專利名稱：大白菜est-ssr標(biāo)記引物及其在品種鑒定中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大白菜EST-SSR標(biāo)記引物及其在品種鑒定中的應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
大白菜(Brassica rapa L. ssp. pekinensis)為十字花科蕓薹屬植物,是我國(guó)和東亞國(guó)家的重要蔬菜。品種的差異直接影響著大白菜的生產(chǎn)和食用品質(zhì)，因此大白菜品種鑒別和純度鑒定工作非常重要。傳統(tǒng)的最可靠的種子純度檢測(cè)方法是GOT (grow-out test)法，它是通過田間種植，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征對(duì)雜交種進(jìn)行鑒定。GOT法的最大缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)費(fèi)力、容易受環(huán)境和主觀因素的影響。近年來，同工酶、蛋白質(zhì)電泳法可以用于蔬菜種子純度的鑒 定，然而，一些親緣關(guān)系近、來自同一地區(qū)的蔬菜品種由于蛋白質(zhì)電泳的多態(tài)性少，往往難以區(qū)分。因此，建立一套快速、精確、廉價(jià)的蔬菜種子純度檢測(cè)技術(shù)，顯得非常必要。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記越來越多的被應(yīng)用于種子純度鑒定中，如以分子雜交為基礎(chǔ)的RFLP、以酶切和PCR為基礎(chǔ)的AFLP等、以PCR反應(yīng)為基礎(chǔ)的RAPD、SCAR、SSR、ISSR等。與其它分子標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記具有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。SSR標(biāo)記在單個(gè)座位上能檢測(cè)到的多態(tài)性遠(yuǎn)高于其它幾種分子標(biāo)記，而且它廣泛、隨機(jī)地分布于整個(gè)基因組，具有共顯性遺傳的特點(diǎn)；SSR標(biāo)記可以準(zhǔn)確高效地鑒別大量等位基因；利用雜交種雙親在一些SSR位點(diǎn)的差異，可以將呈父母本互補(bǔ)帶型的雜交種與其雙親、甚至也可以將一些異源花粉造成的雜交種區(qū)分開。由于上述特點(diǎn)，SSR標(biāo)記逐步成為蔬菜作物品種鑒定的理想分子標(biāo)記之一。迄今為止簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple sequence repeat, SSR)標(biāo)記已在多種農(nóng)作物種子的品種純度鑒定中得到應(yīng)用。根據(jù)建立SSR標(biāo)記序列性質(zhì)不同，SSR標(biāo)記可分為，基因組SSR (gSSR)和表達(dá)序列標(biāo)簽SSR (EST-SSR)0與構(gòu)建小片段基因組文庫進(jìn)行SSR的篩選建立gSSR標(biāo)記相比，從EST數(shù)據(jù)庫中獲得SSR建立EST-SSR標(biāo)記要經(jīng)濟(jì)得多；而且EST-SSR標(biāo)記來源于DNA的轉(zhuǎn)錄區(qū)域，比gSSR標(biāo)記具有更高的通用性。李新海等利用SSR標(biāo)記研究了 70份我國(guó)主要玉米自交系的遺傳變異(參見《中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)》，2003年第36卷第6期，《利用SSR標(biāo)記劃分70份我國(guó)玉米自交系的雜種優(yōu)勢(shì)群》)；番興明等利用SSR標(biāo)記將我國(guó)溫帶玉米主要雜種優(yōu)勢(shì)群進(jìn)行了劃分(參見《作物學(xué)報(bào)》，2003年11月，第29卷第6期，《利用SSR標(biāo)記對(duì)29個(gè)熱帶和溫帶玉米自交系進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)群的劃分》)；李穩(wěn)香等用SSR標(biāo)記對(duì)10個(gè)雜交水稻組合的子一代種子純度進(jìn)行了鑒定(參見《福建農(nóng)林大學(xué)》，2006年，利用SSR標(biāo)記構(gòu)建水稻特征指紋及種子純度分析的研究);彭鎖堂等對(duì)我國(guó)9個(gè)主要的雜交水稻組合及其親本進(jìn)行了 SSR標(biāo)記分析(參見《中國(guó)水稻科學(xué)》，2003年01期，我國(guó)主要雜交水稻組合及其親本SSR標(biāo)記和純度鑒定)。陳琢等開發(fā)了甘藍(lán)的EST-SSR標(biāo)記(參見《園藝學(xué)報(bào)》，2010年02期，甘藍(lán)EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用)。李麗和鄭曉鷹建立了用于白菜和大白菜品種鑒定的由3個(gè)引物對(duì)組成的6套EST-SSR復(fù)合標(biāo)記組合(參見《園藝學(xué)報(bào)》，2009年11期，用于白菜和大白菜品種鑒定的EST-SSR復(fù)合標(biāo)記的建立)。但是有關(guān)大白菜EST-SSR引物的開發(fā)遠(yuǎn)未達(dá)到飽和。為了提高EST-SSR標(biāo)記的密度和提高大白菜品種鑒定的效果，有必要開發(fā)更多的EST-SSR標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供大白菜EST-SSR標(biāo)記引物及其在品種鑒定中的應(yīng)用。大白菜EST-SSR標(biāo)記引物BRE28，它由核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的下游引物組成。大白菜EST-SSR標(biāo)記引物BRE121，它由核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示的下游引物組成。 大白菜EST-SSR標(biāo)記引物BRE131，它由核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示的下游引物組成。上述大白菜EST-SSR標(biāo)記引物BRE28、大白菜EST-SSR標(biāo)記引物BRE121和/或大白菜EST-SSR標(biāo)記引物BRE131在大白菜品種鑒定中的應(yīng)用。上述應(yīng)用，步驟如下(I)利用改良的CTAB法提取待鑒定樣品總DNA ；(2)以步驟(I)提取的待鑒定樣品總DNA為模板DNA，引物為大白菜EST-SSR標(biāo)記引物BRE28、大白菜EST-SSR標(biāo)記引物BRE121或大白菜EST-SSR標(biāo)記引物BRE131進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR采用20 μ L反應(yīng)體系40ng 模板 DNA,I XPCR buffer (含 20mmol · L^1MgCl2),200 μ mol · L 1NTPs, 引物 O. I μ mol · L \IU TaqDNA 聚合酶；PCR擴(kuò)增條件如下95°C 預(yù)變性 5min ;94°C變性 45s，56°C退火 45s，72°C 延伸 lmin，共計(jì) 35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 10min,4°C IOmin 終止反應(yīng)；(3)將步驟(2) PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染顯影并與標(biāo)準(zhǔn)樣品聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染顯影的泳帶進(jìn)行對(duì)照。所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳為6%聚丙烯酰胺凝膠電泳。所述步驟(3)的具體步驟如下將步驟(2) PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物與上樣緩沖液混勻后，取4μ I點(diǎn)樣，進(jìn)行電泳分離，電極緩沖液為IXTBE (Tris-硼酸)，在25°C、2000V恒壓下電泳2h，通過銀染法顯影，將顯影后的泳帶與標(biāo)準(zhǔn)樣電泳后顯影的泳帶進(jìn)行對(duì)照。上述電泳在Sequi-Gens'iGT核酸電泳系統(tǒng)(Bio-Rad, USA)中進(jìn)行。上述上樣緩沖液為常用緩沖液，也可采用如下成分的緩沖液，配制過程按本領(lǐng)域常用技術(shù)98%的去離子甲酰胺，IOmM EDTA (pH8. O)，O. 025% 二甲苯青，O. 025%溴酚蘭。改良的CTAB法、銀染顯影均可按現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行，其他操作如無特別說明均為本領(lǐng)域常用技術(shù)。本發(fā)明的有益效果
為了提聞SSR標(biāo)記的密度和提聞大白菜品種鑒定的效果,本發(fā)明提供了 3對(duì)新的EST-SSR引物，分別被命名為大白菜EST-SSR標(biāo)記引物BRE28、大白菜EST-SSR標(biāo)記引物BRE121和大白菜EST-SSR標(biāo)記引物BRE131，并將它們應(yīng)用于品種純度鑒定中。利用3對(duì)EST-SSR引物對(duì)13個(gè)大白菜品種的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并利用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)這3對(duì)EST-SSR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物都呈現(xiàn)雙親互補(bǔ)帶型，而且?guī)烷g大小差異明顯，能夠很好的區(qū)分雜交種和親本自交系、鑒別不同的品種。對(duì)同一品種內(nèi)的個(gè)體間的擴(kuò)增產(chǎn)物，其帶型一致，3對(duì)EST-SSR引物用于品種純度檢測(cè)，體現(xiàn)品種內(nèi)的一致性。


圖I是本發(fā)明涉及的3對(duì)EST-SSR標(biāo)記引物對(duì)18個(gè)大白菜樣品的檢測(cè)結(jié)果；其中泳道I、大白菜691，2、大白菜690，3、大白菜雜交種773，4、大白菜668，5、大白菜663,6、大白菜雜交種761,7、大白菜691,8、大白菜690,9、大白菜雜交種773,10、大白菜夏白I號(hào)，11、大白菜夏白45,12、大白菜夏優(yōu)2號(hào)，13、大白菜夏優(yōu)5號(hào)，14、大白菜高抗2號(hào)，15、大白菜豐抗78,16、大白菜早熟5號(hào)，17、大白菜夏白I號(hào)，18、大白菜夏白45?！D2是引物BRE131對(duì)8個(gè)親本691個(gè)體、6個(gè)690個(gè)體以及I個(gè)雜交種773(691 X 690)個(gè)體DNA的擴(kuò)增結(jié)果；圖3是引物BRE121對(duì)10個(gè)大白菜品種夏白45個(gè)體DNA的擴(kuò)增結(jié)果；圖4是引物BRE28對(duì)12個(gè)大白菜夏白I號(hào)個(gè)體DNA的擴(kuò)增結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。實(shí)施例中大白菜691 (自交系)、大白菜690 (自交系)、大白菜668 (自交系)、大白菜663 (自交系)、大白菜夏白I號(hào)、大白菜夏白45、大白菜夏優(yōu)2號(hào)、大白菜夏優(yōu)5號(hào)、大白菜高抗2號(hào)、大白菜豐抗78、大白菜早熟5號(hào)均為市售產(chǎn)品，也可購自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所。大白菜雜交種773為大白菜691 (父本)與大白菜690 (母本)雜交獲得的一代雜交種。大白菜雜交種761為大白菜668 (父本)與大白菜663 (母本)雜交獲得的一代雜交種。實(shí)施例中所用大白菜EST-SSR標(biāo)記引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。實(shí)施例I.大白菜EST-SSR標(biāo)記引物的開發(fā)開發(fā)引物所用的大白菜EST 序列來自 GenBank(http://www. ncbi. nlm. nih. gov),時(shí)間截止到2007年10月31日，共有大白菜(B. rapa ssp. pekinensis)EST序列147217個(gè)。本研究采用147217個(gè)大白菜EST序列開發(fā)SSR引物。對(duì)下載到的大白菜EST序列參照葛佳等中的方法進(jìn)行前期處理(參見《農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)》，2005年第04期，《大白菜表達(dá)序列標(biāo)簽SSR標(biāo)記分析》)，包括除去EST序列中存在的載體序列5’端polyT和3’端polyA序列以及含有歧義堿基的序列，除去小于IOObp的序列。然后利用SeqMan程序(Lasergene軟件包,DNAStar Inc.)對(duì)處理后的EST序列進(jìn)行重疊群(contigs)構(gòu)建。用 MISA 軟件(http://www. pgrc. ipk-gatersleben. de/mi sa)在構(gòu)建的重疊群中篩選SSR標(biāo)記，標(biāo)準(zhǔn)參見Zhang L D, Yuan D, Yu S，Li Z, CaoY. Miao Z, QianH, Tang K. Preference of simple sequence repeats in coding and non-coding regionsof Arabidopsis thaliana[J]· Bioinformatics, 2004，20:1081-1086。對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析篩選，最終選取其中的3對(duì)引物用于品種鑒定分析，分別命名為大白菜EST-SSR標(biāo)記引物BRE28 (上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示)、大白菜EST-SSR標(biāo)記引物BRE121 (上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示)和大白菜EST-SSR標(biāo)記引物BRE131 (上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示)。2.大白菜EST-SSR標(biāo)記引物在品種鑒定中的應(yīng)用大白菜品種鑒定的步驟如下(I)利用改良的CTAB法提取待鑒定樣品總DNA ；選用大白菜品種(系)691 (自交系)、690 (自交系)、雜交種773 (691 X690)、668(自交系)、663 (自交系)、雜交種761 (668X663)、大白菜夏白I號(hào)、夏白45、夏優(yōu)2號(hào)、夏優(yōu)5號(hào)、高抗2號(hào)、豐抗78、早熟5號(hào)。(2)以步驟(I)提取的待鑒定樣品總DNA為模板DNA，引物為大白菜EST-SSR標(biāo)記引物BRE28、BRE121和BRE131進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR采用20 μ L反應(yīng)體系:40ng 模板 DNA,I XPCR buffer (含 20mmol · L^1MgCl2),200 μ mol · L-1NTPs, 引物 O. I μ mol · ΛI(xiàn)U TaqDNA 聚合酶；PCR擴(kuò)增條件如下95°C 預(yù)變性 5min ;94°C變性 45s，56°C退火 45s，72°C 延伸 lmin，共計(jì) 35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 10min,4°C IOmin 終止反應(yīng)；(3)將步驟(2) PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物與上樣緩沖液(98%的去離子甲酰胺IOmMEDTA (pH8. 0)，0. 025% 二甲苯青，O. 025%溴酚蘭)混合均勻后，取10 μ I點(diǎn)樣，在Sequi-GeniGT核酸電泳系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)中通過6%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，電極緩沖液為IXTBE (Tris-硼酸)，在25°C、2000V恒壓下電泳2h。通過銀染法顯影，拍照、記錄結(jié)果(見附圖I)。上述改良的CTAB法提取總DNA，采用如下操作進(jìn)行I)向15ml離心管中預(yù)先加入5ml CTAB抽提液及0. Iml的β -巰基乙醇，混勻，65 °C預(yù)熱，得抽提液；2)取Ig樣品幼葉用液氮磨成粉末，轉(zhuǎn)入步驟I)制得的抽提液中，搖勻；于65°〇水浴45min,每10 15分鐘顛倒I次,得DNA初提液；3)向步驟2)制得的DNA初提液中加入等體積氯仿與異戊醇的混合液(二者體積比為24 : I),顛倒混勻，乳化IOmin后,IOOOOrpm室溫離心IOmin,取上清液；4)向步驟3)制得的上清液中加入等體積的異丙醇和1/10 1/5體積的醋酸鈉溶液(3M),顛倒混勻I 2分鐘,于4°C、IOOOOrpm離心IOmin,取白色沉淀；5)用75%乙醇漂洗3次,然后用無水乙醇漂洗I次，室溫干燥去除乙醇后，在65°C水浴中，用200 μ I TriS-EDTA溶解沉淀，即得總DNA溶液。上述銀染法顯影，采用如下操作進(jìn)行I、電泳完畢后，膠板用10wt%醋酸溶液緩慢搖動(dòng)并固定15分鐘，然后，去離子水漂洗3次；2、將漂洗后的膠板用含有O. lwt%硝酸銀和O. 15wt%甲醒的溶液染色30分鐘；3、染色后，用去離子水漂洗膠板，然后，用含有3%碳酸鈉和O. 15%甲醛的溶液染色3-5分鐘，緩慢搖動(dòng)，直到條帶清晰；然后放入10%醋酸溶液固定10分鐘，然后用去離子水漂洗5 10分鐘，晾干，照相記錄。利用本發(fā)明所述3對(duì)EST-SSR引物對(duì)13個(gè)大白菜品種的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并利用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)這3對(duì)EST-SSR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物都呈現(xiàn)雙親互補(bǔ)帶 型，而且?guī)烷g大小差異明顯，能夠很好的區(qū)分雜交種和親本自交系。圖中I 9泳道是3組親本自交系，10 18泳道是商業(yè)雜交種?？梢钥闯?，通過特征條帶完全可以區(qū)分不同的親本自交系和雜交種。另外，我們利用大白菜EST-SSR引物BRE131對(duì)自交系690、691以及雜交種773的種子進(jìn)行了鑒定，利用大白菜EST-SSR引物BRE121對(duì)大白菜夏白45進(jìn)行了品種純度鑒定，利用大白菜EST-SSR引物BRE28對(duì)夏優(yōu)I號(hào)大白菜種子進(jìn)行了鑒定(如圖2，3，4所示)。具體操作同上述方法，先提取個(gè)體植株的DNA，然后進(jìn)行EST-SSR引物擴(kuò)增，再進(jìn)行電泳和銀染顯色。結(jié)果顯示，相同品種(材料)不同個(gè)體的帶型一致。這些結(jié)果說明，這3對(duì)大白菜EST-SSR引物用于大白菜品種純度檢測(cè)，可以體現(xiàn)品種內(nèi)的一致性。
權(quán)利要求
1.大白菜EST-SSR標(biāo)記引物BRE121，它由核苷酸序列如SEQID NO. 3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示的下游引物組成。
2.權(quán)利要求I所述大白菜EST-SSR標(biāo)記引物BRE121在大白菜品種鑒定中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟如下 (1)利用改良的CTAB法提取待鑒定樣品總DNA； (2)以步驟(I)提取的待鑒定樣品總DNA為模板DNA，引物為大白菜EST-SSR標(biāo)記引物BRE121進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR采用20 μ L反應(yīng)體系 40ng 模板 DNA，IXPCR buffer,200 μ mo I · L-1NTPs,引物 O. I μ mol · Λ IU TaqDNA聚合酶； PCR擴(kuò)增條件如下 95°C預(yù)變性5min ;94°C變性45s，56°C退火45s，72°C延伸lmin，共計(jì)35個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin, 4°C IOmin終止反應(yīng)； (3)將步驟(2)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染顯影并與標(biāo)準(zhǔn)樣品聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染顯影的泳帶進(jìn)行對(duì)照。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳為6%聚丙烯酰胺凝膠電泳。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(3)中的聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟如下將步驟(2) PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物與上樣緩沖液混勻后，取4μ I點(diǎn)樣，進(jìn)行電泳分離，電極緩沖液為1ΧΤΒΕ，在25°C、2000V恒壓下電泳2h。
全文摘要
本發(fā)明涉及大白菜EST-SSR標(biāo)記引物及其在品種鑒定中的應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供大白菜EST-SSR標(biāo)記引物BRE121的序列及上述標(biāo)記引物在大白菜品種鑒定中的應(yīng)用。本發(fā)明所述EST-SSR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物都呈現(xiàn)雙親互補(bǔ)帶型，而且?guī)烷g大小差異明顯，能夠很好的區(qū)分雜交種和親本自交系、鑒別不同的品種。對(duì)同一品種內(nèi)的個(gè)體間的擴(kuò)增產(chǎn)物，其帶型一致。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102876670SQ20121040467
公開日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2010年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月26日
發(fā)明者高建偉, 周新成, 劉立鋒, 李利斌, 李化銀, 張庶 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所