專利名稱：一種高密度培養(yǎng)基因工程菌制備褐藻膠裂解酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種裂解酶的制備方法，尤其是一種高密度培養(yǎng)基因工程菌制備褐藻膠裂解酶的方法。
背景技術(shù)：
褐藻膠又稱海藻酸鈉，它是從海帶、馬尾藻、巨藻等褐藻植物中提取的天然高分子多糖聚合物，是褐藻細(xì)胞壁的主要組成物質(zhì)之一；由a -L-1, 4-古羅糖醛酸(G)及其差向異構(gòu)體β-D-1，4-甘露糖醛酸(M)組合而成。褐藻膠分子中包含三種結(jié)構(gòu)區(qū)域多聚古羅糖醛酸(poly(G))、多聚古羅糖醛酸(poly(M))和雜聚的隨機(jī)序列(poly(MG))。近年來，隨著海洋生物制藥業(yè)的蓬勃發(fā)展，海藻多糖的研究日益受到重視，并且隨著海藻寡糖具有促生長、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抑菌、抗氧化、整腸、解毒、降血糖血脂、免 疫調(diào)節(jié)等多種生理活性的發(fā)現(xiàn)，海藻寡糖在生物醫(yī)藥領(lǐng)域巨大的應(yīng)用潛力也越來越受到關(guān)注。褐藻膠裂解酶能通過消除反應(yīng)裂解褐藻膠的糖苷鍵，產(chǎn)生在非還原末端有C4, 5不飽和雙鍵且在23(T240nm有強(qiáng)吸收功能的不飽和糖類醛酸、以及飽和單糖醛酸。根據(jù)降解褐藻膠部位與片段的不同可以分為三大類專一性水解聚古羅糖醛酸的1，4-α_古羅糖醛酸裂解酶(EC 4. 2. 2. 11);專一性水解聚甘露糖醛酸的1，4-β -甘露糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.3);第三類是既可降解聚古羅糖醛酸，也可降解聚甘露糖醛酸褐藻膠裂解酶。褐藻膠裂解酶越來越多地被應(yīng)用于分子生物學(xué)、海洋生物學(xué)、醫(yī)藥、化工、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，褐藻膠裂解酶日益成為海洋生物資源研究開發(fā)的競爭熱點。已有研究表明褐藻膠裂解酶是研究褐藻膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及細(xì)菌的褐藻膠代謝等方面的必備工具酶；褐藻膠裂解酶還用作海藻解壁酶，以獲得DNA、單細(xì)胞和原生質(zhì)體。此外，褐藻膠裂解酶本身具有一定藥用價值，能降解綠膿桿菌的生物膜，恢復(fù)病原菌對抗生素的敏感性，可用于輔助治療綠膿桿菌引起的慢性感染，治療肺部囊性纖維化(CysticFibrosis, CF)。因此褐藻膠裂解酶的研究生產(chǎn)有著深遠(yuǎn)的理論意義和應(yīng)用價值，已成為目前的熱點。同時，隨著近年來褐藻膠裂解酶越來越多的應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工、農(nóng)業(yè)、分子生物學(xué)、海洋生物學(xué)等領(lǐng)域，褐藻膠裂解酶日益成為海洋生物資源研究開發(fā)競爭的熱點。目前，國內(nèi)外對于褐藻膠及其裂解酶的研究主要集中在一下幾個方面I、褐藻膠降解工藝的研究；2、褐藻寡糖的功能性研究；3、褐藻膠裂解酶的分子生物學(xué)研究等幾個方面。到現(xiàn)在為止，國內(nèi)外市場均未見有褐藻膠裂解酶制劑的產(chǎn)品，并且對于褐藻膠裂解酶的制備、生產(chǎn)方面的研究報道也較少，即使進(jìn)行了相關(guān)的研究，得到的褐藻膠裂解酶的活性較低，不能滿足深入研究及工業(yè)生產(chǎn)使用的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)在已經(jīng)報道的褐藻膠裂解酶基因工程菌搖瓶發(fā)酵制備的酶活性較低的問題，提供一種利用基因工程菌制備褐藻膠裂解酶，并提高其活性的方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下這種利用褐藻膠裂解酶基因工程菌的高密度培養(yǎng)生產(chǎn)褐藻膠裂解酶的方法步驟如下I)將褐藻膠裂解酶基因工程菌從保藏的甘油管取出接種于LB液體培養(yǎng)基中，35-370C，轉(zhuǎn)速為150r/min，培養(yǎng)10_12h，得到活化液菌種；2)將上述活化液菌種轉(zhuǎn)接至LB種子培養(yǎng)基中，在35-37°C，轉(zhuǎn)速為150r/min，搖瓶培養(yǎng)10-12h，得到種子液； 3)將上述2%種子液轉(zhuǎn)接至含有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，待發(fā)酵到第4h時開始流加補(bǔ)充培養(yǎng)基；并在發(fā)酵到第4. 5h后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)；發(fā)酵過程中發(fā)酵罐的參數(shù)設(shè)定為溫度35-37°C，轉(zhuǎn)速280rpm/min，溶氧40%_50%，發(fā)酵24h，得到發(fā)酵液；4)將上述發(fā)酵液在4°C下、經(jīng)12000rpm/min離心IOmin去除上清液,收集菌體,將菌體在冰浴下進(jìn)行超聲波破碎,超聲波破碎液在4°C下、12000rpm/min離心IOmin去除細(xì)胞碎片沉淀，收集上清液得到粗酶液。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成物包括葡萄糖10g/L，酵母提取物5g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO4 5g/L，K2HPO4 3. 5g/L，(NH4) 2HP04 4. 0 K2HPO4, MgSO4 · 7H201. 2g/L，檸檬酸 I. 7g/L ;以及微量元素液lml/L,卡那霉素10mg/ml600y I。其中所述的微量元素液的組成物包括=FeSO4 · 7H20 I. Og/L, ZnSO4 · 7H200. 225g/L, (NH4)6MO · 4H20 0. 15g/L, CuSO4 · H2O 0. 15g/L, CaCl2 · H2O 0. 2g/L, MnSO4 · H2O 0. 05g/L,Na2B4O4 · H2O 0. 002g/L 組成。所述的補(bǔ)充培養(yǎng)基的組成物包括葡萄糖150g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物IOg/L，MgSO4 · 7H20 I. 2g/L配制，并將補(bǔ)充培養(yǎng)基的pH控制在7. O 7. 2。所述的超聲波破碎的條件為菌液體積50ml，NaCl濃度為O. 15mol/l,破碎強(qiáng)度50%，總工作時間5min,工作/間歇時間為4s/8s。本發(fā)明的優(yōu)點是菌種易培養(yǎng)、發(fā)酵時間短，褐藻膠裂解酶重組蛋白的表達(dá)率高，含雜蛋白少，經(jīng)過超聲破碎并離心后得到褐藻膠裂解酶粗酶液。產(chǎn)品的活性高，穩(wěn)定性好，能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)的褐藻膠裂解酶的工作溫度范圍為30-37° C，最佳反應(yīng)溫度為35° C，反應(yīng)pH 6. (Γ7. 5，最佳pH6. 6，Ca2+、Mg2+是重組褐藻膠裂解酶激活劑，而Ba2+、Zn2+起到抑制作用，螯合劑EDTA較強(qiáng)地抑制重組褐藻膠裂解酶活性，該褐藻膠裂解酶屬于金屬酶。經(jīng)過高密度發(fā)酵后制取粗酶液，酶活力達(dá)26. 37U/ml。


圖I為重組大腸桿菌的分批發(fā)酵示意圖；圖2為重組大腸桿菌的分批補(bǔ)料發(fā)酵示意圖。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖進(jìn)一步闡述本發(fā)明，并給出本發(fā)明的實施例。這種利用褐藻膠裂解酶基因工程菌的高密度培養(yǎng)生產(chǎn)褐藻膠裂解酶的方法步驟如下I)將褐藻膠裂解酶基因工程菌從保藏的甘油管接種于LB液體培養(yǎng)基中，35-370C，轉(zhuǎn)速為150r/min，培養(yǎng)10_12h，得到活化液菌種；2)將上述活化液菌種轉(zhuǎn)接至LB種子培養(yǎng)基中，在35-37°C，轉(zhuǎn)速為150r/min，搖瓶培養(yǎng)10-12h，得到種子液； 3)將上述2%種子液轉(zhuǎn)接至含有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，待發(fā)酵到第4h時開始流加補(bǔ)充培養(yǎng)基；并在發(fā)酵到第4. 5h后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)；發(fā)酵過程 中發(fā)酵罐的參數(shù)設(shè)定為溫度35-37°C，轉(zhuǎn)速280rpm，溶氧40%_50%，發(fā)酵24h，得到發(fā)酵液；4)將上述發(fā)酵液在4°C下、12000rpm/min離心IOmin去除上清液,收集菌體,將菌體在冰浴下進(jìn)行超聲波破碎,超聲波破碎液在4°C下、12000rpm/min離心IOmin去除細(xì)胞碎片沉淀，收集上清液得到粗酶液。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成以g/L為單位計葡萄糖10g/L，酵母提取物5g/L，蛋白胨 20g/L，K2HPO4 5g/L, K2HPO4 3. 5g/L, (NH4)2HPO4 4.0 K2HPO4, MgSO4 · 7H20 1.2g/L，檸檬酸
I.7g/L ;微量元素液(11111/1)，卡那霉素(1011^/1111)60(^1。其中所述的微量元素液由FeSO4 · 7H20 I. Og/L, ZnSO4 · 7H20 O. 225g/L，(NH4)6MO · 4H20 0. 15g/L, CuSO4 · H2O 0. 15g/L, CaCl2 · H2O 0. 2g/L, MnSO4 · H2OO. 05g/L,Na2B4O4 · H2O 0. 002g/L。所述的補(bǔ)充培養(yǎng)基的組成以g/L為單位計，并按葡萄糖150g/L,蛋白胨20g/L,酵母提取物10g/L，MgSO4 · 7H20 I. 2g/L配制，并將補(bǔ)充培養(yǎng)基的ρΗ7. (Γ7. 2。所述的超聲波破碎的條件為菌液體積50ml，NaCl濃度為O. 15mol/l,破碎強(qiáng)度50%，總工作時間5min,工作/間歇時間為4s/8s。實施例I褐藻膠裂解酶基因工程菌的分批發(fā)酵I生物反應(yīng)器以下實施例使用的發(fā)酵罐為上海國強(qiáng)生化工程裝備有限公司生產(chǎn)的FMG-5L發(fā)酵罐。2發(fā)酵培養(yǎng)基按以下配料葡萄糖10g/l，酵母提取物510g/l，蛋白胨2010g/l，K2HP04510g/l,KH2PO4 3. 510g/l, (NH4)2HPO4 4. 010g/l，MgSO4 · 7H20 I. 210g/l，檸檬酸 I. 710g/l，微量元素液(lml/L)，卡那霉素(lOmg/ml) 600 μ I。其中微量元素液(g/L) :FeS04 · 7Η20 1.0,ZnSO4 ·7Η20 O. 225，(NH4) 6Μ0 · 4Η200· 15，CuSO4 ·Η20 O. 15，CaCl2 ·Η20 O. 2，MnSO4 ·Η20 O. 05，Na2B4O4 · H2O O. 002，Η20 IOOOml ;組成發(fā)酵培養(yǎng)基。3發(fā)酵培養(yǎng)將含表達(dá)褐藻膠裂解酶重組質(zhì)粒的工程菌E. coli BL21在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，按2%接種量接種于LB培養(yǎng)基中，150r/mim，35-37°C，培養(yǎng)10h，0D600約O. 7-0. 8。搖瓶培養(yǎng)后的種子液按5%的接種量接種于5L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基體積為3L。控制的幾個關(guān)鍵參數(shù)為溶氧量控制在30%-40%，轉(zhuǎn)速280rpm ;在第5h加入lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)前發(fā)酵溫度自動控制在35-37°C，誘導(dǎo)后發(fā)酵溫度設(shè)定為30°C ;發(fā)酵進(jìn)行24h。重組大腸桿菌的菌體密度在12h達(dá)到最大，OD600為10. 83，細(xì)胞干重(DCW) 5. 95g/L。4酶液制備將上述發(fā)酵液在4°C下、經(jīng)12000rpm離心IOmin去除上清液，收集菌體，將菌體在冰浴下進(jìn)行超聲波破碎，超聲波破碎液在4°C下、12000rpm離心IOmin去除細(xì)胞碎片沉淀，收集上清液得到粗酶液。利用紫外吸收法測定粗酶液的酶活，達(dá)4. 81U/ml，發(fā)酵過程曲線見圖I。實施例2褐藻膠裂解酶基因工程菌的分批補(bǔ)料發(fā)酵I生物反應(yīng)器同實施例I中“I”。 2發(fā)酵培養(yǎng)基按以下配料葡萄糖10g/l，酵母提取物510g/l，蛋白胨2010g/l，K2HP04510g/l,KH2PO4 3. 510g/l, (NH4)2HPO4 4. 010g/l，MgSO4 · 7H20 I. 210g/l，檸檬酸 I. 710g/l，微量元素液(lml/L)，卡那霉素(10mg/ml) 600l·! I。其中微量元素液(g/L) :FeS04 · 7H20 1.0,ZnSO4 ·7Η20 O. 225，(NH4) 6Μ0 · 4Η200· 15，CuSO4 ·Η20 O. 15，CaCl2 ·Η20 O. 2，MnSO4 ·Η20 O. 05，Na2B4O4 · H2O O. 002，Η20 IOOOml ;組成發(fā)酵培養(yǎng)基。3補(bǔ)充培養(yǎng)基按葡萄糖150g，蛋白胨 20g，酵母提取物 10g，MgS04*7H20 I. 2g, H201000ml,pH7. 0-7. 2組成補(bǔ)充培養(yǎng)基。4發(fā)酵培養(yǎng)將含表達(dá)褐藻膠裂解酶重組質(zhì)粒的工程菌E. coli BL21在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，按2%接種量接種于LB培養(yǎng)基中，150r/mim，37°C，培養(yǎng)10h, 0D600約O. 7-0. 8。搖瓶培養(yǎng)后的種子液按5%的接種量接種于5L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基體積為3L?？刂频膸讉€關(guān)鍵參數(shù)為溶氧量控制在30%-40%，轉(zhuǎn)速280rpm ;在第5h加入lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)前發(fā)酵溫度自動控制在35-37°C，誘導(dǎo)后發(fā)酵溫度設(shè)定為30°C ;發(fā)酵進(jìn)行24h。重組大腸桿菌的菌體密度在12h達(dá)到最大，OD600為10. 83，細(xì)胞干重(DCW) 5. 95g/L。從第4h開始流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，4-10h的流加速率為100ml/h，10_16h加速率設(shè)定為200ml/h。補(bǔ)料期間仍然流加30%( v/v)的氨水保持pH穩(wěn)定；使pH保持在7. 0-7. 2，溶氧量控制在30%-40%，轉(zhuǎn)速400rpm ;溫度設(shè)定為37°C。在第24h獲得細(xì)胞密度OD6tltl值為99. 24。5酶液制備將上述發(fā)酵液在4°C下、經(jīng)12000rpm離心IOmin去除上清液，收集菌體，將菌體在冰浴下進(jìn)行超聲波破碎，超聲波破碎液在4°C下、12000rpm離心IOmin去除細(xì)胞碎片沉淀，收集上清液得到粗酶液。利用紫外吸收法測定粗酶液的酶活，達(dá)14. 81U/ml，發(fā)酵過程曲線見圖2。實施例3褐藻膠裂解酶基因工程菌的分批補(bǔ)料發(fā)酵過程中IPTG誘導(dǎo)條件的優(yōu)化I生物反應(yīng)器同實施例I中“I”。2發(fā)酵培養(yǎng)基按以下配料葡萄糖10g/l，酵母提取物510g/l，蛋白胨2010g/l，K2HP04510g/l,KH2PO4 3. 510g/l, (NH4)2HPO4 4. 010g/l，MgSO4 · 7H20 I. 210g/l，檸檬酸 I. 710g/l，微量元素液(lml/L)，卡那霉素(10mg/ml) 600l·! I。其中微量元素液(g/L) :FeS04 · 7H20 1.0,ZnSO4 ·7Η20 0. 225，(NH4) 6M0 · 4Η200· 15，CuSO4 ·Η20 O. 15，CaCl2 ·Η20 O. 2，MnSO4 ·Η20 O. 05，Na2B4O4 · H2O O. 002，Η20 IOOOml ;組成發(fā)酵培養(yǎng)基。3補(bǔ)充培養(yǎng)基按葡萄糖150g，蛋白胨 20g，酵母提取物 10g，MgS04*7H20 I. 2g, H201000ml,pH7. 0-7. 2組成補(bǔ)充培養(yǎng)基。4發(fā)酵培養(yǎng)將含表達(dá)褐藻膠裂解酶重組質(zhì)粒的工程菌E. coli BL21在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，按2%接種量接種于LB培養(yǎng)基中，150r/mim，37°C，培養(yǎng)10h, 0D600約O. 7-0. 8。搖瓶培養(yǎng) 后的種子液按5%的接種量接種于5L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基體積為3L。控制的幾個關(guān)鍵參數(shù)為溶氧量控制在30%-40%，轉(zhuǎn)速280rpm ;在第5h加入lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)前發(fā)酵溫度自動控制在35-37°C，誘導(dǎo)后發(fā)酵溫度設(shè)定為30°C ;發(fā)酵進(jìn)行24h。重組大腸桿菌的菌體密度在12h達(dá)到最大，OD600為10. 83，細(xì)胞干重(DCW) 5. 95g/L。從第4h開始流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，4-10h的流加速率為100ml/h，10_16h加速率設(shè)定為200ml/h。補(bǔ)料期間仍然流加30%( v/v)的氨水保持pH穩(wěn)定；使pH保持在7. 0-7. 2，溶氧量控制在30%-40%，轉(zhuǎn)速400rpm ;溫度設(shè)定為37°C。在第24h獲得細(xì)胞密度OD6tltl值為99. 24。5 IPTG誘導(dǎo)條件的優(yōu)化(I)單因素試驗——誘導(dǎo)時間在重組大腸桿菌的分批補(bǔ)料發(fā)酵過程，在誘導(dǎo)溫度為30° C，IPTG濃度為Immol/L的情況下，分別在第2、4、8、12、16h進(jìn)行誘導(dǎo)后，分批發(fā)酵30h，考察誘導(dǎo)時間對褐藻膠裂解酶高效表達(dá)的影響。(2 )單因素試驗——IPTG濃度在重組大腸桿菌的分批補(bǔ)料發(fā)酵過程，在誘導(dǎo)溫度為30° C，誘導(dǎo)時間為4h的情況下，分別以IPTG終濃度為O. 2、O. 4、O. 6、O. 8、I. OmmoI/L對重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分批發(fā)酵30h，考察誘導(dǎo)時間對褐藻膠裂解酶高效表達(dá)的影響。(3)單純形優(yōu)化法根據(jù)單因素試驗結(jié)果進(jìn)行單純形優(yōu)化試驗，利用均勻設(shè)計表構(gòu)造初始單純形，分別進(jìn)行重組大腸桿菌分批補(bǔ)料發(fā)酵試驗。6酶液制備同實施例I中“4”進(jìn)行。最終，測得發(fā)酵過程中最高酶活為26. 37U/ml。
權(quán)利要求
1.一種利用褐藻膠裂解酶基因工程菌的高密度培養(yǎng)生產(chǎn)褐藻膠裂解酶的方法步驟如下 1)將褐藻膠裂解酶基因工程菌從保藏的甘油管接種于LB液體培養(yǎng)基中，35-37°C，轉(zhuǎn)速為150r/min，培養(yǎng)10_12h，得到活化液菌種； 2)將上述活化液菌種轉(zhuǎn)接至LB種子培養(yǎng)基中，在35-37°C，轉(zhuǎn)速為150r/min，搖瓶培養(yǎng)10-12h，得到種子液； 3)將上述2%種子液轉(zhuǎn)接至含有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，待發(fā)酵到第4h時開始流加補(bǔ)充培養(yǎng)基；并在發(fā)酵到第4. 5h后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)；發(fā)酵過程中發(fā)酵罐的參數(shù)控制為溫度35-37°C，轉(zhuǎn)速280r/min，溶氧40%_50%，發(fā)酵24h，得到發(fā)酵液； 4)將上述發(fā)酵液在4°C下、經(jīng)12000rpm/min離心IOmin去除上清液后收集菌體,將收集的菌體在冰浴下進(jìn)行超聲波破碎處理；隨后將超聲波破碎液在4°C下、12000rpm/min離心IOmin去除細(xì)胞碎片沉淀，收集上清液得到粗酶液。
2.如權(quán)利要求I所述的一種利用褐藻膠裂解酶基因工程菌的高密度培養(yǎng)生產(chǎn)褐藻膠裂解酶的方法，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成以g/L為單位計其中葡萄糖10g/L，酵母提取物 5g/L，蛋白胨 20g/L，K2HPO4 5g/L，KH2PO4 3. 5g/L, (NH4)2HPO4 4. Og/L,MgSO4 · 7H20 I. 2g/L，檸檬酸 I. 7g/L ;微量元素液 lml/L,卡那霉素(lOmg/ml) 600 μ /I。
3.如權(quán)利要求I所述的一種利用褐藻膠裂解酶基因工程菌的高密度培養(yǎng)生產(chǎn)褐藻膠裂解酶的方法，其中微量元素液g/L =FeSO4 · 7H20 I. Og/L, ZnSO4 · 7H20 0. 225g/L，(NH4)6MO · 4H20 0. 15g/L, CuSO4 · H2O 0. 15g/L, CaCl2 · H2OO. 2g/L, MnSO4 · H2O 0. 05g/L,Na2B4O4 · H2O 0. 002g/L。
4.如權(quán)利要求I所述的一種利用褐藻膠裂解酶基因工程菌的高密度培養(yǎng)生產(chǎn)褐藻膠裂解酶的方法，其特征在于所述的補(bǔ)充培養(yǎng)基的組成以g/L為單位計，葡萄糖150，蛋白胨20，酵母提取物 10，MgSO4 · 7H20 I. 2，ρΗ7· 0 7· 2。
5.如權(quán)利要求I所述的一種利用褐藻膠裂解酶基因工程菌的高密度培養(yǎng)生產(chǎn)褐藻膠裂解酶的方法，其特征在于所述的超聲波破碎的條件為菌液體積50ml，NaCl濃度為O.15mol/l,破碎強(qiáng)度50%，總工作時間5min,工作/間歇時間為4s/8s。
全文摘要
一種高密度培養(yǎng)基因工程菌生產(chǎn)褐藻膠裂解酶的方法將褐藻膠裂解酶基因工程菌從保藏的甘油管接種于LB液體培養(yǎng)基中，35-37℃,150rpm，培養(yǎng)10-12h，得到活化液菌種；將活化液菌種轉(zhuǎn)接至LB種子培養(yǎng)基中，在35-37℃,150rpm，搖瓶培養(yǎng)10-12h，得到種子液；將2%種子液轉(zhuǎn)接至含有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，待發(fā)酵到第4h時開始流加補(bǔ)充培養(yǎng)基；并在發(fā)酵到第4.5h后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)；發(fā)酵過程中罐內(nèi)參數(shù)設(shè)定為溫度35-37℃，轉(zhuǎn)速280rpm，溶氧40%-50%，發(fā)酵24h得到發(fā)酵液；將發(fā)酵液在4℃下、經(jīng)12000rpm/min離心10min去除上清液后收集菌體，將收集的菌體在冰浴下進(jìn)行超聲波破碎處理；隨后將超聲波破碎液在4℃下、12000rpm/min離心10min去除細(xì)胞碎片沉淀，收集上清液得到粗酶液。
文檔編號C12R1/19GK102864136SQ201210401888
公開日2013年1月9日 申請日期2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月19日
發(fā)明者汪立平, 李安雪 申請人:上海海洋大學(xué)