類似物，以及細(xì)菌諸如克雷伯氏菌屬(klebsiella)、鏈霉菌屬(Streptomyces)和類似細(xì)菌。來自多細(xì)胞生物的分離細(xì)胞可以具有類似的用處，包括昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞和植物細(xì)胞。可能有用的哺乳動物細(xì)胞包括那些衍生自嚙齒動物、靈長類動物和類似物的細(xì)胞。它們包括中國倉鼠卵(CHO)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、小鼠神經(jīng)干細(xì)胞、大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞、纖維原細(xì)胞來源的細(xì)胞，諸如VER0、3T3或CH0K1、HEK 293細(xì)胞，或淋巴起源的細(xì)胞(諸如32D細(xì)胞)和它們的衍生物。此外，植物細(xì)胞諸如煙草BY2細(xì)胞也可用作宿主，與植物細(xì)胞相容的控制序列是可得的，諸如花椰菜花葉病毒35S和19S、胭脂氨酸合成酶啟動子和多聚腺苷酸化信號序列和類似物。合適的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。另一優(yōu)選的宿主是昆蟲細(xì)胞，例如來自果蠅幼蟲。使用昆蟲細(xì)胞作為宿主，可以使用果蠅醇脫氫酶啟動子(Rubin, Science 240:1453-1459，1988)。作為選擇，可以對桿狀病毒整體進行工程改造，以在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)大量的由期望的核酸序列編碼的妝(Jasny, Science 238:1653, 1987) ；Miller et al. , In:GeneticEngineering (1986), Setlow, J. K. , et al. , eds. , Plenum, Vol. 8, pp. 277-297)。本發(fā)明的遺傳工程細(xì)胞還可以用作篩選物質(zhì)的工具，所述物質(zhì)能夠調(diào)節(jié)由感興趣的核酸片段編碼的蛋白質(zhì)的活性。因此，本發(fā)明其他的實施方式包括篩選方法，該方法包括將本發(fā)明的遺傳工程細(xì)胞與試驗物質(zhì)接觸；并監(jiān)控同沒有與試驗物質(zhì)接觸的試驗細(xì)胞相比，細(xì)胞在細(xì)胞表現(xiàn)型、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、蛋白質(zhì)的酶活性或蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的天然結(jié)合伴侶之間的相互作用方面的變化。使用本發(fā)明的遺傳工程細(xì)胞，可以評價各種測試物質(zhì)，包括肽、蛋白質(zhì)、抗體、低分子量有機化合物、衍生自例如真菌或植物細(xì)胞的天然產(chǎn)物和類似物?！暗头肿恿坑袡C化合物”是指分子量通常500-1000以下的化學(xué)物質(zhì)。試驗物質(zhì)的來源是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。利用細(xì)胞的各種分析方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。這些方法包括例如，酶活性分析(Hirth，et al，美國專利5，763，198，1998年6月9日出版)、試驗物質(zhì)與遺傳工程細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)結(jié)合的分析、報道基因轉(zhuǎn)錄活化的分析和類似的分析。由本發(fā)明方法修飾的細(xì)胞可以維持在這樣的條件下，例如(i)維持它們存活但是不促進生長，(ii)促進細(xì)胞生長，和/或(iii)使細(xì)胞分化或去分化。細(xì)胞培養(yǎng)條件典型地允許重組酶在細(xì)胞中發(fā)揮作用，盡管對重組酶活性的調(diào)控可以被培養(yǎng)條件調(diào)節(jié)(例如，提高或降低細(xì)胞培養(yǎng)溫度)。對于給定細(xì)胞、細(xì)胞類型、組織或生物，培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域已知的。
轉(zhuǎn)基因植物和非人動物在另一個實施方式中，本發(fā)明包括轉(zhuǎn)基因植物和非人轉(zhuǎn)基因動物，利用本發(fā)明的方法和組合物，其基因組已被修飾。利用本發(fā)明的方法，可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物，以充當(dāng)模型系統(tǒng)，用于研究各種紊亂和篩選調(diào)節(jié)此種紊亂的藥物。“轉(zhuǎn)基因”植物或動物指遺傳工程改造的植物或動物，或遺傳工程改造的植物或動物的子代。轉(zhuǎn)基因植物或動物通常含有來自至少一個不相關(guān)生物，諸如來自病毒的物質(zhì)。在轉(zhuǎn)基因生物上下文中，所用的術(shù)語“動物”指人之外的所有物種。它也包括所有發(fā)育階段的單個動物，包括胚胎階段和胎兒階段。農(nóng)業(yè)動物((例如，雞、豬、山羊、綿羊、牛、馬、兔、和類似動物)、嚙齒動物(諸如小鼠)和家養(yǎng)寵物(例如貓和狗)包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在優(yōu)選的實施方式中，動物是小鼠或大鼠。術(shù)語“嵌合的”植物或動物用來指其中發(fā)現(xiàn)異源基因的植物或動物，或其中異源基因在某些但不是在植物或動物的所有細(xì)胞中表達(dá)。術(shù)語轉(zhuǎn)基因動物也包括生殖細(xì)胞系轉(zhuǎn)基因動物?！吧臣?xì)胞系轉(zhuǎn)基因動物”是一種轉(zhuǎn)基因動物，在其中本發(fā)明方法提供的遺傳信息已被吸收并整合入生殖細(xì)胞系細(xì)胞中，從而賦予將信息轉(zhuǎn)移給子代的能力。如果該子代，實際上，擁有一些或所有那些信息，那么它們也是轉(zhuǎn)基因動物。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物和動物的方法是本 領(lǐng)域已知的，并可以與本申請的教導(dǎo)聯(lián)合使用。在一個實施方式中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物通過如下產(chǎn)生向單細(xì)胞胚胎引入核酸構(gòu)建物，所述構(gòu)建物包括能夠與第二重組位點重組的第一重組位點和感興趣的核酸片段，所述第二重組位點在從其獲得細(xì)胞的生物基因組內(nèi)發(fā)現(xiàn)，以感興趣的核酸片段被穩(wěn)定整合入成熟動物的生殖細(xì)胞系細(xì)胞的DNA的方式進行，并以正常孟德爾方式遺傳。在該實施方式中，感興趣的核酸片段可以是前述任一片段。作為選擇，感興趣的核酸序列能夠編碼異源產(chǎn)物，該異源產(chǎn)物中斷或干涉感興趣的內(nèi)源產(chǎn)生蛋白的表達(dá)，產(chǎn)生感興趣蛋白的表達(dá)減少的轉(zhuǎn)基因動物。有多種方法可以用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。本發(fā)明的核酸構(gòu)建物可以在雄性和雌性前核融合之前被注射入受精卵的前核或細(xì)胞質(zhì)，或在細(xì)胞分化起始之后被注射入胚胎細(xì)胞的核(例如雙細(xì)胞胚胎的核)中 (Brinster, et al. , Proc. Nat. Acad. Sc1. USA82:4438，1985)。胚胎可以用病毒,尤其是逆轉(zhuǎn)錄病毒感染,用attD重組位點和感興趣的核酸序列修飾。如上所述地，細(xì)胞還可以用位點特異性重組酶處理，以促進感興趣的核酸序列整合入基因組。僅僅作為例子，為了制備轉(zhuǎn)基因小鼠，對雌性小鼠誘導(dǎo)使其排卵過度。在允許交配之后，通過用CO2窒息或斷頸的方式殺死雌性小鼠，并從切除的輸卵管回收胚胎。去除周圍的堆積細(xì)胞。然后洗滌前核胚胎并保存，直到注射之時。隨機循環(huán)成年雌性小鼠與切除輸精管的雄性小鼠配對。受體雌性小鼠與供體雌性小鼠在相同的時間交配。胚胎然后通過手術(shù)轉(zhuǎn)移。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因大鼠的程序與小鼠類似。參見Hammer，et al.,Cell63:1099-1112，1990)。適合于轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灥膰X動物可以從標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)來源獲得，諸如 Charles River (Wilmington, Mass. ) > Taconic (Germantown, N. Y. ) > Harlan SpragueDawley (Indianapolis, Ind.),等等。操縱嚙齒動物胚胎的程序和將DNA顯微注射入受精卵的前核中的程序，是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的(Hogan，et al.，見上文)。對魚類、兩棲類卵和鳥的顯微注射的程序在 Houdebine and Chourrout, Experientia 47:897-905, 1991)中被詳細(xì)描述。將 DNA 導(dǎo)入動物組織的其他程序描述在美國專利4，945，050 (Sandford et al.，Jul. 30，1990)中。源自胚胎的內(nèi)細(xì)胞團的、并在培養(yǎng)基中穩(wěn)定的全能或多能干細(xì)胞在培養(yǎng)基中進行操作，以利用本發(fā)明方法整合核酸序列。通過注射入胚泡，然后植入代孕母本并允許達(dá)到分娩期，從而可以由這樣的細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。培養(yǎng)干細(xì)胞的方法和隨后通過將DNA引入干細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的方法也是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的，其中將DNA引入干細(xì)胞所使用的方法諸如電穿孔、磷酸鈣/DNA沉淀、顯微注射、脂質(zhì)體融合、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染和類似方法。參見例如Teratocarcinomas andEmbryonic Stem Cells, A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. , IRL Press, 1987)。用于將異源DNA顯微注射入哺乳動物(小鼠、豬、兔、綿羊、山羊、牛)受精卵的標(biāo)準(zhǔn)實驗室程序的綜述包括Hogan et al. , Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Press1986) ；Krimpenfort et al. , 1991, Bio/Technology 9:86 ；Palmiter et al. , 1985, Cell41:343 ；Kraemer et al. , Genetic Manipulation of the Early Mammalian Embryo(ColdSpring Harbor Laboratory Pressl985) ；Hammer et al.,1985, Nature, 315:680 ；Purcelet al.，1986，Science, 244:1281 ;Wagner et al.;美國專利 5，175，385 ;Krimpenfort etal.,美國專利5，175，384，它們各自的內(nèi)容并入本文作為參考。程序的最后階段是將靶向的ES細(xì)胞注射入胚泡，并將胚泡轉(zhuǎn)移入假孕雌性中。培育得到的嵌合動物，通過Southern印跡分析子代，以鑒定攜帶轉(zhuǎn)基因的個體。產(chǎn)生非嚙齒動物哺乳動物和其他動物的程序已經(jīng)被其他文獻(xiàn)公開(參見Houdebine andChourrout, supra;Pursel,et al. , Science 244:1281-1288，1989 ;和 Simms, et al. , Bio/Technology6:179-183, 1988)。攜帶轉(zhuǎn)基因的動物可以通過本領(lǐng)域熟知的方法鑒定，例如通過點印跡或Southern印跡。本文所用的術(shù)語轉(zhuǎn)基因還包括任何生物，其基因組已經(jīng)通過早期胚胎或受精卵的體外操作或通過誘導(dǎo)特異性基因敲除的任何轉(zhuǎn)基因技術(shù)而被改變。如本文所用，術(shù)語“基因敲除”指伴隨功能喪失的體內(nèi)基因靶向中斷，這已經(jīng)通過使用本發(fā)明載體而實現(xiàn)。在一個實施方式中，具有基因敲除的轉(zhuǎn)基因動物是那些動物，在它們中，通過靶向位于基因序列中的假-重組位點，通過靶向待被致使無功能的基因的插入，已使得目標(biāo)基因沒有功能。
基因治療和紊亂本發(fā)明進一步的實施方式包括在需要此治療的對象中治療紊亂的方法。在本方法的一個實施方式中，對象的至少一個細(xì)胞或細(xì)胞類型(或組織，等等)具有重組位點。該細(xì)胞(許多細(xì)胞)用核酸構(gòu)建物(“尋靶構(gòu)建物”)轉(zhuǎn)化，該核苷酸構(gòu)建物包括第二重組序列和一個·或多個感興趣的多核苷酸(典型地是治療基因)。向同一細(xì)胞，引入特異性識別重組序列的重組酶，在感興趣的核酸序列通過第一重組位點和第二重組位點之間的重組事件插入基因組的條件下進行。使用本發(fā)明的方法可以處理的對象包括人和非人動物。這樣的方法利用本發(fā)明的尋靶構(gòu)建物和重組酶。通過利用本發(fā)明的方法，可以治療各種紊亂，包括單基因紊亂、感染疾病、獲得性紊亂、癌癥和類似紊亂。示例性單細(xì)胞紊亂包括ADA缺陷、囊腫性纖維化、家族性高膽固醇血癥、血友病、慢性青光眼病、杜興氏型肌營養(yǎng)不良、范可尼貧血、鐮刀狀細(xì)胞貧血、高歇氏病、亨特氏綜合征、X-連鎖S⑶D和類似紊亂。通過利用本發(fā)明的方法可以治療的感染性疾病包括由各種類型的病毒引起的感染，病毒包括人T-細(xì)胞嗜淋巴細(xì)胞病毒、流感病毒、乳突淋瘤病毒、肝炎病毒、皰疹病毒、Epstein-Bar病毒(埃巴二氏病毒)、免疫缺陷病毒(HIV和類似病毒)、巨細(xì)胞病毒和類似病毒。也包括由其他病原性生物引起的感染，諸如結(jié)核分枝桿菌、肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)和類似生物,或寄生蟲諸如Plasmadium falciparum和類似寄生蟲。本文所用的術(shù)語“獲得性紊亂”指非先天性紊亂。這樣的紊亂通常被認(rèn)為比單基因紊亂更復(fù)雜，并可能由一種或多種基因不適當(dāng)?shù)幕虿槐匾幕钚运?。這樣的紊亂的例子包括外周動脈疾病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、冠心病和類似疾病。通過利用本發(fā)明的方法可以治療的一組特定的獲得性紊亂包括各種癌癥，包括實體腫瘤和血源性腫瘤，諸如白血病和淋巴瘤。通過利用本發(fā)明的方法可以治療的實體腫瘤包括癌癥、肉瘤、骨瘤、纖維肉瘤、軟骨肉瘤和類似腫瘤。具體的癌癥包括乳腺癌、腦癌、肺癌(非小細(xì)胞和小細(xì)胞肺癌)、腸癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、腎癌、頭頸癌和類似癌癥。在基因組中特定位置的合適性，部分地取決于正被治療的特定紊亂。例如，如果紊亂是單基因紊亂，并且期望的治療是加入治療性核酸——編碼被認(rèn)為是紊亂的成因劑的非突變形式的核酸，那么合適的位置可以是這樣的基因組區(qū)域，其不編碼任何已知的蛋白并且允許加入的核酸產(chǎn)生合理的表達(dá)水平。在基因組中鑒定合適的位置的方法是本領(lǐng)域熟知的，并在下面的實施例中有進一步的描述。
在該實施方案中使用的核酸構(gòu)建物還包括一個或多個感興趣的核酸片段。在該實施方案使用的優(yōu)選的感興趣核酸片段是治療性基因和/或控制區(qū)域，如前所定義。對核酸序列的選擇將依據(jù)待被治療的紊亂的特性。例如，旨在治療血友病B的核酸構(gòu)建物，可以包含編碼功能因子IX的核酸片段，其中血友病B由凝集因子IX的缺乏而引起的。旨在治療阻塞性外周動脈疾病的核酸構(gòu)建物可以包含編碼刺激新血管生長的蛋白質(zhì)的核酸片段，諸如例如血管內(nèi)皮生長因子、血小板-衍生的生長因子和類似物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地認(rèn)識到哪種感興趣的核酸片段將在特定紊亂的治療中是有用的。使用各種方法，核酸構(gòu)建物可以被給予正被治療的對象。給予可以體內(nèi)或離體進行?！绑w內(nèi)”，它是指在動物的活體內(nèi)?！半x體”，它是指細(xì)胞或器官在體外被修飾，這樣的細(xì)胞或器官通常被返回到活體。核酸構(gòu)建物的治療性給予的方法是本領(lǐng)域熟知的。核酸構(gòu)建物可以用陽離子脂類(Goddard, et al, Gene Therapy, 4:1231-1236, 1997 ；Gorman, et al, Gene Therapy4:983-992, 1997 ；Chadwick, et al, Gene Therapy 4:937-942，1997;Gokhale, et al, Gene Therapy 4:1289-1299，1997 ;Gao, and Huang, Gene Therapy 2:710-722, 1995,所有文獻(xiàn)并入本文作為參考)、使用病毒載體(Monahan, et al, Gene Therapy 4:40-49, 1997 ；Onodera, et al, Blood 91:30-36，1998，所有文獻(xiàn)并入本文作為參考)、通過“裸露DNA”的吸收和類似方法來傳遞。本領(lǐng)域熟知的、用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的技術(shù)(參見上面的討論)可以用于核酸構(gòu)建物的離體給予。根據(jù)患者的狀況，個體醫(yī)師可以選擇準(zhǔn)確的配方、給予途徑和劑量(參見例如Fingl et al.，1975，in“The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Ch.1pl)。應(yīng)該注意到，由于毒性、器官功能異常和類似情況，主治醫(yī)師將知道如何去以及何時去終止、中斷或調(diào)節(jié)給予。相反地，如果臨床應(yīng)答不充分(排除毒性)，主治醫(yī)師也將知道如何將治療調(diào)整到較高水平。在對正被治療的紊亂的控制中，給予的劑量的數(shù)量將隨著待被治療的癥狀的嚴(yán)重程度，以及給予途徑和類似情況而變化。癥狀的嚴(yán)重程度例如可以部分地通過標(biāo)準(zhǔn)預(yù)后評價方法進行評價。此外，根據(jù)個體患者的年齡、體重和應(yīng)答，劑量和可能的劑量也將經(jīng)常變化?？傮w而言，在紊亂治療中，被靶向用于基因組修飾的細(xì)胞中至少1-10%應(yīng)該被修飾。因此，對方法和給予途徑將作最佳選擇，以便每次給予修飾至少0. 1-1%的目標(biāo)細(xì)胞。這樣，給予的數(shù)量可以維持在最小水平，以便增加治療的效率和方便性。取決于正被治療的特定癥狀，可以配制這樣的試劑并全身性地或局部給予。配制和給予的技術(shù)可以參見 “Remington，s Pharmaceutical Sciences, ” 1990，18th ed. , MackPublishing Co.，Easton, Pa。合適的途徑可以包括經(jīng)口、直腸、經(jīng)皮、陰道、經(jīng)黏膜或腸內(nèi)給藥；腸胃外遞送，包括肌內(nèi)、皮下、骨髓內(nèi)注射，以及胸內(nèi)、直接心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射，等等。正被治療的對象還將給予重組酶，該重組酶特異性地識別經(jīng)選用的第一和第二重組序列。通過包括作為核酸構(gòu)建物的一部分的、編碼重組酶的核酸，或作為被基因組待被修飾的細(xì)胞吸收的蛋白質(zhì)，特定的重組酶可以被給予。對于包含重組序列和感興趣核酸序列的尋靶構(gòu)建物的給予，給予的方法和途徑與上述的方法和途徑相似。對于感興趣核酸序列的整合，可能僅在有限的時間段里需要重組酶蛋白質(zhì)。因此，如果作為重組酶基因引入，攜帶重組酶基因的載體將缺少介導(dǎo)延長的保留的序列。例如，常規(guī)的質(zhì)粒DNA在大部分哺乳動物細(xì)胞中快速衰變。重組酶基因也可以裝備有限制其表達(dá)的基因表達(dá)序列。例如，可以使用誘導(dǎo)型啟動子，以便通過有限地暴露于誘導(dǎo)劑，重組酶表達(dá)可以被臨時性地調(diào)節(jié)。一組這樣的示例性啟動子是脫皮激素應(yīng)答性啟動子，其表達(dá)可以通過使用脫皮留酮或其他非-固醇類激動劑進行調(diào)節(jié)。另一組啟動子是四環(huán)素-應(yīng)答性啟動子，其表達(dá)可以通過使用四環(huán)素或多四環(huán)素進行調(diào)節(jié)。
實施例 通用方法本文中應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA和分子克隆技術(shù)是本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的，并描述于下述文獻(xiàn)中，Sambrook, J. , Fritsch, E. F.和 Maniatis, T. Molecular Cloning: ALaboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) (Maniatis) ；T. J. Silhavy, M. L. Bennan 和 L. W. Enquist, Experiments withGene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1984)； 以及 Ausubel, F.M.et al., Current Protocols in Molecular Biology, GreenePublishing Assoc, and Wiley-1nterscience (1987) 適合于維持和培養(yǎng)細(xì)菌培養(yǎng)物的材料和方法是本技術(shù)領(lǐng)域熟知的。適用于下述實施例的技術(shù)可以參見Phillipp，G.et al. , Manual of Methods for General Bacteriology,American Society forMicrobiology, Washington, DC. (1994)或 Brock,T.D. Biotechnology:A Textbook ofIndustrial Microbiology, Second Edition,Sinauer Associates, Inc. , Sunderland，MA(1989)。除非另外說明，用于培養(yǎng)和維持宿主細(xì)胞的所有試劑、限制性酶和材料獲自 New England Biolabs (Beverly, MA), Invitrogen Corporation(Carlsbad, CA)、Stratagene Corporation (La Jo I la, CA)、Promega Corporation (Madison, WI) > DIFCOLaboratories(Detroit, MI)或 Sigma/Aldrich Chemical Company(St. Louis, MO)。遺傳序列和比對的操作以及多核苷酸和多肽序列的比較可以用得自Invitrogen Corporation,Carlsbad, CA(Vector NTI software version 8.0)、DNASTAR, Inc. , Madison, WI(DNASTAR software version 6. 0)或 Genetics ComputerGroup Inc. , Madison, WI (Wisconsin Package Version 9. 0)的程序組來完成?？s寫的含意如下“h”指小時，“ μ L”指微升，“mL”指毫升，“L”指升，“ μ Μ”指微摩爾濃度，“mM”指毫摩爾濃度，“ng”指納克，“ μ g”指微克，“mg”指毫克，“A”指腺嘌呤或腺苷，“T”指胸腺嘧啶或胸苷，“G”指鳥嘌呤或鳥苷，“C”指胞嘧啶或胞苷，“nt”指核苷酸，“aa”指氨基酸，“bp”指堿基對，“kb”指千堿基對，“k”指千，“ μ ”微，“ Φ ”指Phi，“ β ”指beta，“SE”指標(biāo)準(zhǔn)誤差，“Luc”指螢火蟲熒光素酶，“RLuc”指Renilla熒光素酶，“。C ”指攝氏度。下面的實施例表明，源自枯草芽孢桿菌噬菌體SP β c2、化膿性鏈球菌噬菌體SF370.1、恥垢分枝桿菌噬菌體Bxbl、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌噬菌體A118和結(jié)核分枝桿菌噬菌體ΦΝ1的位點特異性重組酶系統(tǒng)在真核細(xì)胞中發(fā)揮作用。這些實施例被提供用以舉例說明而不是限制本發(fā)明。
實施例1:重組酶基因的設(shè)計、合成和克降以及分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒在分析了出版的文獻(xiàn)和在Genbank中可得的序列后，選擇并分析了大量位點特異性重組酶用于哺乳動物和植物細(xì)胞的DNA整合、切除、倒位和置換。從GenBank獲得大的位點特異性絲氨酸家族重組酶的氨基酸序列(Smith, M. C. and H. M. Thorpe 2000 Diversityin the serine recombinases. Mol. Microbiol.，44:299-307),并反向翻譯成 DNA。因為重組酶的來源來自細(xì)菌和細(xì)菌病毒，我們優(yōu)化在哺乳動物細(xì)胞中用于重組酶表達(dá)的DNA序列，而不改變編碼的氨基酸序列。使用用于高水平的人類和小鼠表達(dá)的密碼子，以及用于克隆的方便的限制酶位點，完整地合成基因。此外，如果可能，避免極高(>80%)或極低(〈30%·)GC含量的區(qū)域。此外，在優(yōu)化期間，避免下述順式作用序列基序，以優(yōu)化RNA穩(wěn)定性和翻譯-內(nèi)部TATA-盒，ch1-位點和核糖體進入位點-富含AT或富含GC的序列段-重復(fù)序列和RNA 二級結(jié)構(gòu)-(隱蔽)剪接供體和受體位點，分支點-多聚㈧位點
密碼子和RNA優(yōu)化導(dǎo)致在天然(即，在Genbank獲得的DNA序列)和合成基因之間具有20-30%的序列差異。將編碼重組酶的合成基因克隆入哺乳動物和獲自StratageneCorporation (La Jolla, CA,編號214501)的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pDual中。pDual表達(dá)載體指導(dǎo)異源基因在哺乳動物和原核細(xì)胞中表達(dá)。對于在哺乳動物細(xì)胞中的組成型表達(dá)，載體含有人巨細(xì)胞病毒(CMV)即時早期基因的啟動子/增強子。重組酶基因克被隆在CMV啟動子和SV40終止子序列之間存在的獨特Eam 1104 I限制性酶位點上。當(dāng)合成基因序列時，我們將Eam 1104 I限制酶識別位點添加在基因的起始(在起始密碼子ATG之前)和末端處(終止密碼子之后TAG)，以幫助用Eam 1104 I酶消化，并在克隆在pDual質(zhì)粒的同一位置。使用標(biāo)準(zhǔn) DNA 克隆程序(Sambrook, J. , E. F. Fritsch, et al. 1989. Molecular Cloning:Alaboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY),進行合成基因的克隆、克隆的測序，以確認(rèn)克隆入pDual載體之后的基因序列。下面給出了表達(dá)質(zhì)粒的描述。1.1 SPbc2重組酶表汰質(zhì)粒遵照Stratagene (La Jolla, CA)推薦的程序，將合成的DNA序列(SEQ ID NO:1)克隆入pDual表達(dá)載體的Eam 1104 I限制性位點，該合成的DNA序列(SEQ ID NO:1)的密碼子經(jīng)優(yōu)化以用于動物細(xì)胞表達(dá)，并且編碼枯草芽孢桿菌噬菌體SP3 c2的位點特異性DNA重組酶yokA(SEQ ID NO:2，Genbank登錄號T12765，Lazarevic, V. , A. Dusterhoft, et al. 1999,Nucleotide sequence of the Bacillussubtilis temperate bacteriophage SP β c2. Microbiology 145:1055-67)。1. 2 SF370.1重組酶表達(dá)質(zhì)粒遵照StrataRene (La Jolla, CA)推薦的程序,將合成DNA序列(SEQ ID NO: 3)克隆入pDual表達(dá)載體的Eam 1104 I限制性位點，該合成的DNA序列(SEQ ID NO:3)的密碼子經(jīng)優(yōu)化以用于動物細(xì)胞表達(dá)，并且編碼化膿性鏈球菌噬菌體SF370.1 的推定重組酶(SEQ ID NO:4，Genbank 登錄號 T12765, Canchaya, C，F(xiàn). Desiere, etal.2002, Genome analysis of an inducible prophage and prophage remnantsintegrated in the Streptococcus pyogenes strain SF370. Virology302:245-58)。1. 3 Bxbl重組酶表達(dá)質(zhì)粒遵照StrataRene (La Jolla, CA)推薦的程序,將合成的DNA序列(SEQ ID NO: 5)克隆入pDual表達(dá)載體的Eam 1104 I限制性位點，該合成的DNA序列(SEQ ID NO:5)的密碼子經(jīng)優(yōu)化以用于動物細(xì)胞表達(dá)，并且編碼恥垢分枝桿菌噬菌體Bxbl 的推定重組酶(SEQ ID NO:6，Genbank 登錄號 AAG59740, Mediavilla, J.，S. Jain, etal.2000,Genome organization and characterization of mycobacteriophage Bxb1.Mol. Microbiol 38:955-70)。1. 4 Al 18重組酶表達(dá)質(zhì)粒遵照StrataRene (La Jolla, CA)推薦的程序,將合成的DNA序列(SEQ ID NO: 7)克隆入pDual表達(dá)載體的Eam 1104 I限制性位點，該合成的DNA序列(SEQ ID NO:7)的密碼子經(jīng)優(yōu)化以用于動物細(xì)胞表達(dá)，并且編碼單核細(xì)胞增生李斯特氏菌噬菌體 A118 的推定重組酶(SEQ ID NO: 8，Genbank 登錄號 CAB53817, Loessner, M. J.，R.B.1nman, et al. 2000, Complete nucleotide sequence, molecular analysis and genomestructure of bacteriophage A118 of Listeria monocytogenes:1mplications forphage evolution. Mol. Microbiol 35:324-40)。1. 5 ORyl重組酶表達(dá)質(zhì)粒遵照StrataRene (La Jolla, CA)推薦的程序,將合成的DNA序列(SEQ ID NO:9)克隆入pDual表達(dá)載體的Eam 1104 I限制性位點，該合成的DNA序列(SEQ ID NO:9)的密碼子經(jīng)優(yōu)化以用于動物細(xì)胞表達(dá)，并且編碼結(jié)核分枝桿菌噬菌體ORvl 的推定重組酶(SEQ ID NO: 10，Genbank登錄號 CAB09083, Bibb, L.A. and G. F. Hatfull2002,Integration and excision of the Mycobacterium tuberculosis prophage-likeelement, phiRvl. Mol. Microbiol 45:1515-26)。
1.6 Al 18重組酶棺物表汰質(zhì)粒將合成的DNA序列(SEQ ID NO: 7)克隆入植物表達(dá)質(zhì)粒pILTAB358的木薯葉脈花葉病毒啟動子NOS和終止子序列之間，該合成的DNA序列(SEQID NO:7)的密碼子經(jīng)優(yōu)化以用于動物細(xì)胞表達(dá)，并編碼單核細(xì)胞增生李斯特氏菌噬菌體A118 的推定重組酶(Verdaguer, B.，A. Kochko et al. 1998, Functional organization ofthe cassava vein mosaic virus (CsVMV) promoter. Plant Mol. Biol. 37:1055-67) 0pILTAB質(zhì)粒 DNA 獲自 Donald Danforth Center for Plant Research, St. Louis, MO。除了 CMV 啟動子和SV40終止子分別用木薯葉脈花葉病毒啟動子和35S終止子替換外，構(gòu)建物與在動物細(xì)胞中使用的Al 18表達(dá)質(zhì)粒類似。
分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒的設(shè)計和構(gòu)津使用質(zhì)粒 gWiz Luc (Gene Therapy Systems, San Diego, CA),構(gòu)建分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒。當(dāng)被引入哺乳動物細(xì)胞時，該質(zhì)粒在大腸桿圃中賦予卡那霉素抗性，并從CMV啟動子以組成型方式表達(dá)熒光素酶基因。在CMV啟動子和熒光素酶基因的起始密碼子之間，載體也含有獨特的Sal I和Not I限制性位點。通過在Sal I和Not I位點之間插入寡核苷酸，產(chǎn)生限制性酶Apa I和Nhe I的識別位點。合成含有重組酶的attP位點、并具有Sal I和Apa I側(cè)翼限制性位點的寡核苷酸，退火，并插入Sal和Apa I位點之間。類似地，含有attB序列的寡核苷酸被插入Nhe I和Not I位點之間。從質(zhì)粒pBS302經(jīng)PCR擴增1296bp轉(zhuǎn)錄終止或STOP序列(Genbank登錄號U51223，核苷酸193-1488)，并克隆在Apa I和NheI位點，于attP和attB位點之間。最終構(gòu)建物具有置于CMV啟動子和熒光素酶基因之間的attP、ST0P和attB序列，如圖1所示。由于attP和attB位點之間的重組，只有在STOP序列刪除之后，質(zhì)粒才會表達(dá)熒光素酶基因。下面給出了分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒的描述。1. 7 SP β c2分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒:含有SP β c2重組酶的attP位點的99bp合成的寡核苷酸序列(SEQ ID N0:ll)，1296bp STOP序列(SEQ ID NO: 12)和含有SP 3c2重組酶的attB位點的96bp合成的寡核苷酸序列(SEQ ID NO: 13),按此順序,被克隆入gWizTM Luc質(zhì)粒的CMV啟動子和熒光素酶基因之間。1. 8 SF370.1分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒:含有SF370.1重組酶的attP位點的99bp合成的寡核苷酸序列(SEQ ID N0:14)，1296bp STOP 序列(SEQ ID NO: 12)，含有 SF370.1 重組酶的attB位點的96bp合成的寡核苷酸序列(SEQ ID NO: 15)，按此順序，被克隆入gWiz Luc質(zhì)粒的CMV啟動子和熒光素酶基因之間。1. 9 Bxbl分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒:含有Bxbl重組酶的attP位點的52bp合成的寡核苷酸序列(SEQ ID N0:16)，1296bp STOP 序列(SEQ ID NO: 12)和含有 Bxbl 重組酶的 attB 位點的46bp合成的寡核苷酸序列(SEQ ID NO: 17)，按此順序，被克隆入gWiz Luc質(zhì)粒的CMV啟動子和熒光素酶基因之間。1. 10 Al 18分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒:含有Al 18重組酶的attP位點的99bp合成的寡核苷酸序列(SEQ ID N0:18)，1296bp STOP 序列(SEQ ID NO: 12)和含有 Al 18 重組酶的 attB 位點的96bp合成的寡核苷酸序列(SEQ ID NO: 19)，按此順序，被克隆入gWiz Luc質(zhì)粒的CMV啟動子和熒光素酶基因之間。1.11 ORvl分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒:含有ORvl重組酶的attP位點的99bp合成的寡核苷酸序列(SEQ ID NO: 20), 1296bp STOP 序列(SEQ ID NO: 12)和含有 ORvl 重組酶的 attB位點的96bp合成的寡核苷酸序列(SEQ ID NO: 21)，按此順序，被克隆入gWiz Luc質(zhì)粒的CMV啟動子和熒光素酶基因之間。1.12 Al 18分子內(nèi)重組試驗棺物質(zhì)粒:含有Al 18重組酶的attP位點的99bp合成的寡核苷酸序列(SEQ ID N0:18)，1296bp STOP 序列(SEQ ID NO: 12)，含有 A118 重組酶的 attB位點的96bp合成的寡核苷酸序列(SEQ ID NO: 19)和熒光素酶基因，按此順序，被克隆入PILTAB358的木薯葉脈花葉病毒啟動子和NOS終止子序列之間。
實施例2:瞬時分子內(nèi)重組試驗為了測定重組酶在哺乳動物和植物細(xì)胞中的活性，開發(fā)出瞬時試驗。簡而言之，該試驗由以下組成將重組酶基因克隆入表達(dá)質(zhì)粒，制備相應(yīng)的分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒，通過轉(zhuǎn)染將兩質(zhì)粒DNA引入細(xì)胞，并分析熒光素酶的活性。重組酶試驗質(zhì)粒包含CMV啟動子一attP:STOP:attB 一熒光素酶報道基因一終止子序列。STOP序列是轉(zhuǎn)錄終止信號序列。在重組不存在時，熒光素酶報道基因的表達(dá)被在啟動子和報道基因之間存在的STOP基因阻止。由于引入的重組酶所引起的attP和attB位點之間的重組，導(dǎo)致STOP序列的刪除和報道基因的活化。因為它是由關(guān)閉到開啟的形式，該試驗是靈敏且強大的，并且通過用發(fā)光計檢測熒光素酶發(fā)出的光，熒光素酶報道蛋白的數(shù)量可以容易地分析。圖1中用圖描述了試驗形式。
瞬時轉(zhuǎn)染和熒光素酶試驗在37°C，5%C02，將細(xì)胞維持在DMEM或所示的其他培養(yǎng)基中，其中DMEM補充以10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素(獲自Invitrogen, Carlsbad, CA)。在轉(zhuǎn)染的那天,根據(jù)使用的細(xì)胞類型，細(xì)胞以不同的密度鋪板。根據(jù)制造商的說明書(Invitrogen, Carlsbad, CA),使用Lipofectamine 2000 ,細(xì)胞單獨用分子內(nèi)重組試驗質(zhì)?；蛴梅肿觾?nèi)重組試驗質(zhì)粒和變化數(shù)量的重組酶表達(dá)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染。組成型表達(dá)的Renilla熒光素酶報道質(zhì)粒(pRL_CMV，來自Promega, Madison, WI)進行雙轉(zhuǎn)染(2ng/孔)，并用作內(nèi)部對照以使數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化(歸一化)。在轉(zhuǎn)染之后24或48小時(取決于細(xì)胞系)，棄除培養(yǎng)基，細(xì)胞用被動裂解緩沖液(passive lysis buffer) (Promega, Madison, WI)裂解。然后在裝配有注射器(DynexTechnologies, Chantilly, VA)的板式讀數(shù)器(plate reader)上,使用雙突光素酶分析試劑盒(Dual Luciferase Assay kit) (Promega, Madison, WI),分析提取物。顯示的數(shù)據(jù)是突光素酶(Luc)和Renilla熒光素酶(RLuc)活性的比率，除非另外指出。當(dāng)Luc活性(相對光單位)被比較時，觀察到類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。因為重復(fù)的數(shù)量和實驗隨不同的構(gòu)建物和細(xì)胞系而變化，標(biāo)準(zhǔn)誤差被用于指示實驗差異。
2.1在人HEK293細(xì)胞中的瞬時分子內(nèi)重組試驗細(xì)胞(20，000細(xì)胞/孔，在96-孔板中)用25ng分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒和O、10、25或75ng相應(yīng)的重組酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，并溫育24小時。細(xì)胞用50 μ I被動裂解緩沖液裂解，并分析25 μ I提取物。進行6至20次重復(fù)試驗，對Luc/RLuc的比率(平均值)土SE作圖。圖2中顯示在豎條之上的值是誘導(dǎo)倍數(shù)(fold inductions)(重組酶質(zhì)粒存在下的熒光素酶活性與重組酶質(zhì)粒不存在下的熒光素酶活性的比率)。
如圖2所示，僅僅用分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒進行的轉(zhuǎn)染顯示沒有或極少的熒光素酶活性(作為Luc/RLuc的比率給出)。增加數(shù)量的A118重組酶表達(dá)質(zhì)粒(10、25或75ng)和Al 18分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染增加熒光素酶活性。對于SF370.1、SP β c2、Φ RVl和Bxbl，也觀察到類似的結(jié)果。這些結(jié)果清楚地表明重組酶在人HEK293細(xì)胞中發(fā)揮功能。重組酶介導(dǎo)它們的attP和attB位點之間的重組，并刪除分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒上的STOP序列，激活熒光素酶基因的表達(dá)。
2.2在小鼠NIH3T3細(xì)胞中的瞬時分子內(nèi)重組試驗細(xì)胞(5，000細(xì)胞/孔，在96-孔板中)用25ng分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒和O、10、25或75ng相應(yīng)的重組酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，并溫育24小時。細(xì)胞用50 μ I被動裂解緩沖液裂解，并分析25 μ I提取物。進行2至14次重復(fù)試驗，對Luc/RLuc的比率(平均值)土SE作圖。圖3中顯示在豎條之上的值是誘導(dǎo)倍數(shù)。圖3顯示了單獨用分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒或用分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒和增加數(shù)量的(10,25或75ng)重組酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH3T3獲得的數(shù)據(jù)。重組酶質(zhì)粒和分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染將熒光素酶活性增加許多倍。例如，當(dāng)與用25ng Bxbl分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒單獨轉(zhuǎn)染相比，用25ng Bxbl分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒和75ng Bxbl重組酶表達(dá)質(zhì)粒進行的轉(zhuǎn)染增加熒光素酶活性66倍。與Bxbl類似，重組酶Al 18、SF370. l、SP0c2和ORVl也增加熒光素酶活性(圖3)，顯示了這些重組酶在小鼠NIH3T3細(xì)胞中具有功能，并且對于重組它們的attP和attB位點是有效的。
2.3在中國倉鼠卵(CHO)細(xì)胞中的瞬時分子內(nèi)重組試驗細(xì)胞(15，000細(xì)胞/孔，在96-孔板中)用25ng分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒和O、10、25或75ng相應(yīng)的重組酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，并溫育24小時。細(xì)胞用50 μ I被動裂解緩沖液裂解，并分析25 μ I提取物。進行2至8次重復(fù)試驗，對Luc/RLuc的比率(平均值)土SE作圖。圖4中顯示在豎條之上的值是誘導(dǎo)倍數(shù)。如圖4所示，僅僅用Al 181、SF370.1或ORVl的分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒進行的轉(zhuǎn)染顯示沒有或極少的熒光素酶活性。與增加數(shù)量的相應(yīng)的A118、SF370.1或ORVl重組酶表達(dá)質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染增加熒光素酶活性。這些結(jié)果清楚地表明重組酶在CHO細(xì)胞中發(fā)揮功能。重組酶介導(dǎo)它們的attP和attB位點之間的重組，并刪除分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒上的STOP序列，激活熒光素酶基因的表達(dá)。
2.4在人HeLa細(xì)胞中的瞬時分子內(nèi)重組試驗細(xì)胞(15，000細(xì)胞/孔，在96-孔板中)用25ng分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒和O、10、25或75ng相應(yīng)的重組酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,并溫育24小時。進行2至8次重復(fù)試驗,對Luc/RLuc的比率(平均值)土SE作圖。圖5中顯示在豎條之上的值是誘導(dǎo)倍數(shù)。如圖5所示，僅僅用Al 181、SF370.1或ORVl的分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒進行的轉(zhuǎn)染顯示沒有或極少的熒光素酶活性。與增加數(shù)量的相應(yīng)的A118、SF370.1或ORVl重組酶表達(dá)質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染增加熒光素酶活性。這些結(jié)果清楚地表明重組酶在HeLa細(xì)胞中發(fā)揮功能。
2.5在大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞中的瞬時分子內(nèi)重組試驗在轉(zhuǎn)染前一天，來自大鼠的初級骨髓基質(zhì)細(xì)胞以4000細(xì)胞/cm2的密度鋪板，并培 養(yǎng)在培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有50%基本培養(yǎng)基α培養(yǎng)基(aMEM)、50%F12Hams、10%FBS、l%Pen/Strep (100U/ml青霉素G和100mg/ml硫酸鏈霉素)。細(xì)胞用25ng分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒和0、50、100或200ng相應(yīng)的重組酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，并溫育48小時。細(xì)胞用50 μ I被動裂解緩沖液裂解，并分析25 μ I提取物。進行8次重復(fù)試驗，對Luc/RLuc的比率(平均值)土 SE作圖。圖6中顯示在豎條之上的值是誘導(dǎo)倍數(shù)。圖6顯示了單獨用分子內(nèi)重組試驗質(zhì)?；蛴梅肿觾?nèi)重組試驗質(zhì)粒和增加數(shù)量的(50、100*200ng)相應(yīng)的重組酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞獲得的數(shù)據(jù)。分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒和重組酶質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染將熒光素酶活性增加許多倍。例如，當(dāng)與用25ng Bxbl分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒單獨轉(zhuǎn)染相比，用25ng Bxbl分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒和200ng Bxbl重組酶表達(dá)質(zhì)粒進行的轉(zhuǎn)染增加熒光素酶活性501倍。與Bxbl類似，重組酶A118、SF370. 1、SP3 c2和ORVl也增加熒光素酶活性(圖6)，顯示了這些重組酶在大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞中具有功能，并且對于重組它們的attP和attB位點是有效的。
2.6在小鼠神經(jīng)干細(xì)胞中的瞬時分子內(nèi)重組試驗小鼠神經(jīng)干細(xì)胞C17. 2 (mNSCs)獲自 Dr. Evan Snyder of The Burnham ResearchInstitute, La Jolla, CA,并使用推薦的方案維持(Ryder, E. F. , E. Y. Snyder, et al. 1990.Establishment and characterization of multipotent neural cell lines usingretrovirus vector-mediated oncogene transfer. J. Neurobiol.，21:356-75)。在轉(zhuǎn)染前一天分開細(xì)胞，并以120，000細(xì)胞/孔的密度鋪48-孔板。過夜溫育之后，培養(yǎng)基用無血清培養(yǎng)基替換。根據(jù)制造商的說明書(Invitrogen, Carlsbad, CA),使用Lipofectamine2000 ,細(xì)胞單獨用50ng分子內(nèi)重組試驗質(zhì)?；蛴?0ng分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒和0、25、50、100或200ng重組酶表達(dá)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染。組成型表達(dá)的Renilla熒光素酶報道質(zhì)粒(pRL_CMV，來自Promega, Madison, WI)進行雙轉(zhuǎn)染(4ng/孔)，用作內(nèi)部對照，以使數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化(歸一化)。在轉(zhuǎn)染之后2天，棄除培養(yǎng)基，細(xì)胞用75 μ I被動裂解緩沖液(Promega，Madison, WI)裂解。然后在裝配有注射器(Dynex Technologies, Chantilly, VA)的板式讀數(shù)器上,使用雙突光素酶分析試劑盒(Dual Luciferase Assay kit) (Promega, Madison, WI),分析提取物(50 μ I)的熒光素酶活性和Renilla熒光素酶活性。圖7中顯示的數(shù)據(jù)是熒光素酶(Luc)和Renilla熒光素酶(RLuc)活性的比率，它是每次處理4個轉(zhuǎn)染的平均值。誤差條代表標(biāo)準(zhǔn)誤差。類似于在ΗΕΚ293、ΝΙΗ3Τ3、CH0、HeLa和大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞中觀察到的結(jié)果，重組酶A118、SF370. 1、SP β c2、ORVl和Bxbl在mNSCs中具有功能，并增加熒光素酶活性(圖7)。增加數(shù)量的(25、50、100或200ng)重組酶表達(dá)質(zhì)粒與相應(yīng)的分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒(50ng)的共轉(zhuǎn)染產(chǎn)生較高的熒光素酶活性，誘導(dǎo)倍數(shù)在72-5349范圍內(nèi)。
2.7在煙草BY2細(xì)胞中的瞬時分子內(nèi)重組試驗煙草(Nicotiana tobacum) BY2的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物在黑暗中維持在MS培養(yǎng)基中，并傳代培養(yǎng)數(shù)周(Nagata, T. , T. Nemoto, and S. Hasezawa. 1992. Tobacco BY_2cell line asthe HeIa cell in the cell biology of higher plants.1ntl. Rev. Cytol.，132:1-30)。將從培養(yǎng)3天的培養(yǎng)物制備而得的原生質(zhì)體懸浮在O. 4M甘露醇中，并分配入35mm皮氏培養(yǎng)皿中，于ImL等分試樣中Γ5Χ105細(xì)胞)。將原生質(zhì)體與質(zhì)粒DNA混合，并使用攜帶Petripulser電極的方波電穿孔系統(tǒng)(BTX, San Diego, CA, USA),以O(shè). 56K伏特電穿孔80 μ秒。細(xì)胞用10 μ g分子內(nèi)重組試驗質(zhì)粒和O或10 μ g重組酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。電穿孔之后，原生質(zhì)體用ImL 2X原生質(zhì)體培養(yǎng)基稀釋(ffatanabe, Y. , T. Meshi, and Y. Okada. 1987.1nfection of tobacco protoplasts with in vitro transcribed tobacco mosaicvirus RNA using an improved electroporation method. Virology, 192:264-272),等分為ImL培養(yǎng)物，并在27°C溫育17小時。通過冷凍融化并加入250 μ L 5X被動裂解緩沖液(Promega, Madison, WI，USA)，使原生質(zhì)體裂解。在裝配有注射器的板式讀數(shù)器上，使用雙熒光素酶分析試劑盒(Dual Luciferase Assay kit),分析20 μ L細(xì)胞提取物的突光素酶活性。圖8顯示的數(shù)據(jù)是由熒光素酶引起的相對光單位。所示的值是22個重復(fù)的平均值，并且誤差條是標(biāo)準(zhǔn)誤差。如圖8所示,僅僅用Α118分子內(nèi)重組植物試驗質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ΒΥ2細(xì)胞顯示沒有或極少的熒光素酶活性。與Α118重組酶植物表達(dá)質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染導(dǎo)致熒光素酶活性增加364倍。數(shù)據(jù)清楚地表明重組酶在植物細(xì)胞中重組attP和attB位點。
實施例3 :含有attP或attB序列的質(zhì)粒DNA穩(wěn)定整合入含有attB或attP位點的HEK293染色體在兩步過程中完成對質(zhì)粒DNA在染色體attP或attB位點上的整合的分析。在第一步驟中，產(chǎn)生含有每一酶的單拷貝attP或attB位點的穩(wěn)定細(xì)胞系，并鑒定。在第二步驟中，在重組酶表達(dá)質(zhì)粒存在下，將含有attP或attB位點的質(zhì)粒分別整合在染色體attB或
attPo
在染色體中產(chǎn)牛具有attP或attB序列的穩(wěn)定HEK293克降遵照制造商推薦的程序,在獲自Invitrogen [Carlsbad, CA (目錄編號R750-07)]的Flp-1n -293細(xì)胞中，將每一重組酶的單拷貝attP或attB序列(SEQ ID號11、13-21)引入FRT位置。在Flp-1n -293細(xì)胞中，F(xiàn)RT位置具有CMV啟動子、Flp重組酶的FRT整合位點和zeocin抗性以及β -半乳糖苷酶融合基因。這些細(xì)胞在zeocin抗生素存在下生長,并表達(dá)半乳糖苷酶標(biāo)記基因。在CMC啟動子和BGH終止子序列之間存在的多克隆位點區(qū)域，每一酶的attP或attB序列被克隆入pcDNA/FRT質(zhì)粒(Invitrogen, Carlsbad, CA,目錄編號V6010-20)。在潮霉素基因之前，pcDNA/FRT克隆質(zhì)粒具有FRT位點。潮霉素基因缺少啟動子和ATG起始密碼子。因此，將含有attP或attB位點的pcDNA/FRT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入哺乳動物細(xì)胞中不會賦予潮霉素抗性。只有在用Flp重組酶表達(dá)質(zhì)粒(pCG44, Invitrogen, Carlsbad, CA)共轉(zhuǎn)染之后，pcDNA/FRT質(zhì)粒的整合發(fā)生在Flp-1n -293細(xì)胞的FRT位置。整合導(dǎo)致獲得潮霉素抗性，失去zeocin抗性和β_半乳糖苷酶表達(dá)。該程序如圖9所圖示。
將含有attP或attB的pcDNA/FRT質(zhì)粒DNA整合入Flp-1n -293細(xì)胞，并針對每一 attP或attB位點，在含有潮霉素的培養(yǎng)基上選擇克隆系。如所期望地，這些細(xì)胞喪失β -半乳糖苷酶活性并對zeocin敏感。在FRT位置含有attP或attB序列的pcDNA/FRT質(zhì)粒的存在也得到PCR證實(圖10)。在PCR分析中，通過使用結(jié)合attP或attB的引物，和結(jié)合相鄰FRT位置序列的另一引物，我們檢測attP或attB序列在基因組FRT位置上的整合。因此，只有如果attP或attB位點被整合入染色體，克隆將是PCR陽性的。如所期望地，選擇的克隆系對于attP或attB是陽性的。對于每一測試的重組酶，PCR沒有擴增分離自Flp-1n -293細(xì)胞的基因組DNA的特定帶(圖10中，圖面C，泳道P)，但是擴增了分離自整合有含attP或attB的pcDNA/FRT質(zhì)粒的細(xì)胞的DNA的帶(圖10中，圖面C，泳道I)。攜帶attP或attB位點的穩(wěn)定的293細(xì)胞被用于分別整合含有attB或attP位點的質(zhì)粒。
將質(zhì)粒DNA整合在染色體attP或attB位點通過將每一重組酶的attP或attB序列置于緊靠嘌呤霉素抗性基因之前，構(gòu)建整合試驗質(zhì)粒。在質(zhì)粒中，嘌呤霉素基因沒有自己的啟動子。然而，染色體上的attP和整合試 驗質(zhì)粒上的attB (或染色體上的attB和試驗質(zhì)粒上的attP)之間的重組將嘌呤霉素基因整合至CMV啟動子旁邊，CMV啟動子存在于緊靠上面產(chǎn)生的Flp-1n -293細(xì)胞中的attP或attB位點之前(圖9)。整合將導(dǎo)致嘌呤霉素基因表達(dá)，并導(dǎo)致這樣的細(xì)胞在嘌呤霉素抗生素存在下生長。并不期望試驗質(zhì)粒的隨機整合提供對嘌呤霉素的抗性。使用標(biāo)準(zhǔn)方案，含有attP序列的Flp-1n -293穩(wěn)定細(xì)胞系，用含有attB位點的整合試驗質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，用或不用相應(yīng)的重組酶表達(dá)質(zhì)粒。在另一例子中，產(chǎn)生具有穩(wěn)定整合的attB序列的Flp-1n -293穩(wěn)定細(xì)胞系，并用于整合含attP的整合試驗質(zhì)粒。含染色體attP或attB位點的Flp-1n -293細(xì)胞(150，000至300，000個細(xì)胞)用IOOng整合試驗質(zhì)粒和400ng重組酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。然后在含有嘌呤霉素抗生素的培養(yǎng)基上選擇細(xì)胞。如果重組酶有功能，那么含有attB序列的質(zhì)粒倍期望整合在染色體的attP位點上，或反之亦然。在3個獨立的實驗中，在用含有attP-或attB-的整合試驗質(zhì)粒和相應(yīng)的重組酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染之后，從含有attB或attP位點的Flp-1n -293細(xì)胞獲得的大量嘌呤霉素抗性克隆顯示在下表I和3中。在缺少重組酶質(zhì)粒時，沒有觀察到嘌呤霉素抗性克隆。這些結(jié)果清楚地顯示，重組酶促進染色體attP或attB位點和質(zhì)粒attB或attP位點之間的重組,導(dǎo)致質(zhì)粒DNA整合入染色體。通過從嘌呤霉素抗性克隆分離染色體DNA，我們也確認(rèn)質(zhì)粒整合，并檢測染色體上attL和attR位點的存在。attB和attP之間的重組導(dǎo)致產(chǎn)生attL和attR位點，其是attB和attP之間的雜合位點。使用attL或attR特定引物的PCR擴增僅在試驗質(zhì)粒整合之后的嘌呤霉素抗性克隆中擴增期望的特定帶(圖10，圖面A和圖面B的泳道I)，但是在含有attP或attB的、用于整合的親本細(xì)胞中沒有擴增(圖10，圖面A和圖面B的泳道P)。
表1.含有attP的質(zhì)粒整合入攜帶attB位點的染色體中
權(quán)利要求
1.在真核細(xì)胞中獲得位點特異性重組的方法，所述方法包括提供包含第一重組位點和第二重組位點的分離的真核細(xì)胞；將所述第一和第二重組位點與原核重組酶多肽接觸，從而在所述重組位點之間產(chǎn)生重組，其中所述重組酶多肽能夠介導(dǎo)所述第一和第二重組位點之間的重組，所述第一重組位點是噬菌體基因組重組附著位點(attP)或細(xì)菌基因組重組附著位點(attB)，所述第二重組位點是attB或attP，所述重組酶選自化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)卩遼菌體重組酶或枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)卩遼菌體重組酶，條件是當(dāng)?shù)谝恢亟M附著位點是attB時，所述第二重組附著位點是attP ;當(dāng)?shù)谝恢亟M附著位點是attP時,第二重組附著位點是attB。
2.在真核細(xì)胞中獲得位點特異性重組的方法，所述方法包括提供包含第一重組位點和第二重組位點的分離的真核細(xì)胞；將所述第一和第二重組位點與原核重組酶多肽接觸，從而在所述重組位點之間產(chǎn)生重組，其中所述重組酶多肽能夠介導(dǎo)所述第一和第二重組位點之間的重組，所述第一重組位點是attP或attB，所述第二重組位點是假附著位點，所述重組酶選自化膿性鏈球菌噬菌體重組酶或者枯草芽孢桿菌噬菌體重組酶。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述重組酶多肽選自SF370.1重組酶或者SP β c2重組酶。
4.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述重組酶多肽由可操縱性地連接至啟動子的多核苷酸所編碼，所述啟動子介導(dǎo)所述多核苷酸在所述真核細(xì)胞中的表達(dá)。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其中，通過編碼所述重組酶多肽的多核苷酸的表達(dá)，將所述重組酶多肽導(dǎo)入所述真核細(xì)胞中。
6.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述重組酶多肽作為多肽被導(dǎo)入所述真核細(xì)胞中。
7.權(quán)利要求1或2的方法，其中，借助編碼所述重組酶多肽的信使RNA，將所述重組酶多肽導(dǎo)入所述真核細(xì)胞中。
8.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述位點特異性重組導(dǎo)致DNA的整合、刪除、倒位、易位或交換。
9.獲得具有穩(wěn)定整合的多核苷酸序列的真核細(xì)胞的方法，所述方法包括將多核苷酸導(dǎo)入包含第一重組attB或attP位點的真核細(xì)胞，其中所述多核苷酸包含核酸序列和第二重組attP或attB位點；將所述第一和所述第二重組位點與原核重組酶多肽接觸，其中所述重組酶多肽能夠介導(dǎo)所述第一重組位點和第二重組位點之間的位點特異性重組，并且所述重組酶選自化膿性鏈球菌噬菌體重組酶或者枯草芽孢桿菌噬菌體重組酶，條件是當(dāng)所述第一重組位點是attB時,所述第二重組位點是attP ；當(dāng)所述第一重組位點是attP時,所述第二重組位點是attB。
10.獲得具有穩(wěn)定整合的多核苷酸序列的真核細(xì)胞的方法，所述方法包括將多核苷酸導(dǎo)入包含第一重組假附著位點的真核細(xì)胞，其中所述多核苷酸包含核酸序列和第二重組attP或attB位點；將所能夠介導(dǎo)所述第一重組位點和所述第二重組位點之間的位點特異性重組，并且所述重組酶選自化膿性鏈球菌噬菌體重組酶或者枯草芽孢桿菌噬菌體重組酶。
11.權(quán)利要求9或10的方法，其中所述重組酶多肽選自SF370.1重組酶或者SP 0c2重組酶。
12.權(quán)利要求9或10的方法，其中所述編碼重組酶的多核苷酸可操縱性地連接至啟動子，所述啟動子介導(dǎo)所述多核苷酸在所述真核細(xì)胞中的表達(dá)。
13.權(quán)利要求9或10的方法，其中，通過編碼所述重組酶多肽的多核苷酸的表達(dá)，將所述重組酶多肽導(dǎo)入所述真核細(xì)胞中。
14.權(quán)利要求9或10的方法，其中所述重組酶多肽作為多肽被導(dǎo)入所述真核細(xì)胞中。
15.權(quán)利要求9或10的方法，其中，通過編碼所述重組酶多肽的RNA的表達(dá)，將所述重組酶多肽導(dǎo)入所述真核細(xì)胞中。
16.在真核細(xì)胞中獲得位點特異性重組的方法，所述方法包括提供包含第一重組位點和第二重組位點的真核細(xì)胞，具有側(cè)翼為第三重組位點和第四重組位點的多核苷酸序列；將所述重組位點與原核重組酶多肽接觸，從而在所述重組位點之間產(chǎn)生重組，其中所述重組酶多肽能夠介導(dǎo)所述第一和第三重組位點以及所述第二和第四重組位點之間的重組，所述第一和第二重組位點是attP或attB,所述第三和第四重組位點是attB或attP,所述重組酶選自化膿性鏈球菌噬菌體重組酶或者枯草芽孢桿菌噬菌體重組酶，條件是當(dāng)所述第一和第二重組附著位點是attB時，所述第三和第四重組附著位點是attP，當(dāng)所述第一和第二重組附著位點是attP時，所述第三和第四重組附著位點是attB。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述重組酶多肽選自SF370.1重組酶或者SP β c2重組酶。
18.權(quán)利要求16的方法，其中，通過編碼所述重組酶多肽的多核苷酸的表達(dá)將所述重組酶多肽導(dǎo)入所述真核細(xì)胞中。
19.權(quán)利要求16的方法，其中所述重組酶多肽作為多肽被導(dǎo)入所述真核細(xì)胞中。
20.權(quán)利要求16的方法，其中，通過編碼所述重組酶多肽的信使RNA將所述重組酶多肽導(dǎo)入所述真核細(xì)胞中。
21.在真核細(xì)胞中獲得多位點特異性重組的方法，所述方法包括提供包含第一重組位點和第二重組位點以及第三重組位點和第四重組位點的真核細(xì)胞；將所述第一重組位點和第二重組位點與第一原核重組酶多肽接觸，將所述第三和第四重組位點與第二原核重組酶多肽接觸；產(chǎn)生在所述第一和第二重組位點之間的重組以及所述第三和第四重組位點之間的重組,其中所述第一重組酶多肽能夠介導(dǎo)第一重組位點和第二重組位點之間的重組,所述第二重組酶多肽能夠介導(dǎo)所述第三重組位點和第四重組位點之間的重組，所述第一和第二重組酶選自化膿性鏈球菌噬菌體重組酶或者枯草芽孢桿菌噬菌體重組酶，條件是所述第一重組酶多肽和所述第二重組酶多肽是不同的。
22.權(quán)利要求21的方法，還包括第五重組位點和第六重組位點以及第三重組酶多肽，其中所述第三重組酶多肽能夠介導(dǎo)所述第五和第六重組位點之間的重組，條件是所述第三重組酶多肽與所述第一和所述第二重組酶多肽是不同的。
23.進行位點特異性重組的方法，所述方法包括提供第一重組位點和第二重組位點；將所述第一重組位點和第二重組位點與原核重組酶多肽接觸，導(dǎo)致在所述重組位點之間產(chǎn)生重組，其中所述重組酶多肽能夠介導(dǎo)所述第一重組位點和第二重組位點之間的重組，所述第一重組位點是attP或attB,所述第二重組位點是attB或attP,所述重組酶選自化膿性鏈球菌噬菌體重組酶或者枯草芽孢桿菌噬菌體重組酶，條件是當(dāng)所述第一重組附著位點是attB時，所述第二重組附著位點是attP，當(dāng)所述第一重組附著位點是attP時，所述第二重組附著位點是attB。
24.載體，用于位點特異性地將多核苷酸序列整合入分離的真核細(xì)胞的基因組，所述載體包括感興趣的多核苷酸和第二重組attB或attP位點，其中所述第二重組attB或attP位點包括與處于所述分離的真核細(xì)胞基因組中的第一重組attP或attB位點或假attP或假attB位點進行重組的多核苷酸序列，并且所述重組在位點特異性重組酶存在下發(fā)生，所述位點特異性重組酶選自化膿性鏈球菌噬菌體重組酶或者枯草芽孢桿菌噬菌體重組酶，條件是當(dāng)所述第一重組位點是attB或假attB時,所述第二重組位點是attP,當(dāng)所述第一重組位點是attP或假attP時,所述第二重組位點是attB。
25.權(quán)利要求24的載體，其中所述重組酶選自SF370.1重組酶或者SP β c2重組酶。
26.權(quán)利要求24的載體，其中所述感興趣的多核苷酸可操縱性地連接至啟動子，所述啟動子介導(dǎo)所述多核苷酸在所述真核細(xì)胞中的表達(dá)。
27.真核細(xì)胞，包括原核重組酶多肽或編碼原核重組酶的核酸，其中所述重組酶能夠介導(dǎo)第一重組位點和第二重組位點之間的位點特異性重組，所述第二重組位點能夠作為與所述第一重組位點進行重組的底物,其中所述第一重組位點是attP、假attP、attB或假attB，所述第二重組位點是attB、假attB、attP或假attP,所述重組酶選自化膿性鏈球菌曬菌體重組酶或者枯草芽孢桿菌噬菌體重組酶，條件是當(dāng)所述第一重組位點是attB時，所述第二重組位點是attP或假attP ；當(dāng)所述第一重組位點是假attB時,所述第二重組位點是attP ；當(dāng)所述第一重組位點是attP時,所述第二重組位點是attB或假attB ;當(dāng)?shù)谝恢亟M位點是假attP時,所述第二重組位點是attB。
28.權(quán)利要求27的分離的真核細(xì)胞，其中所述重組酶多肽選自SF370.1重組酶或者SP^c2重組酶。
29.位點特異性地將感興趣的多核苷酸整合入轉(zhuǎn)基因?qū)ο蟮幕蚪M中的方法，其中所述基因組包含第一重組attB或attP位點或假attB或假attP位點，所述方法包括引入包含感興趣的多核苷酸和第二重組attP或attB位點的核酸；將所述第一和所述第二重組位點與原核重組酶多肽接觸，其中所述重組酶多肽能夠介導(dǎo)所述第一重組位點和第二重組位點之間的位點特異性重組，所述重組酶選自化膿性鏈球菌噬菌體重組酶或者枯草芽孢桿菌曬菌體重組酶，條件是當(dāng)?shù)谝恢亟M位點是attB或假attB時,所述第二重組位點是attP,當(dāng)所述第一重組位點是attP或假attP時,所述第二重組位點是attB。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述重組酶多肽選自SF370.1重組酶或者SP β c2重組酶。
31.分離的多核苷酸序列，包括與選自下列的核酸序列具有至少90%同一性的核酸SEQ BD NO:1或者SEQ ID NO: 3，其中所述核酸具有重組酶活性。
32.分離的多核苷酸序列，包括選自SEQID NO:1或者SEQ ID N0:3的核酸序列。
33.分離的多核苷酸序列，包括與選自下列的核酸序列具有至少90%同一性的核酸序列SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14 或 SEQ ID NO:15。
34.分離的多核苷酸序列，包括選自SEQED NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID N0:14或SEQ ID NO: 15的核酸序列。
35.分離的多核苷酸序列，包括選自下列的核酸序列a)編碼SPPc2重組酶的核酸序列；和b)編碼SF370.1重組酶的核酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了在真核細(xì)胞中獲得位點特異性重組的方法，所述方法包括提供包含第一重組附著位點和第二重組附著位點的真核細(xì)胞；將所述第一和第二重組附著位點與原核重組酶多肽接觸，導(dǎo)致在所述重組附著位點之間產(chǎn)生重組，其中重組酶多肽能夠介導(dǎo)第一和第二重組附著位點之間的重組。本發(fā)明也描述了用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、組織、植物和動物的組合物、載體和其使用方法。本發(fā)明的組合物、載體和方法也可用于基因治療用途。
文檔編號C12N5/10GK102994492SQ20121040076
公開日2013年3月27日 申請日期2005年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月2日
發(fā)明者M·帕迪達(dá)姆 申請人:英特拉克森公司