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一種中等長度基因編碼序列單核苷酸多態(tài)性快速檢測試劑盒的制作方法

文檔序號:414199閱讀:187來源:國知局
專利名稱:一種中等長度基因編碼序列單核苷酸多態(tài)性快速檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種中等長度基因(150-350 bp)編碼序列單核苷酸多態(tài)性(cSNP)的快速檢測試劑盒,屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)
單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)是人類和其它動物基因組中DNA序列上群體發(fā)生概率大于1%的單個核苷酸差異。又被稱為第三代DNA遺傳標(biāo)記。SNP指在染色體基因組水平上單個核苷酸位置存在轉(zhuǎn)換(C/T互換,在其互補(bǔ)鏈為G/A互換)、顛換(包括C/A、G/T、C/G和A/T)、插入和缺失等變異引起的序列多態(tài)性。SNP在人類基因組內(nèi)廣泛存在,平均每500 1000個堿基對中就有一個?;蚪M內(nèi)的任何堿基都存在發(fā)生變異的可能,根據(jù)SNP所處位置,將SNP劃分為三種形式第一種是分布在基因編碼序列上的單堿基變異(coding sequence SNP, cSNP);第二種是分布在基因內(nèi)含子上的單核苷酸突變(intixm SNP, iSNP);第三種是分布在基因外部調(diào)控區(qū)序列上的SNP (regulatory region SNP, rSNP);第四種是分布在其他區(qū)域的SNP。基因內(nèi)部序列包含編碼序列(外顯子)和非編碼序列(內(nèi)含子),編碼序列的堿基突變率僅占全部突變的20%,因此位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP (cSNP)通常較少。但cSNP在遺傳疾病研究中具有重要意義,根據(jù)其對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)影響來說,cSNP可分為以下兩種
第一種是同義突變(synonymous mutation),即cSNP并不影響基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列,突變堿基與未突變堿基的翻譯相同。第二種是錯意突變(missense mutation),即cSNP導(dǎo)致其翻譯的氨基酸發(fā)生改變,從而改變其編碼蛋白的序列,影響蛋白質(zhì)功能。錯意突變cSNP是導(dǎo)致生物性狀改變的關(guān)鍵因素。與第一代遺傳標(biāo)記RFLP和第二代遺傳標(biāo)記微衛(wèi)星相比,第三代遺傳標(biāo)記SNP具有以下優(yōu)點二等位性、穩(wěn)定性高、密度高、作用直接和易于進(jìn)行自動化分析。SNP分析技術(shù)按其研究對象主要分為兩大類一是對未知SNP進(jìn)行分析,即找尋未知的SNP,可用于增加遺傳圖譜精密度,尋找某一性狀的的基因標(biāo)記。二是對已知SNP進(jìn)行分析,即對不同群體SNP進(jìn)行遺傳多樣性檢測,或在臨床上對已知致病基因的遺傳病進(jìn)行基因診斷。SNP分析最基本的方法是直接測序法、凝膠電泳法和高通量分析法。直接測序法的優(yōu)點是方便,且信息豐富;缺點是費用很高,時間較長。凝膠電泳法主要有單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strandconformationalpolymorphism, SSCP)、限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragmentlength polymorphism,RFLP)等,優(yōu)點是成本低廉、結(jié)果可靠,所以科研院所中應(yīng)用普遍;缺點是對未知的SNP基因型判定時,需結(jié)合測序結(jié)果確定。高通量SNP分型技術(shù)包括基因芯片法(Gene chip)、熒光檢測法(Taqman)、質(zhì)譜法(Mass spectrum)和高效液相層析法(high performance liquid chromatographyv,HPLC)等,這些方法優(yōu)點是可大規(guī)模、快速檢出SNP,缺點是價格昂貴,且對樣品要求較高。目前實驗室中應(yīng)用最廣的檢測cSNP的技術(shù)為SSCP方法,但原有的操作步驟繁瑣,花費時間較長,如果檢測較多樣品時,會耗費大量的人力物力。SSCP主要分為制膠、跑膠和染膠三步操作步驟如下
第一步為制膠(非變性聚丙烯酰胺凝膠工作液制作),操作步驟如下(I)蒸餾水清洗玻璃板,室溫自然晾干,夾緊玻璃板和膠條,避免膠條有縫隙而漏膠。(2)配制非變性聚丙烯酰胺凝膠工作液,混合均勻后迅速灌膠。第二步為跑膠(電泳),操作步驟如下(I)電泳槽中加滿IXTBE電泳液,夾上制好的膠板,預(yù)電泳。(2)將上樣液(PCR產(chǎn)物和變性Buffer混合物)一定溫度下變性10min,迅速冰浴8 min。(3) 110 V電壓,電泳10-15 h。
第三步為染膠(非變性聚丙烯酰胺凝膠中DNA的銀染),操作步驟如下(I)電泳完畢后,取下凝膠,并在凝膠上做標(biāo)記以區(qū)分。(2)將凝膠放入一定濃度的乙醇中固定半小時。(3)棄固定液,蒸餾水漂洗2次,棄漂洗液。(4)加入現(xiàn)配染色液,染色40分鐘。(5)棄染色液,蒸餾水漂洗3次,棄漂洗液。(6)加入現(xiàn)配顯色液,顯色至觀察到清晰條帶。(7)棄顯色液,蒸餾水漂洗2次,將膠裝入保鮮袋中拍照、保存。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種“傻瓜式”的基因編碼序列單核苷酸多態(tài)性(cSNP)的快速檢測方法,操作簡單、所用試劑安全、成本經(jīng)濟(jì)、結(jié)果可靠,以適應(yīng)大批量樣品基因cSNP的快速檢測。技術(shù)方案
為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明對SSCP的制膠、跑膠(電泳)和染膠三個階段進(jìn)行了全面改進(jìn),節(jié)約出大量人力和試劑,并且在不降低實驗效果的前提下減少試劑種類,制作成cSNP快速檢測試劑盒。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是
一種中等長度基因編碼序列單核苷酸多態(tài)性(cSNP)快速檢測試劑盒,包括30%丙烯酰胺和10 X TBE和50%甘油的10:3:3混合液(溶液A)、10%過硫酸銨(溶液B)、TEMED (溶液C)、變性Buffer (溶液D)和質(zhì)量比為O. 1%的硝酸銀(溶液E)。上述試劑盒用于檢測中等長度基因編碼序列單核苷酸多態(tài)性(cSNP)快速檢測方法為
制膠檢測24個樣品時,需配制一塊含24個點樣孔的非變性聚丙烯酰胺凝膠(膠濃度為10%),需24次的試劑盒用量,配方為A溶液16.0 ml、B溶液210 yl、C溶液20 μ I、去離子水14. O ml。上述為配制一塊膠的量,配制多塊膠時,按此比例成倍添加試劑即可。灌膠至玻璃板上,室溫放置20分鐘,待凝膠聚合后,小心拔出24齒梳子(拔出后,會產(chǎn)生24個點樣孔),把此膠板夾到垂直電泳槽上。跑膠向每個樣品的PCR產(chǎn)物(4 μ I)中分別加入D溶液6 μ 1,然后對此溶液混合物(上樣液),98 °C變性10分鐘,迅速冰浴8分鐘。對上樣液進(jìn)行點樣,之后預(yù)電泳5分鐘,再在4 ° C冰柜內(nèi)用200 V電壓,電泳4-6小時。
染膠(1)先向搪瓷盤中倒入E溶液I ml,再倒入蒸餾水199 ml (即將E溶液稀釋200倍),搖勻,將膠放入搪瓷盤中,80 rpm搖15分鐘(染膠),再用蒸餾水快速洗膠約5秒鐘。(2)然后直接用2%的氫氧化鈉于搪瓷盤中沖洗膠5秒鐘(需快速晃動搪瓷盤),再加入新鮮的2%的氫氧化鈉顯色15分鐘左右,用蒸餾水終止顯色。有益效果
(I)本發(fā)明優(yōu)化了制膠環(huán)節(jié),用一種溶液(溶液A)代替了三種溶液,減少了操作步驟,降低了實驗誤差,將原來的制膠時間I小時縮短至現(xiàn)在的30分鐘,節(jié)約了 50%的時間。(2)同時優(yōu)化了跑膠(電泳)環(huán)境,將原來的電泳時間12-16小時縮短至現(xiàn)在的4-6小時,節(jié)約了 60%的時間。(3)在最后的染膠階段,本發(fā)明將原來的7個操作步驟精減至2個,大大降低了勞動強(qiáng)度,將原來的染膠時間2-3小時縮短至現(xiàn)在的O. 5-1小時,節(jié)約了 70%的時間。
這些使得本試劑盒成本低廉,操作簡單、省時省力、結(jié)果可靠市場競爭力強(qiáng)。本發(fā)明方法得到的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖,條帶清晰,易于觀察(可直接用肉眼觀察)。


圖I是本發(fā)明實施例所檢測的基因編碼序列單核苷酸多態(tài)性(cSNP)的電泳圖
-i'TfeP曰。
具體實施例方式試劑盒包括5瓶溶液,即30%丙烯酰胺和10 X TBE和50%甘油的10:3:3混合液(溶液A)、10%過硫酸銨(溶液B)、TEMED (溶液C)、變性Buffer (溶液D)和質(zhì)量比為20%的硝酸銀(溶液E)。100次裝(可以檢測100個樣品)的試劑盒含量為A溶液50.0 ml、B溶液I. O ml、C溶液100 μ I、D溶液600 μ I和E溶液5 ml。以一種中等長度(150-350 bp)基因編碼序列的cSNP檢測為例,選取Ephrin B2基因(GenBank: NM_001114286)的一段編碼序列(長217 bp),在24頭豬群中檢測其cSNP。Ephrin B2是一個影響豬胚胎附植活動和豬產(chǎn)仔數(shù)的基因。PCR階段(前期準(zhǔn)備)提取24頭豬的基因組DNA,設(shè)計引物(5,—3’方向上游,CTGTGCCGTAAAGTAATCGC ;下游,TTCTGTCCTACCCTGTGATG),擴(kuò)增 Ephrin B2 基因的這段編碼序列(長217 bp),PCR產(chǎn)物用瓊脂糖檢測確認(rèn)目的條帶。制膠階段蒸餾水清洗玻璃板,室溫自然晾干,夾緊垂直電泳槽上的玻璃板,用瓊脂粉堵住電泳槽與玻璃板下沿的空隙。配制一塊濃度為10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠,A溶液16.0 ml、B溶液210 μ I、C溶液20 μ I、去離子水14.0 ml ο灌膠至離玻璃板上沿O. I cm時停止,清除氣泡,插入梳子,室溫聚合20分鐘左右,隨時觀察凝膠聚合情況,及時補(bǔ)加所配制的丙烯酰胺溶液。凝膠聚合后,小心拔出梳子,快速吸取IXTBE電泳緩沖液清洗膠孔。電泳槽中加滿IXTBE電泳液,夾上制好的膠板。跑膠(電泳)階段將上樣液(PCR產(chǎn)物4 μ I和D溶液6 μ I) 98 °C變性10分鐘,迅速冰浴8分鐘。先預(yù)電泳5分鐘,再在4 ° C冰柜內(nèi)用200 V電壓,電泳6小時。電泳完畢后,取下凝膠,并在凝膠上做標(biāo)記以區(qū)分。
染膠階段先向搪瓷盤中倒入E溶液I ml,再倒入蒸餾水199 ml (即將E溶液稀釋200倍),搖勻,將膠放入搪瓷盤中,80 rpm搖15分鐘(染膠),再用蒸餾水快速洗膠約5秒鐘。然后直接用2%的氫氧化鈉于搪瓷盤中沖洗膠5秒鐘(需快速晃動搪瓷盤),再加入新鮮的2%的氫氧化鈉顯色15分鐘左右,用蒸餾水終止顯色。將膠裝入8號自封袋中拍照、保存,根據(jù)膠圖和參考文獻(xiàn)判定每個樣品的基因型(例如氟烷基因的多態(tài)位點基因型)。當(dāng)基因型為首次報道時,應(yīng)結(jié)合測序方法判定(例如圖I)。以上述方法得到的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖,條帶清晰,易于觀察(可直接用肉眼觀察),如圖UEphrin B2基因的這段編碼序列檢測到一個多態(tài)位點(cSNP),第1_24泳道分別代表的第1-24組織樣的條帶。

本發(fā)明方法得到的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖,條帶清晰,易于觀察(可直接用肉眼觀察)。(I)本發(fā)明優(yōu)化了制膠環(huán)節(jié),用一種溶液(溶液A)代替了三種溶液,減少了操作步驟,降低了實驗誤差,將原來的制膠時間I小時縮短至現(xiàn)在的30分鐘,節(jié)約了 50%的時間。(2)同時優(yōu)化了跑膠(電泳)環(huán)境,將原來的電泳時間12-16小時縮短至現(xiàn)在的4-6小時,節(jié)約了 60%的時間。(3)在最后的染膠階段,本發(fā)明將原來的7個操作步驟精減至2個,大大降低了勞動強(qiáng)度,將原來的染膠時間2-3小時縮短至現(xiàn)在的O. 5-1小時,節(jié)約了 70%的時間。這些使得本試劑盒成本低廉,操作簡單、省時省力、結(jié)果可靠市場競爭力強(qiáng)。當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物大于350 bp范圍時,可分段設(shè)計引物,使每一段的PCR產(chǎn)物長度控制在150-350 bp范圍內(nèi);當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物小于150 bp時,可延長設(shè)計引物,前移上游引物位置或后移下游引物位置,使延長后的PCR產(chǎn)物長度控制在150-350 bp范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種中等長度基因編碼序列單核苷酸多態(tài)性快速檢測試劑盒,包括 溶液A :質(zhì)量比30%的丙烯酰胺、10XTBE和質(zhì)量比50%的甘油以體積比10:3:3的混合液 ’溶液B :質(zhì)量比10%的過硫酸銨;溶液C =TEMED ;溶液D :變性Buffer ;和溶液E :質(zhì)量比為O. 1%的硝酸銀。
2.權(quán)利要求I所述的試劑盒的應(yīng)用,其特征是 1)制膠檢測24個樣品時,需配制一塊含24個點樣孔的膠濃度質(zhì)量比為10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠配方為A溶液16.0 ml、B溶液210 yl、C溶液20 μ I、去離子水14. Oml ; 灌膠至玻璃板上,室溫放置20分鐘,待凝膠聚合后,小心拔出24齒梳子,會產(chǎn)生24個點樣孔,把此膠板夾到垂直電泳槽上; 2)跑膠向每個樣品的PCR產(chǎn)物4μ I中力口入D溶液6 μ I,然后對此溶液混合物上樣液,98 °C變性10分鐘,冰浴8分鐘,對上樣液進(jìn)行點樣,之后預(yù)電泳5分鐘,再在4 ° C冰柜內(nèi)用200 V電壓,電泳4-6小時; 3)染膠(1)先向搪瓷盤中倒入E溶液Iml,再倒入蒸餾水199 ml,搖勻,將膠放入搪瓷盤中,80 rpm搖15分鐘染膠,再用蒸餾水快速洗膠約5秒鐘;(2)然后直接用質(zhì)量比為2%的氫氧化鈉于搪瓷盤中沖洗膠5秒鐘,再加入新鮮的質(zhì)量比為2%的氫氧化鈉顯色15分鐘,用蒸餾水終止顯色。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種中等長度基因編碼序列單核苷酸多態(tài)性(cSNP)快速檢測試劑盒,屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具有操作簡單、檢測速度快、成本低廉的特點。本發(fā)明通過簡化非變性聚丙烯酰胺凝膠的制膠、跑膠和染膠的過程,組合優(yōu)化檢測試劑,在保證cSNP判型質(zhì)量的前提下達(dá)到了快速、高效檢測的效果制膠只需20分鐘、跑膠只需4-6個小時、染膠和顯色只需30分鐘。省時省力,特別適用于檢測大批量動物組織樣本的中等長度基因的cSNP。本發(fā)明所得到的非變性聚丙烯酰胺凝膠圖條帶清晰,用肉眼即可觀察判型,且結(jié)果可靠。
文檔編號C12Q1/68GK102888463SQ20121040475
公開日2013年1月23日 申請日期2012年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月23日
發(fā)明者付言峰, 任守文, 李蘭, 李碧俠, 王學(xué)敏, 方曉敏, 陳哲, 趙芳, 涂楓 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
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