專利名稱：大白菜est-ssr標記引物及其在品種鑒定中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及大白菜EST-SSR標記引物及其在品種鑒定中的應用，屬于分子生物學技術領域。
背景技術：
大白菜(Brassica rapa L. ssp. pekinensis)為十字花科蕓薹屬植物,是我國和東亞國家的重要蔬菜。品種的差異直接影響著大白菜的生產和食用品質，因此大白菜品種鑒別和純度鑒定工作非常重要。傳統(tǒng)的最可靠的種子純度檢測方法是GOT (grow-out test)法，它是通過田間種植，根據形態(tài)學特征對雜交種進行鑒定。GOT法的最大缺點是費時費力、容易受環(huán)境和主觀因素的影響。近年來，同工酶、蛋白質電泳法可以用于蔬菜種子純度的鑒·定，然而，一些親緣關系近、來自同一地區(qū)的蔬菜品種由于蛋白質電泳的多態(tài)性少，往往難以區(qū)分。因此，建立一套快速、精確、廉價的蔬菜種子純度檢測技術，顯得非常必要。隨著現代分子生物學的發(fā)展，分子標記越來越多的被應用于種子純度鑒定中，如以分子雜交為基礎的RFLP、以酶切和PCR為基礎的AFLP等、以PCR反應為基礎的RAPD、SCAR、SSR、ISSR等。與其它分子標記相比，SSR標記具有許多獨特的優(yōu)點。SSR標記在單個座位上能檢測到的多態(tài)性遠高于其它幾種分子標記，而且它廣泛、隨機地分布于整個基因組，具有共顯性遺傳的特點；SSR標記可以準確高效地鑒別大量等位基因；利用雜交種雙親在一些SSR位點的差異，可以將呈父母本互補帶型的雜交種與其雙親、甚至也可以將一些異源花粉造成的雜交種區(qū)分開。由于上述特點，SSR標記逐步成為蔬菜作物品種鑒定的理想分子標記之一。迄今為止簡單重復序列(Simple sequence repeat, SSR)標記已在多種農作物種子的品種純度鑒定中得到應用。根據建立SSR標記序列性質不同，SSR標記可分為，基因組SSR (gSSR)和表達序列標簽SSR (EST-SSR)0與構建小片段基因組文庫進行SSR的篩選建立gSSR標記相比，從EST數據庫中獲得SSR建立EST-SSR標記要經濟得多；而且EST-SSR標記來源于DNA的轉錄區(qū)域，比gSSR標記具有更高的通用性。李新海等利用SSR標記研究了 70份我國主要玉米自交系的遺傳變異(參見《中國農業(yè)科學》，2003年第36卷第6期，《利用SSR標記劃分70份我國玉米自交系的雜種優(yōu)勢群》)；番興明等利用SSR標記將我國溫帶玉米主要雜種優(yōu)勢群進行了劃分(參見《作物學報》，2003年11月，第29卷第6期，《利用SSR標記對29個熱帶和溫帶玉米自交系進行雜種優(yōu)勢群的劃分》)；李穩(wěn)香等用SSR標記對10個雜交水稻組合的子一代種子純度進行了鑒定(參見《福建農林大學》，2006年，利用SSR標記構建水稻特征指紋及種子純度分析的研究);彭鎖堂等對我國9個主要的雜交水稻組合及其親本進行了 SSR標記分析(參見《中國水稻科學》，2003年01期，我國主要雜交水稻組合及其親本SSR標記和純度鑒定)。陳琢等開發(fā)了甘藍的EST-SSR標記(參見《園藝學報》，2010年02期，甘藍EST-SSR標記的開發(fā)與應用)。李麗和鄭曉鷹建立了用于白菜和大白菜品種鑒定的由3個引物對組成的6套EST-SSR復合標記組合(參見《園藝學報》，2009年11期，用于白菜和大白菜品種鑒定的EST-SSR復合標記的建立)。但是有關大白菜EST-SSR引物的開發(fā)遠未達到飽和。為了提高EST-SSR標記的密度和提高大白菜品種鑒定的效果，有必要開發(fā)更多的EST-SSR標記。

發(fā)明內容
本發(fā)明針對現有技術的不足，提供大白菜EST-SSR標記引物及其在品種鑒定中的應用。大白菜EST-SSR標記引物BRE28，它由核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的下游引物組成。大白菜EST-SSR標記引物BRE121，它由核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示的上游引 物和核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示的下游引物組成。大白菜EST-SSR標記引物BRE131，它由核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示的下游引物組成。上述大白菜EST-SSR標記引物BRE28、大白菜EST-SSR標記引物BRE121和/或大白菜EST-SSR標記引物BRE131在大白菜品種鑒定中的應用。上述應用，步驟如下(I)利用改良的CTAB法提取待鑒定樣品總DNA ；(2)以步驟(I)提取的待鑒定樣品總DNA為模板DNA，引物為大白菜EST-SSR標記引物BRE28、大白菜EST-SSR標記引物BRE121或大白菜EST-SSR標記引物BRE131進行PCR擴增，PCR采用20 μ L反應體系40ng 模板 DNA, I XPCR buffer (含 20mmol · L-1 MgCl 2),200 μ mol · L 1 NTPs,引物 O. I μ mol · L \IU TaqDNA 聚合酶；PCR擴增條件如下95°C 預變性 5min ;94°C變性 45s，56°C退火 45s，72°C 延伸 lmin，共計 35 個循環(huán)；72°C延伸 10min,4°C IOmin 終止反應；(3)將步驟(2) PCR擴增后的產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染顯影并與標準樣品聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染顯影的泳帶進行對照。所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳為6%聚丙烯酰胺凝膠電泳。所述步驟(3)的具體步驟如下將步驟(2) PCR擴增后的產物與上樣緩沖液混勻后，取4μ I點樣，進行電泳分離，電極緩沖液為IXTBE (Tris-硼酸)，在25°C、2000V恒壓下電泳2h，通過銀染法顯影，將顯影后的泳帶與標準樣電泳后顯影的泳帶進行對照。上述電泳在Sequi-Gen GT核酸電泳系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)中進行。上述上樣緩沖液為常用緩沖液，也可采用如下成分的緩沖液，配制過程按本領域常用技術98%的去離子甲酰胺，IOmM EDTA (pH8. O)，O. 025% 二甲苯青，O. 025%溴酚蘭。改良的CTAB法、銀染顯影均可按現有技術進行，其他操作如無特別說明均為本領域常用技術。本發(fā)明的有益效果
為了提聞SSR標記的密度和提聞大白菜品種鑒定的效果,本發(fā)明提供了 3對新的EST-SSR引物，分別被命名為大白菜EST-SSR標記引物BRE28、大白菜EST-SSR標記引物BRE121和大白菜EST-SSR標記引物BRE131，并將它們應用于品種純度鑒定中。利用3對EST-SSR引物對13個大白菜品種的DNA進行擴增，并利用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染檢測。發(fā)現這3對EST-SSR引物的擴增產物都呈現雙親互補帶型，而且?guī)烷g大小差異明顯，能夠很好的區(qū)分雜交種和親本自交系、鑒別不同的品種。對同一品種內的個體間的擴增產物，其帶型一致，3對EST-SSR引物用于品種純度檢測，體現品種內的一致性。


圖I是本發(fā)明涉及的3對EST-SSR標記引物對18個大白菜樣品的檢測結果；其中泳道I、大白菜691，2、大白菜690，3、大白菜雜交種773，4、大白菜668，5、大白菜663,6、大白菜雜交種761,7、大白菜691,8、大白菜690,9、大白菜雜交種773,10、大白 菜夏白I號，11、大白菜夏白45,12、大白菜夏優(yōu)2號，13、大白菜夏優(yōu)5號，14、大白菜高抗2號，15、大白菜豐抗78,16、大白菜早熟5號，17、大白菜夏白I號，18、大白菜夏白45。圖2是引物BRE131對8個親本691個體、6個690個體以及I個雜交種773(691 X 690)個體DNA的擴增結果；圖3是引物BRE121對10個大白菜品種夏白45個體DNA的擴增結果；圖4是引物BRE28對12個大白菜夏白I號個體DNA的擴增結果。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明做進一步闡述，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。實施例中大白菜691 (自交系)、大白菜690 (自交系)、大白菜668 (自交系)、大白菜663 (自交系)、大白菜夏白I號、大白菜夏白45、大白菜夏優(yōu)2號、大白菜夏優(yōu)5號、大白菜高抗2號、大白菜豐抗78、大白菜早熟5號均為市售產品，也可購自山東省農業(yè)科學院蔬菜研究所。大白菜雜交種773為大白菜691 (父本)與大白菜690 (母本)雜交獲得的一代雜交種。大白菜雜交種761為大白菜668 (父本)與大白菜663 (母本)雜交獲得的一代雜交種。實施例中所用大白菜EST-SSR標記引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。實施例I.大白菜EST-SSR標記引物的開發(fā)開發(fā)引物所用的大白菜EST 序列來自 GenBank(http://www. ncbi. nlm. nih. gov),時間截止到2007年10月31日，共有大白菜(B. rapa ssp. pekinensis)EST序列147217個。本研究采用147217個大白菜EST序列開發(fā)SSR引物。對下載到的大白菜EST序列參照葛佳等中的方法進行前期處理(參見《農業(yè)生物技術學報》，2005年第04期，《大白菜表達序列標簽SSR標記分析》)，包括除去EST序列中存在的載體序列5’端polyT和3’端polyA序列以及含有歧義堿基的序列，除去小于IOObp的序列。然后利用SeqMan程序(Lasergene軟件包，DNAStar Inc.)對處理后的EST序列進行重疊群(contigs)構建。用 MISA 軟件(http://www. pgrc. ipk-gatersleben. de/misa)在構建的重疊群中篩選SSR標記，標準參見Zhang L D, Yuan D，Yu S，Li Z, Cao Y，MiaoZ, Qian H, Tang K. Preference of simple sequence repeats in coding and non-codingregions of Arabidopsis thaliana[J]· Bioinformatics, 2004，20:1081-1086。對結果進行分析篩選，最終選取其中的3對引物用于品種鑒定分析，分別命名為大白菜EST-SSR標記引物BRE28 (上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示)、大白菜EST-SSR標記引物BRE121 (上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示)和大白菜EST-SSR標記引物BRE131 (上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示)。2.大白菜EST-SSR標記引物在品種鑒定中的應用大白菜品種鑒定的步驟如下(I)利用改良的CTAB法提取待鑒定樣品總DNA ； 選用大白菜品種(系)691 (自交系)、690 (自交系)、雜交種773 (691 X690)、668(自交系)、663 (自交系)、雜交種761 (668X663)、大白菜夏白I號、夏白45、夏優(yōu)2號、夏優(yōu)5號、高抗2號、豐抗78、早熟5號。(2)以步驟(I)提取的待鑒定樣品總DNA為模板DNA，引物為大白菜EST-SSR標記引物BRE28、BRE121和BRE131進行PCR擴增，PCR采用20 μ L反應體系:40ng 模板 DNA, I XPCR buffer (含 20mmol · L-1 MgCl2),200 μ mol · L-1 NTPs，引物 0. I μ mol · ΛIU TaqDNA 聚合酶；PCR擴增條件如下95°C 預變性 5min ;94°C變性 45s，56°C退火 45s，72°C 延伸 lmin，共計 35 個循環(huán)；72°C延伸 10min,4°C IOmin 終止反應；(3)將步驟(2) PCR擴增后的產物與上樣緩沖液(98%的去離子甲酰胺IOmMEDTA (pH8. 0)，0. 025% 二甲苯青，0. 025%溴酚蘭)混合均勻后，取10 μ I點樣，在Sequi-GenfGT核酸電泳系統(tǒng)(Bio-Rad, USA)中通過6%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，電極緩沖液為IXTBE (Tris-硼酸)，在25°C、2000V恒壓下電泳2h。通過銀染法顯影，拍照、記錄結果(見附圖I)。上述改良的CTAB法提取總DNA，采用如下操作進行I)向15ml離心管中預先加入5ml CTAB抽提液及0. Iml的β -巰基乙醇，混勻，65 °C預熱，得抽提液；2)取Ig樣品幼葉用液氮磨成粉末，轉入步驟I)制得的抽提液中，搖勻；于65°〇水浴45min,每10 15分鐘顛倒I次,得DNA初提液；3)向步驟2)制得的DNA初提液中加入等體積氯仿與異戊醇的混合液(二者體積比為24 : I),顛倒混勻，乳化IOmin后,IOOOOrpm室溫離心IOmin,取上清液；4)向步驟3)制得的上清液中加入等體積的異丙醇和1/10 1/5體積的醋酸鈉溶液(3M),顛倒混勻I 2分鐘,于4°C、IOOOOrpm離心IOmin,取白色沉淀；5)用75%乙醇漂洗3次,然后用無水乙醇漂洗I次，室溫干燥去除乙醇后，在65°C水浴中，用200 μ I TriS-EDTA溶解沉淀，即得總DNA溶液。上述銀染法顯影，采用如下操作進行I、電泳完畢后，膠板用10wt%醋酸溶液緩慢搖動并固定15分鐘，然后，去離子水漂洗3次；2、將漂洗后的膠板用含有O. lwt%硝酸銀和O. 15wt%甲醒的溶液染色30分鐘；3、染色后，用去離子水漂洗膠板，然后，用含有3%碳酸鈉和O. 15%甲醛的溶液染色3-5分鐘，緩慢搖動，直到條帶清晰；然后放入10%醋酸溶液固定10分鐘，然后用去離子水漂洗5 10分鐘，晾干，照相記錄。利用本發(fā)明所述3對EST-SSR引物對13個大白菜品種的DNA進行擴增，并利用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染檢測。發(fā)現這3對EST-SSR引物的擴增產物都呈現雙親互補帶 型，而且?guī)烷g大小差異明顯，能夠很好的區(qū)分雜交種和親本自交系。圖中I 9泳道是3組親本自交系，10 18泳道是商業(yè)雜交種。可以看出，通過特征條帶完全可以區(qū)分不同的親本自交系和雜交種。另外，我們利用大白菜EST-SSR引物BRE131對自交系690、691以及雜交種773的種子進行了鑒定，利用大白菜EST-SSR引物BRE121對大白菜夏白45進行了品種純度鑒定，利用大白菜EST-SSR引物BRE28對夏優(yōu)I號大白菜種子進行了鑒定(如圖2，3，4所示)。具體操作同上述方法，先提取個體植株的DNA，然后進行EST-SSR引物擴增，再進行電泳和銀染顯色。結果顯示，相同品種(材料)不同個體的帶型一致。這些結果說明，這3對大白菜EST-SSR引物用于大白菜品種純度檢測，可以體現品種內的一致性。
權利要求
1.大白菜EST-SSR標記引物BRE131，它由核苷酸序列如SEQID NO. 5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示的下游引物組成。
2.權利要求I所述大白菜EST-SSR標記引物BRE131在大白菜品種鑒定中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，步驟如下 (1)利用改良的CTAB法提取待鑒定樣品總DNA； (2)以步驟(I)提取的待鑒定樣品總DNA為模板DNA，引物為大白菜EST-SSR標記引物BRE131進行PCR擴增，PCR采用20 μ L反應體系 40ng 模板 DNA，I XPCR buffer,200 μ mol · L-1NTPs,引物 O. I μ mol · Λ IU TaqDNA聚合酶； PCR擴增條件如下 95°C預變性5min ;94°C變性45s，56°C退火45s，72°C延伸lmin，共計35個循環(huán)；72°C延伸IOmin, 4。。IOmin終止反應； (3)將步驟(2)PCR擴增后的產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染顯影并與標準樣品聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染顯影的泳帶進行對照。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳為6%聚丙烯酰胺凝膠電泳。
5.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述步驟(3)中的聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟如下將步驟(2) PCR擴增后的產物與上樣緩沖液混勻后，取4μ I點樣，進行電泳分離，電極緩沖液為1ΧΤΒΕ，在25°C、2000V恒壓下電泳2h。
全文摘要
本發(fā)明涉及大白菜EST-SSR標記引物及其在品種鑒定中的應用，屬于分子生物學技術領域。本發(fā)明提供大白菜EST-SSR標記引物BRE131的序列及上述標記引物在大白菜品種鑒定中的應用。本發(fā)明所述EST-SSR引物的擴增產物都呈現雙親互補帶型，而且?guī)烷g大小差異明顯，能夠很好的區(qū)分雜交種和親本自交系、鑒別不同的品種。對同一品種內的個體間的擴增產物，其帶型一致。
文檔編號C12N15/11GK102876671SQ20121040480
公開日2013年1月16日 申請日期2010年7月26日 優(yōu)先權日2010年7月26日
發(fā)明者高建偉, 劉立鋒, 周新成, 李化銀, 李利斌, 張庶 申請人:山東省農業(yè)科學院蔬菜研究所