專利名稱：一種黃瓜疫霉菌lamp引物及其快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種黃瓜疫霉菌LAMP引物及其快速檢測方法，專用于黃瓜疫霉菌高靈敏度快速分子檢測 ，同時可用于田間黃瓜疫病的早期診斷和病菌的監(jiān)測和鑒定，屬于農(nóng)作物病害檢測、鑒定及防治技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
黃瓜疫霉iPhytophthora me I on is Kat sura)由 Katsura 在 1968 年首次從摧病的黃瓜上分離得到，并鑒定為新種，隨后中國、日本、埃及、土耳其、韓國、印度等國也相繼報道此病原。由該菌引起的黃瓜疫病是中國黃瓜產(chǎn)區(qū)發(fā)生最嚴(yán)重的病害之一，主要為害植株的莖、葉及果實，從苗期到成株期均可發(fā)生。該病菌存活于土壤之中，潛育期短，傳播速度快，侵染力強(qiáng)，對植物破壞性大。溫濕度適合的情況下在極短時間內(nèi)可導(dǎo)致病害大流行，因疫病為害而損失的黃瓜產(chǎn)量高達(dá)80%。黃瓜疫霉能侵染黃瓜、西葫蘆、哈密瓜、冬瓜等作物。對發(fā)病植物進(jìn)行快速準(zhǔn)確的病害診斷、對無病植物材料和植物生長環(huán)境中病原菌的及時檢測和監(jiān)測是控制植物病害發(fā)生、流行和成災(zāi)的重要基礎(chǔ)。因此建立黃瓜疫霉菌快速檢測體系，早期對發(fā)病植株及土壤進(jìn)行疫霉菌快速準(zhǔn)確檢測，對預(yù)測病害發(fā)生情況、及時采取有效的防治措施控制病原菌的傳播和流行、減少經(jīng)濟(jì)損失都具有重要的理論和實際意義。目前對黃瓜疫霉菌的檢測大多仍沿用傳統(tǒng)的培養(yǎng)及鑒定方法，傳統(tǒng)的病原菌檢測技術(shù)是在分離得到病原物的基礎(chǔ)上，通過形態(tài)學(xué)觀察和柯赫氏法則來判斷病原物的種類。整個過程常常需要耗費大量的勞動力和時間，一般需要幾天才能完成。而且要求操作者具備專業(yè)的病原菌分離、形態(tài)學(xué)鑒定知識和豐富的經(jīng)驗。因此，以形態(tài)特征為基礎(chǔ)的常規(guī)病害診斷技術(shù)，由于其耗時長，效率低，難以滿足對黃瓜疫病診斷的實際需要，因其很容易錯過病害防治的最佳時期。因此，建立一套快速、靈敏、準(zhǔn)確的黃瓜疫霉菌檢測診斷技術(shù)不僅非常必要，而且十分迫切。PCR技術(shù)為植物病原診斷提供了快速、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)勢，然而目前PCR特異性檢測技術(shù)仍然需要PCR儀、電泳和凝膠成像系統(tǒng)等昂貴的專業(yè)儀器和分子生物學(xué)試劑，且需要分子生物學(xué)專業(yè)實驗人員操作，限制了 PCR檢測方法的推廣應(yīng)用。循環(huán)恒溫擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,簡稱 LAMP)是 2000 年由日本榮研株式會社Notomi等人開發(fā)的一種新型循環(huán)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。LAMP反應(yīng)針對靶基因的6個位點設(shè)計出4條引物,利用一種鏈?zhǔn)街脫Q活性的DNA聚合酶(fci DNA polymerase),在恒溫條件下(60 - 650C )保溫30 - 90分鐘，即可完成擴(kuò)增反應(yīng)。由于LAMP反應(yīng)的高效性和等溫快速擴(kuò)增的特點，在90分鐘內(nèi)可擴(kuò)增IO9 - 101°倍產(chǎn)物。LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測一般采用熒光染料目測觀察、瓊脂糖凝膠電泳和濁度觀察等方法。由于LAMP反應(yīng)簡單、快速、高效、經(jīng)濟(jì)等特征，因而具有極為廣泛的應(yīng)用前景。目前LAMP檢測主要應(yīng)用于人畜病原物、食品安全和環(huán)境衛(wèi)生的檢測，在植物病原菌檢測中報道極少，黃瓜疫霉菌的檢測國內(nèi)外均未見報道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中黃瓜疫霉菌的生物學(xué)檢測方法所需周期長、檢測方法特異性差，靈敏度低的問題，提供一種黃瓜疫霉菌的LAMP檢測引物以及結(jié)果可靠、易于操作、特異性強(qiáng)、靈敏度高的黃瓜疫霉菌的快速檢測方法。實現(xiàn)本發(fā)明的目的包括下列步驟
1.LAMP引物的設(shè)計
我們從GenBank中下載黃瓜疫霉Ypt (登錄號EF649778)基因序列，根據(jù)黃瓜疫霉Ypt基因序列，采用PrimerExplorer V4軟件設(shè)計一種LAMP檢測引物，包括2條外引物(F3和B3)和2條內(nèi)引物(FIP和BIP)，引物序列分別為
F3 :5， -AAATTCGCACGATCGAGCT-3’
B3 :5’ -CCGTGACGTCGTACACCA-3’·FIP :5’ -GCGCTAAGTCGCGAATGTACCG-GACGGCAAGACCATCAAGC-3’
BIP :5’ -CTATTGTAGTGGGACACGGCCG-CGATAATACCGTGGGCACC-3’
2.黃瓜疫霉菌快速檢測體系的建立
LAMP 檢測25ul 反應(yīng)體系中 F3 與 B3 各 O. 2-0. 25uM, FIP 與 BIP 各 I. 5-1. 7uM, 20mMTris-HCl, IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl，8mM MgSO4, O. 1% Tween-20,0. 8M Betaine, I. 4 mMdNTPs,8U Bst DNA聚合酶大片段，10_50ng DNA模板，不足部分用無菌雙蒸水補(bǔ)足；LAMP反應(yīng)條件為在 60-65°C溫育 30-90 min，80°C保溫 5-lOmin。更優(yōu)選地，25ul反應(yīng)體系中 F3 與 B3 各 O. 2uM，F(xiàn)IP 與 BIP各 L 6uM，20mM Tris-HCl,IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl,8mM MgSO4,0. 1% Tween-20,0. 8M Betaine, I. 4 mM dNTPs,8U BstDNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用無菌雙蒸水補(bǔ)足；LAMP反應(yīng)條件為在63°C溫育 60 min,80°C保溫 IOmin0所述的檢測方法為熒光染料目測觀察法和瓊脂糖凝膠電泳法。所述熒光染料目測觀察法在LAMP反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物中加入Iul顯色劑，所述顯色劑為SYBR green I，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性。所述瓊脂糖凝膠電泳法取2ul PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶判斷為陰性。該方法可用于帶菌的植株和土壤的高靈敏度快速檢測。建立黃瓜疫霉菌快速、簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度高的監(jiān)測技術(shù)體系，對于黃瓜疫霉菌引起病害顯癥之前的早期監(jiān)測，確定病害防治最佳時期具有十分重要的意義。
本發(fā)明的關(guān)鍵性技術(shù)是黃瓜疫霉菌的高效特異擴(kuò)增的引物序列及其擴(kuò)增方法。為了驗證黃瓜疫霉菌的特異弓I物序列，本發(fā)明以我國福建、廣東、江蘇等省的36株黃瓜疫霉菌和22種不同真菌及11種疫霉屬和腐霉屬卵菌為供試材料，采用CTAB法提取組織中黃瓜疫霉菌的DNA。具體方法如下取50mg冷凍干燥后的菌絲粉于I. 5ml離心管中，加入900ul 2%CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)提取液(提取液的配方為2% CTAB ；100 m mo I/L Tris-HCl(三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽)，PH 8. O ；20mmol/L EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)，pH8. O ；1.4mol/L NaCl)和90ul 10% SDS (十二烷基苯磺酸鈉)后混勻，于55 60°C水浴I. 5 h,每10 min振蕩混勻一次，水浴I. 5h后離心(12，OOOrpm) 15min,取上清液加入與上清液等體積的酚/氯仿/異戊醇(酚、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1)，離心(12, OOOrpm) 5min,取上清液(水相),加入與上清液等體積的氯仿抽提一次(12，OOOrpm)離心5min,吸上清(350ul)，加0. I體積(35ul)的3mol/L NaAC溶液和2體積(700ul)的冰無水乙醇，-20°C下沉淀30min后12，OOOrpm離心5 min,輕輕地倒去上清液，加入700ul冰70%乙醇進(jìn)行洗滌(稍離心，傾掉上清)，在超凈工作臺上自然晾干無酒精味后用IXTE (10mmol/LTris-HCl, O. lmmol/L EDTA, pH8. O)溶液進(jìn)行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度計檢測DNA濃度并稀釋至50ng/ul待用。經(jīng)對供試菌株和36株黃瓜疫霉菌的特異性進(jìn)行LAMP驗證。LAMP 反應(yīng)體系 25ul :包含F(xiàn)3 與 B3 各 O. 2uM，F(xiàn)IP 與 BIP各 I. 6uM，20mM Tris-HCl，IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl,8mM MgSO4,0· 1% Tween-20,0. 8M Betaine, I. 4 mM dNTPs,8U BstDNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用無菌雙蒸水補(bǔ)足。除了來自我國福建、廣東、江蘇等省的36株黃瓜疫霉菌顯色結(jié)果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳檢測出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶外，檢測了 22種真菌菌株和11種其他卵菌顯色結(jié)果為橙色或瓊脂糖凝膠電泳沒有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。這說明該引物可被用于生產(chǎn)實踐中發(fā)病組織及土壤中黃瓜疫霉菌快速可靠的檢測和鑒定。·
①當(dāng)在用于黃瓜組織中存在黃瓜疫霉菌時，采用NaOH快速裂解法提取黃瓜疫霉菌的DNA，具體過程如下(1)將黃瓜病葉或病莖洗凈、晾干，剪取發(fā)病部位；(2)按Img病葉加入IOul (O. 5mol/L NaOH,O. 5%PVP)計量，將組織充分磨碎成糊，在12，OOOg離心機(jī)中離心5min ； (3)取上清20ul與等體積的O. I mol/L的Tris-HCl (ρΗ8· O)混合；(4)稀釋10倍、100倍、1000倍液，分別取Iul原液、10倍、100倍、1000倍液作為PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增。②當(dāng)在用于黃瓜土壤中存在黃瓜疫霉菌時，采用土壤DNA提取法提取土壤中香蕉枯萎病菌的DNA。具體方法如下取過篩的土壤冷凍抽干24-48 h后加少量石英砂，倒入液氮充分研磨，將研磨后的土壤細(xì)粉分裝至I. 5 ml離心管中，每管加入500 ul 0.4%脫脂奶粉溶液，渦旋混勻。12000 rpm離心15 min。取上清加入等體積蛋白酶K緩沖液，加終濃度為10 ug/ml蛋白酶K，55°C水浴1_3 h。水浴結(jié)束后，加入1/2體積的7. 5 M NH4AC溶液，上下顛倒混勻。12000 rpm離心15 min。吸上清加2倍體積無水乙醇_20°C沉淀(沉淀時間1.5 h)。沉淀結(jié)束后，12000 rpm離心15 min。用70%乙醇洗滌沉淀后傾去，室溫晾干。每份樣品所提DNA用10 ul TE (或無菌超純水)溶解，？ 20°C保存?zhèn)溆?。按如下LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件用所設(shè)計的引物進(jìn)行檢測
① LAMP 反應(yīng)體系 25ul :包含 F3 與 B3 各 O. 2uM，F(xiàn)IP 與 BIP 各 I. 6uM，20mM Tris-HCl,IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl,8mM MgSO4,0. 1% Tween-20,0. 8M Betaine, I. 4 mM dNTPs,8U BstDNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用無菌雙蒸水補(bǔ)足；LAMP反應(yīng)條件為在63°C溫育 60 min,80°C保溫 IOmin0②在LAMP反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物中加入Iul顯色劑，所述顯色劑為SYBR green I，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光，或取2ul擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶，即可判斷所述的黃瓜組織或土壤中存在黃瓜疫霉菌；否則所述的黃瓜組織或土壤中未存在黃瓜疫霉菌。本發(fā)明有益效果本發(fā)明方法適用于發(fā)病組織或土壤中黃瓜疫霉菌的快速可靠的檢測和鑒定，對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中黃瓜疫霉菌引起的病害防治具有重要的實用價值。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的技術(shù)優(yōu)勢和積極效果
I、結(jié)果可靠本發(fā)明所設(shè)計出的LAMP檢測引物，已經(jīng)對源于中國福建、廣東、江蘇等地的黃瓜疫霉菌和帶黃瓜疫霉菌的土樣、植物組織進(jìn)行了測試驗證，因此結(jié)果可靠性具有充分的保證；
2、特異性強(qiáng)本發(fā)明所采用的LAMP引物是針對黃瓜疫霉菌基因序列中6個不同區(qū)域設(shè)計出4條特異性引物，6個區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增，故特異性高。3、靈敏度高LAMP對黃瓜疫霉菌的檢測靈敏度在DNA水平上可達(dá)到10fg，比常規(guī)PCR檢測高1000倍。4、實用性好本發(fā)明所設(shè)計出的LAMP引物，可用于帶黃瓜疫霉菌的組織和土壤的高靈敏度快速檢測，因此本方法的實用性強(qiáng)，可滿足對帶菌組織和土壤中存在的黃瓜疫霉菌進(jìn)行快速可靠的檢測和鑒定的需要；
5、操作簡便快速應(yīng)用本發(fā)明方法，對帶黃瓜疫霉菌的組織和土壤進(jìn)行檢測可在I小時內(nèi)完成，且LAMP核酸擴(kuò)增是在等溫條件下進(jìn)行，只需一個水浴鍋即可，不需要復(fù)雜的儀·器設(shè)備和昂貴的分子試劑，結(jié)果肉眼直接可見。


圖I為本發(fā)明黃瓜疫病菌的特異LAMP檢測結(jié)果圖。圖I中A表示瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，其中泳道M為DL 2000 DNA marker，泳道I為陰性對照，泳道2為陽性對照，泳道3-8為黃瓜疫霉菌，泳道9-16為其他卵菌和真菌菌株；圖I中B表示顯色結(jié)果，其中第I管為陰性對照，第2管為陽性對照，第3 - 8管為黃瓜疫霉菌，第9 - 16管為其他卵菌和真菌菌株。圖2為本發(fā)明黃瓜疫病菌的LAMP靈敏性檢測結(jié)果圖。圖2中A表示瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，其中泳道M為DL 2000 DNA marker，泳道I - 10模板濃度分別為IOOOng,IOOng, 10ng, lng, 100 pg, 10 pg, I pg, 100 fg, 10 fg, and I fg;圖 2 中 B 表示顯色結(jié)果,其中第I - 10管模板濃度分別為IOOOng, IOOng, 10ng, Ing, 100 pg, 10 pg,
I pg, 100 fg, 10 fg, and I fg。圖3為本發(fā)明對發(fā)病植株和薯塊的檢測結(jié)果圖。圖3中A表示瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，其中泳道I為陽性對照，泳道2為陰性對照，泳道3為發(fā)病組織，泳道4為發(fā)病土壤，泳道5為健康組織；泳道M為DL 2000 DNA marker ;圖3中B表示顯色結(jié)果，其中第I管為陽性對照，第2管為陰性對照，第3管為發(fā)病組織，第4管為發(fā)病土壤，第5管為健康組織。
具體實施例方式本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容包括黃瓜疫霉菌的LAMP檢測引物，LAMP引物及其序列分別為 F3 :5， -AAATTCGCACGATCGAGCT-3’
B3 :5’ -CCGTGACGTCGTACACCA-3’
FIP :5’ -GCGCTAAGTCGCGAATGTACCG-GACGGCAAGACCATCAAGC-3’
BIP :5’ -CTATTGTAGTGGGACACGGCCG-CGATAATACCGTGGGCACC-3’
利用LAMP引物檢測黃瓜疫霉菌顯色結(jié)果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶。
主要試劑-.Bst DNA聚合酶大片段購自英國NEB公司；DNA marker購自寶生物工程大連有限公司；其余試劑均購自上海生工生物技術(shù)有限公司。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。實施例I :LAMP引物對黃瓜疫霉菌的特異性擴(kuò)增 I.黃瓜疫霉菌的LAMP特異檢測
① LAMP 反應(yīng)體系 25 ul :包含 F3 與 B3 各 O. 2uM，F(xiàn)IP 與 BIP 各 I. 6uM，20mM Tris-HCl,IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl,8mM MgSO4,0. 1% Tween-20,0. 8M Betaine, I. 4 mM dNTPs,8U BstDNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用無菌雙蒸水補(bǔ)足；LAMP反應(yīng)條件為在63°C溫育 60 min,80°C保溫 IOmin0②在LAMP反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物中加入Iul顯色劑，所述顯色劑為SYBR green I，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性?；蛉?ul擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝 膠電泳檢測，如果出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶判斷為陰性。2.檢測結(jié)果
檢測的特異性除了來自我國福建、廣東、江蘇等省的36株黃瓜疫霉菌顯色結(jié)果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶外，檢測了 11種其他卵菌和22種真菌菌株顯色結(jié)果為橙色或瓊脂糖凝膠電泳沒有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶(部分結(jié)果見圖1)，說明此引物具有很強(qiáng)的特異性。實施例2 =LAMP弓I物對黃瓜疫霉菌的靈敏性檢測 I.黃瓜疫霉菌的LAMP靈敏性檢測
采用10倍濃度系列稀釋法將提取的黃瓜疫霉菌DNA稀釋成lOOOng，IOOng, IOng,lng, 100 pg, 10 pg, I pg, 100 fg, 10 fg, and I fg 共 10 個不同濃度梯度。①LAMP 反應(yīng)體系 25ul :包含 F3 與 B3 各 0. 2uM, FIP 與 BIP 各 I. 6uM, 20mMTris-HCl, IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl，8mM MgSO4, 0.1% Tween-20,0. 8M Betaine, I. 4 mMdNTPs,8U Bst DNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用無菌雙蒸水補(bǔ)足；LAMP反應(yīng)條件為在63°C溫育60 min，80°C保溫lOmin。②在LAMP反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物中加入Iul顯色劑，所述顯色劑為SYBR green I，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性。或取2ul擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶判斷為陰性。2.檢測結(jié)果黃瓜疫霉菌LAMP靈敏性檢測，顯色結(jié)果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶,檢測靈敏度可達(dá)IOfg (見圖2)。實施例3 :發(fā)病組織或土壤中黃瓜疫霉菌的檢測。I.樣品采集植物組織樣品采自福建福州市黃瓜生產(chǎn)基地；土壤樣品采自福建省龍海市黃瓜生產(chǎn)基地。2. DNA提取及檢測
發(fā)病植物組織采用NaOH快速裂解法提取黃瓜疫霉菌DNA，發(fā)病土壤采用土壤DNA提取法提取黃瓜疫霉菌的DNA。按下述方法進(jìn)行LAMP檢測
① LAMP 反應(yīng)體系 25 ul :包含 F3 與 B3 各 O. 2uM，F(xiàn)IP 與 BIP 各 I. 6uM，20mM Tris-HCl,IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl,8mM MgSO4,0. 1% Tween-20,0. 8M Betaine, I. 4 mM dNTPs,8U BstDNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用無菌雙蒸水補(bǔ)足；LAMP反應(yīng)條件為在63°C溫育 60 min,80°C保溫 IOmin0②在LAMP反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物中加入Iul顯色劑，所述顯色劑為SYBR green I，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性。或取2ul擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶判斷為陰性。3.檢測結(jié)果
如圖3所示，發(fā)病組織或土壤中感染黃瓜疫霉菌，顯色結(jié)果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶，健康組織顯色結(jié)果則觀察到橙色熒光或瓊脂糖凝膠電泳未出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶。
權(quán)利要求
1.一種黃瓜疫霉菌的LAMP引物，其特征在于所述LAMP引物如下F3 :5， -AAATTCGCACGATCGAGCT-3’ ；B3 :5’ -CCGTGACGTCGTACACCA-3’ ；FIP :5’ -GCGCTAAGTCGCGAATGTACCG-GACGGCAAGACCATCAAGC-3’ ；BIP :5’ -CTATTGTAGTGGGACACGGCCG-CGATAATACCGTGGGCACC-3’。
2.—種黃瓜疫霉菌的LAMP檢測方法，其特征在于利用權(quán)利要求I所述的LAMP引物進(jìn)行 LAMP 反應(yīng)，25ul 反應(yīng)體系中 F3 與 B3 各 O. 2-0. 25uM, FIP 與 BIP 各 I. 5-1. 7uM, 20mMTris-HCl, IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl，8mM MgSO4, O. 1% Tween-20,0. 8M Betaine, I. 4 mMdNTPs,8U Bst DNA聚合酶大片段，10_50ng DNA模板，不足部分用無菌雙蒸水補(bǔ)足；LAMP反應(yīng)條件為在 60-65°C溫育 30-90 min，80°C保溫 5-lOmin。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃瓜疫霉菌LAMP檢測方法，其特征在于在LAMP反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入Iul顯色劑，所述顯色劑為SYBR green I，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性；或取2ul擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如出現(xiàn)梯形條帶判斷為陽性，沒有出現(xiàn)則判斷為陰性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃瓜疫霉菌LAMP引物及其快速檢測方法，專用于黃瓜疫霉菌特異檢測。主要采用設(shè)計了一種黃瓜疫霉菌的LAMP引物，見SEQNO.1-SEQNO.4。經(jīng)過恒溫擴(kuò)增和加入SYBRgreenⅠ顯色劑顯色或瓊脂糖凝膠電泳檢測，可觀察到綠色熒光或出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶。所發(fā)明的LAMP引物及其用法可被用于生產(chǎn)實踐中黃瓜疫霉菌感染的植株和土壤中黃瓜疫霉菌的快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測，同時可用于田間病害的早期診斷和病菌的監(jiān)測和鑒定，為黃瓜疫霉菌引起的病害防治提供可靠的技術(shù)和理論依據(jù)。
文檔編號C12R1/645GK102899416SQ20121040964
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月24日
發(fā)明者李本金, 陳慶河, 翁啟勇, 蘭成忠, 劉裴清 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所