專利名稱：一種用于檢測(cè)溶血性鏈球菌的核酸適體、互補(bǔ)序列及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域、食品檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種以膠體金的熒光淬滅為基礎(chǔ)的核酸適體、互補(bǔ)序列及檢測(cè)溶血性鏈球菌的方法。
背景技術(shù)：
溶血性鏈球菌呈球形或橢圓形 ，直徑O. 6-1. O μ m,呈鏈狀排列，長短不一，從4-8個(gè)至20-30個(gè)菌細(xì)胞組成不等，鏈的長短與細(xì)菌的種類及生長環(huán)境有關(guān)。該菌不形成芽胞，無鞭毛，易被普通的堿性染料著色，革蘭氏陽性，老齡培養(yǎng)或被中性粒細(xì)胞吞噬后，轉(zhuǎn)為革蘭氏陰性。該菌為需氧或兼性厭氧菌，營養(yǎng)要求較高，普通培養(yǎng)基上生長不良，需補(bǔ)充血清、血液、腹水，大多數(shù)菌株需核黃素、維生素B6、煙酸等生長因子。最適生長溫度為37°C，在20-42°C能生長，最適pH為7.4-7.6。在血清肉湯中易成長鏈，管底呈絮狀或顆粒狀沉淀生長。在血平板上形成灰白色、半透明、表面光滑、邊緣整齊、直徑O. 5-0. 75mm的細(xì)小菌落，不同菌株溶血程度不一。溶血性鏈球菌在自然界中分布較廣，存在于水、空氣、塵埃、糞便及健康人和動(dòng)物的口腔、鼻腔、咽喉中，可通過直接接觸、空氣飛沫傳播或通過皮膚、粘膜傷口感染，被污染的食品如奶、肉、蛋及其制品也會(huì)對(duì)人類進(jìn)行感染。一般來說，溶血性鏈球菌常通過以下途徑污染食品1、食品加工或銷售人員口腔、鼻腔、手、面部有化膿性炎癥時(shí)造成食品的污染；2、食品在加工前就已帶菌、奶?；蓟撔匀橄傺谆蛐笄菥植炕摃r(shí)，其奶和肉尸某些部位污染；3、熟食制品因包裝不善而使食品受到污染。溶血性鏈球菌是一種常見的病原微生物，可引起食物中毒與臨床感染，感染人體可導(dǎo)致新生兒敗血癥、腦膜炎、肺炎等多種嚴(yán)重感染性疾病，甚至死亡。溶血性鏈球菌感染具有傳染源廣，危害大等特點(diǎn)，同時(shí)該菌的自然來源較廣。其相關(guān)檢測(cè)技術(shù)較繁瑣，檢測(cè)周期長，按照國家食品微生物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)GB4789程序培養(yǎng)檢測(cè)需要3天時(shí)間，同時(shí)儀器設(shè)備硬件要求高。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)在已建立了以PCR為基礎(chǔ)的多項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)如免疫PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、多重PCR，及以抗原檢測(cè)為主的免疫學(xué)檢測(cè)法。針對(duì)溶血性鏈球菌scpA基因設(shè)計(jì)特異性LAMP擴(kuò)增引物，進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，能有效地檢出致病性溶血性鏈球菌。這些檢測(cè)方法快捷、靈敏，準(zhǔn)確度較高。但是，這些針對(duì)單一族溶血性鏈球菌的現(xiàn)代檢測(cè)方法均需一定的設(shè)備和技術(shù)要求，且試劑費(fèi)用較貴，難以推廣普及。因此，建立溶血性鏈球菌特別是致病性菌株的準(zhǔn)確快速檢測(cè)對(duì)于控制該類細(xì)菌引起的食物中毒具有重要意義因此進(jìn)一步探索該菌的快速、靈敏的檢測(cè)方法對(duì)食品中該菌的污染監(jiān)測(cè)、該菌的疾病診斷和流行病學(xué)調(diào)查顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供以膠體金淬滅熒光為基礎(chǔ)的一種用于檢測(cè)溶血性鏈球菌的核酸適體、互補(bǔ)序列及檢測(cè)方法，本發(fā)明的方法能快速、特異、靈敏地檢測(cè)溶血性鏈球菌。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為一種用于檢測(cè)溶血性鏈球菌的核酸適體及其互補(bǔ)序列，核酸適體的序列命名為序列A，互補(bǔ)序列命名為序列B，具體序列如下序列A :5，-CAGATGCACACGCTGAAGAAACTGAGGTCGTAGGTTTTCTTCGGG-3’ ；序列B :5，-CGTGTGCATCTGAAAAAAAAAA-SH3，；其中序列A的5’端有突光報(bào) 告基團(tuán)。進(jìn)一步的，所述的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM。本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)溶血性鏈球菌的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟I)采用常規(guī)方法制備納米金顆粒；2)納米金顆粒與互補(bǔ)序列反應(yīng)，形成互補(bǔ)寡核苷酸的納米金顆粒覆蓋體；3))將步驟2制備的互補(bǔ)寡核苷酸的納米金顆粒覆蓋體，與權(quán)利要I或2所述的核酸適體反應(yīng)，覆蓋體上的納米金顆粒猝滅核酸適體上的熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)；4)在步驟3的反應(yīng)體系中，加入溶血性鏈球菌，溶血性鏈球菌與核酸適體特異性結(jié)合，使其與覆蓋有納米金顆粒的互補(bǔ)寡核苷酸分離，釋放出的核酸適體標(biāo)記的熒光基團(tuán)使熒光信號(hào)重新恢復(fù)。用熒光分光光度計(jì)測(cè)量熒光信號(hào)強(qiáng)度以檢測(cè)溶血性鏈球菌的量，其最低檢測(cè)限為33CFU/ml。本發(fā)明采用納米金顆粒與核酸適體序列結(jié)合快速檢測(cè)溶血性鏈球菌的原理利用與溶血性鏈球菌特異性結(jié)合的單鏈DNA核酸適體既可以與靶蛋白特異結(jié)合又能與互補(bǔ)寡聚核苷酸形成雙鏈的特點(diǎn)，利用納米金顆粒猝滅熒光染料的特點(diǎn)，通過將溶血性鏈球菌引入到體系中后熒光信號(hào)的改變，用熒光分光光度計(jì)測(cè)量熒光信號(hào)強(qiáng)度來實(shí)現(xiàn)對(duì)溶血性鏈球菌的分析。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果I)特異性強(qiáng)本發(fā)明尋找并合成了與溶血性鏈球菌特異性結(jié)合的帶有熒光報(bào)告基團(tuán)FAM的核酸適體。并用阪崎腸桿菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌作為對(duì)照菌株。此核酸適體僅與溶血性鏈球菌有高特異性結(jié)合，與其他對(duì)照菌株結(jié)合較弱。因此能對(duì)溶血性鏈球菌進(jìn)行特異性檢測(cè)。2)靈敏度高最低檢測(cè)限為33cfu/ml。3)檢測(cè)效率高檢測(cè)周期由國標(biāo)方法(GB4788. 11-2003)的3天縮短為增菌24h后歷經(jīng)30min左右孵育反應(yīng)，檢測(cè)時(shí)間短，且可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，檢測(cè)量大。4)操作簡單操作步驟簡單，結(jié)果直接客觀，對(duì)操作人員要求不高。5)安全性高不需用到有毒害的試劑，對(duì)操作人員有一定的保護(hù)性。


圖1納米金顆粒的透射電鏡照片。圖2溶血性鏈球菌和標(biāo)記熒光的核酸適體結(jié)合激發(fā)熒光光譜。圖3不同濃度溶血性鏈球菌與標(biāo)記熒光的核酸適體結(jié)合激發(fā)熒光光譜。
圖4不同細(xì)菌與標(biāo)記熒光的核酸適體結(jié)合激發(fā)熒光光譜。圖5以Logltl [溶血性鏈球菌濃度]為X軸，最大熒光強(qiáng)度為Y軸繪制的校正曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例一1、實(shí)驗(yàn)材料1.1熒光分光光度計(jì)測(cè)量(日本日立公司F7000);透射電子顯微鏡(JEM-1230，JEOL，Japan) ;pH 計(jì)(上海 REX 儀器廠)
1. 2培養(yǎng)基腦心浸液肉湯、血平板由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)。1. 3菌種溶血性鏈球菌[CMCC(B) 32210]、金黃色葡萄球菌[ATCC6538]、沙門氏菌[CMCC(B) 50115]、銅綠假單胞菌[CMCC (B) 10104]、阪崎桿菌[ATCC29004]。2、合成了一條能與溶血性鏈球菌特異性結(jié)合的標(biāo)記了 FAM的核酸適體序列；同時(shí)合成了一條DNA靶序列的互補(bǔ)序列。3、樣品處理生物安全柜中按GB4789. 11-2003要求進(jìn)行樣品稀釋及增菌，樣品增菌液于37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h.4、使用的陽性對(duì)照菌株為β -溶血溶血性鏈球菌，陰性對(duì)照菌株為阪崎桿菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌。將上述菌種分別接于腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中，36°C培養(yǎng)24h。取β -溶血溶血性鏈球菌培養(yǎng)液1ml，進(jìn)行10倍比稀釋，得到IOc1-1O8系列稀釋度的菌懸液，分別從不同稀釋度的菌懸液中取lml，涂布于血平板，計(jì)算菌液的密度。剩下的培養(yǎng)液IOOOOrpm,離心lOmin。其他的陰性菌株也按上述方法培養(yǎng),離心,但不做計(jì)數(shù)。5、合成納米金顆粒檸檬酸鈉(38. SmM ;50毫升)迅速添加到沸騰的氯金酸(I毫米，250毫升)。不停地?cái)嚢柚蠓?5分鐘。在5分鐘內(nèi)溶液的顏色從淺黃色變成深紅色，讓其冷卻至室溫。制備的納米金顆粒存放在4°C。通過透射電子顯微鏡檢測(cè)納米金顆粒的濃度。透射電鏡拍攝納米金顆粒，納米金顆粒的平均直徑為17. 94±O. lnm，結(jié)果見圖1。6、將納米金顆粒與互補(bǔ)的寡核苷酸反應(yīng)O. 50D巰基化的DNA適體加入ImllOnM的的納米金顆粒。16小時(shí)后，將2M NaCl溶液慢慢加入混合物，放置8h ;隨后加入O. 2M NaCl，放置8h ;再加入O.1M NaCl，放置8h ；最后，用O. 3M NaCl對(duì)混合液進(jìn)行處理。將經(jīng)過上述的鹽化處理過程的溶液12000rpm離心15min，用O. 3M NaCl和IOmM磷酸鹽緩沖液(pH7. O)將紅色沉淀洗三遍。最后用O. 3M NaCl和IOmM磷酸鹽緩沖液(pH7. O)將膠體重懸，將固定好的覆蓋了納米金顆粒的寡核苷酸放在4°C備用。將I μ M靶DNA加到上述溶液中?；旌衔镫s交過夜后12000rpm離心15分鐘。最后紅色沉淀重懸于在O. 3M NaCl和IOmM磷酸鹽緩沖液(pH值7. O)緩沖液中。7、溶血性鏈球菌的測(cè)定PBS 緩沖液(2M NaCl 和 IOmM 磷酸鹽(pH :7. O) ；0. 3M NaCl 和 IOmM 磷酸鹽(pH 值7.0) ;10mM磷酸鹽(pH值7. O))將60 μ L的核酸適體覆蓋的納米探針與不同濃度溶血性鏈球菌混合。然后在25°C室溫下孵育30分鐘，最后，用熒光分光光度計(jì)測(cè)量。本發(fā)明采用的方法檢測(cè)周期由國標(biāo)方法(GB4788. 11-2003)的3天縮短為增菌24h后歷經(jīng)30min左右孵育反應(yīng)，檢測(cè)時(shí)間短，檢測(cè)效率高，且可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，檢測(cè)量大。8、熒光測(cè)定在FAM的最大吸收波長(490nm)下，當(dāng)FAM標(biāo)記的核酸適體存在時(shí)，能觀察到顯著的熒光發(fā)射強(qiáng)度(圖2)。與納米金反應(yīng)后，熒光信號(hào)被猝滅。然而，在515nm下存在IO8CFU/ml溶血性鏈球菌的熒光強(qiáng)度是不含溶血性鏈球菌熒光強(qiáng)度的2. 5倍，因此本發(fā)明提供的方法特異性強(qiáng)。觀察到的熒光猝滅現(xiàn)象很大程度取決于納米金顆粒的超高的猝滅熒光的能力。當(dāng)溶血性鏈球菌的濃度從102CFU/mL到107CFU/mL，在515nm波長下，熒光信號(hào)逐漸增加。9、檢測(cè)限以Logltl[溶血性鏈球菌濃度]為X軸，最大熒光強(qiáng)度為Y軸繪制校正曲線。檢測(cè) 溶血性鏈球菌線性范圍在4. 9X 104-4. 9X 107CFU/mL，以最低值計(jì)算檢出限33CFU/mL (根據(jù)IUPAC定義(⑶L = 3Sb/m))，因此本發(fā)明提供的的方法靈敏度高。本發(fā)明適用于醫(yī)療、生物技術(shù)、環(huán)保、食品飲料、奶制品、釀酒、水務(wù)處理等各領(lǐng)域，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健食品工業(yè)、制藥、生物研究等領(lǐng)域的溶血性鏈球菌的檢測(cè)。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式
，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)溶血性鏈球菌的核酸適體及其互補(bǔ)序列，其特征在于核酸適體的序列命名為序列A，互補(bǔ)序列命名為序列B，具體序列如下序列 A :5’ -CAGATGCACACGCTGAAGAAACTGAGGTCGTAGGTTTTCTTCGGG-3’ ；序列 B :5’ -CGTGTGCATCTGAAAAAAAAAA-SH3’ ；其中序列A的5’端標(biāo)記有突光報(bào)告基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸適體及其互補(bǔ)序列，其特征在于，所述的熒光報(bào)告基團(tuán)為 FAM。
3.一種用于檢測(cè)溶血性鏈球菌的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟1)采用常規(guī)方法制備納米金顆粒；2)納米金顆粒與權(quán)利要求1或2所述的互補(bǔ)序列反應(yīng)，形成互補(bǔ)寡核苷酸的納米金顆粒覆蓋體；3)將步驟2制備的互補(bǔ)寡核苷酸的納米金顆粒覆蓋體，與權(quán)利要I或2所述的核酸適體反應(yīng)，覆蓋體上的納米金顆粒猝滅核酸適體上的熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)；4)在步驟3的反應(yīng)體系中，加入溶血性鏈球菌，溶血性鏈球菌與核酸適體特異性結(jié)合， 使其與覆蓋有納米金顆粒的互補(bǔ)寡核苷酸分離，釋放出的核酸適體標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)使熒光信號(hào)重新恢復(fù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于檢測(cè)溶血性鏈球菌的檢測(cè)方法，其特征在于所述的熒光信號(hào)是用熒光分光光度計(jì)測(cè)量的，其最低檢測(cè)限為33CFU/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的一種用于檢測(cè)溶血性鏈球菌的檢測(cè)方法，其特征在于 所述的溶血性鏈球菌為β-溶血性鏈球菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)溶血性鏈球菌的核酸適體、互補(bǔ)序列及檢測(cè)方法，本發(fā)明屬于臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域及食品檢測(cè)領(lǐng)域，本發(fā)明設(shè)計(jì)了連接有FAM熒光信號(hào)的與溶血性鏈球菌特異性結(jié)合的核酸適體，及與其互補(bǔ)的寡核苷酸序列，建立了用于檢測(cè)溶血性鏈球菌的以膠體金淬滅熒光為基礎(chǔ)的核酸適體生物傳感器檢測(cè)方法，本發(fā)明主要用于溶血性鏈球菌的快速檢測(cè)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)效率高、操作簡單且安全性高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK102994633SQ20121040882
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月12日
發(fā)明者彭新凱, 李樂, 聶靜苑, 鐘菲菲, 劉子音, 黃亮, 楊麗霞, 夏立新 申請(qǐng)人:湖南省食品安全生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心