專利名稱：重組人胰島素樣生長因子-2蛋白及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)基因工程蛋白藥物技術(shù)，具體來說，涉及一種重組人胰島素樣生長因子-2蛋白及其生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor, IGF)是一類多功能細胞增殖調(diào)控因子，因其化學結(jié)構(gòu)與胰島素相似而得名。人胰島素樣生長因子-2 (Human InsulinLike Growth Factor-2, hIGF2)基因由9個外顯子、8個內(nèi)含子組成,其轉(zhuǎn)錄與表達受到4個啟動子調(diào)控，為一單拷貝基因，全長3kb。成熟的人IGF2蛋白由67個氨基酸殘基組成，它 在胎兒發(fā)育、腫瘤細胞增殖、肌肉生長等方面具有重要的調(diào)控作用。IGF2與有促進有絲分裂 活性作用的胰島素具有結(jié)構(gòu)上的同源性，業(yè)已證明，IGF2至少在嚙齒類動物中是促進有絲分裂的主要生長因子。體外細胞培養(yǎng)實驗也已證明，IGF2是肌細胞生長過程中的自分泌信號。IGF2是一種潛在的胎兒生長激素。IGF2的表達與個體發(fā)育密切相關(guān)，IGF2的缺乏與人類身材矮小相關(guān)，它們的過度表達與肢端肥大有關(guān)，IGF2還可調(diào)節(jié)脂肪細胞的生長，從而影響個體的脂肪與肌肉比例。除此之外，IGF2還在器官的形成和分化中發(fā)揮重要作用。IGF2作為調(diào)節(jié)多肽，與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，如一種先天性的疾病貝-威綜合癥就是因為IGF2過度表達引起的。IGF2也與許多腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。IGF2基因的LOI已經(jīng)在橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、睪丸生殖細胞癌、乳腺癌及肺癌等20多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，而且IGF2轉(zhuǎn)基因小鼠中這些腫瘤的發(fā)生率也明顯增高。這說明IGF2在腫瘤發(fā)生中可能有著十分重要的地位。近年來，多項研究已發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸腫瘤及肝癌發(fā)生期間，IGF2mRNA的表達增強。IGF2的自分泌為某些細胞生長的初級方式，其旁分泌為廣泛基質(zhì)腫瘤如乳腺癌生長的主要方式，尚未發(fā)現(xiàn)IGF2經(jīng)自分泌調(diào)節(jié)的腫瘤。IGF2是目前生物、醫(yī)學領(lǐng)域研究的熱點，隨著其發(fā)生印跡機制的理解不斷演進，深入研究IGF2的遺傳學特征、表達機制及生物學意義，將有助于人類控制自身疾病，能為臨床診斷和治療帶來新思路。因此，IGF2重組蛋白極具開發(fā)價值。目前，主要利用大腸桿菌來生產(chǎn)重組人IGF2蛋白。而這些利用大腸桿菌來生產(chǎn)重組人IGF2蛋白的方法都有明顯的缺陷。大腸桿菌的人IGF2表達產(chǎn)物通常以包涵體形式存在，要通過變性復性等復雜操作才能得到活性形式的hIGF2，從而減少了活性蛋白的產(chǎn)率；若想得到可溶性的重組蛋白，往往采取以融合蛋白的形式進行表達，而將融合片段去除是一件非常繁瑣的工作，大大增加了生產(chǎn)的成本；最后，要得到高純度的蛋白往往需要經(jīng)過多步純化操作處理，純化的步驟越多，蛋白質(zhì)的得率就會越低，且可能導致目標產(chǎn)物的失活。

發(fā)明內(nèi)容
基于此，本發(fā)明提供一種重組hIGF2蛋白及其高效表達、純化和制備方法，該方法首次利用重組載體pET32-a(+)和表達宿主大腸桿菌BL21 CodonPlus (DE3)菌株，實現(xiàn)了hIGF2的融合且可溶表達，并獲得了大量穩(wěn)定、可溶且具有生物活性的hIGF2重組蛋白，該蛋白在一級結(jié)構(gòu)上與天然人IGF2完全相同。利用鎳親合層析可以快速將蛋白從細胞裂解上清液中分離出來，獲得高純度的Trx-hIGF2融合蛋白。利用N端帶有His X 6標記的腸激酶對Trx-hIGF2融合蛋白進行酶切，經(jīng)鎳親合層析，將未經(jīng)切割的Trx_hIGF2融合蛋白、Trx-HisX6融合片段及加入的腸激酶吸附于層析柱上，而經(jīng)切割的hIGF2重組蛋白存在于穿透液中，穿透液經(jīng)超濾濃縮后得到高純度的產(chǎn)品。利用該方法得到的hIGF2重組蛋白，能刺激NIH/3T3的增殖并激活Akt信號通路的磷酸化，表明該方法制備的重組人IGF2具有很好的生物學活性。解決上述問題的技術(shù)方案如下一種Trx_hIGF2融合蛋白的生產(chǎn)方法，主要包括以下步驟(I)克隆hIGF2基因以人腎臟細胞中提取的總mRNA為模板，先用RT-PCR擴增總
cDNA，再以該cDNA為模板，用特異引物擴增出完整hIGF2基因片段，所用hIGF2特異引物中引入BamH I酶切位點和HindIII酶切位點；回收PCR產(chǎn)物連接到質(zhì)粒pMD20_T載體，得重組質(zhì)粒hIGF2/pMD20-T，經(jīng)過測序確定為讀碼框正確的重組載體；(2)構(gòu)建原核表達載體將表達載體pET32_a(+)和步驟(I)所得的重組質(zhì)粒hIGF2/pMD20-T經(jīng)Hind III及BamH I雙酶切并純化回收，并用T4DNA連接酶連接，得重組載體pET32-a (+)/hIGF2，將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌T0P10菌株中，再從T0P10中提取重組載體pET32-a (+) /hIGF2 ;用熱激法，將重組載體pET32_a (+) /hIGF2轉(zhuǎn)入到大腸桿菌表達菌株BL21CodonPlus (DE3)中，經(jīng)LBAmp抗性平板篩選得到大腸桿菌重組轉(zhuǎn)化子；(3)Trx-hIGF2融合蛋白的表達將步驟(2)所得的大腸桿菌重組轉(zhuǎn)化子于37°C培養(yǎng)至OD6tltl為O. 55 — O. 65，加入O. 05 — I. OmM的IPTG，于溫度為20°C的條件下誘導5-7小時，超聲破碎，離心取上清液，得到大量表達的可溶性的N端帶有His X 6標記的Trx-hIGF2融合蛋白；(4) Trx-hIGF2融合蛋白的純化利用鎳親合層析法對步驟(3)所得的Trx_hIGF2融合蛋白進行純化。一種hIGF2重組蛋白的生產(chǎn)方法，主要包括以下步驟(I)克隆hIGF2基因以人腎臟細胞中提取的總mRNA為模板，先用RT-PCR擴增總cDNA，再以該cDNA為模板，用特異引物擴增出完整hIGF2基因片段，所用hIGF2特異引物中引入BamH I酶切位點和HindIII酶切位點；回收PCR產(chǎn)物連接到質(zhì)粒pMD20_T載體，得重組質(zhì)粒hIGF2/pMD20-T，經(jīng)過測序確定為讀碼框正確的重組載體；(2)構(gòu)建原核表達載體將表達載體pET32_a(+)和步驟(I)所得的重組質(zhì)粒hIGF2/pMD20-T經(jīng)Hind III及BamH I雙酶切并純化回收，并用T4DNA連接酶連接，得重組載體pET32-a (+)/hIGF2，將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌T0P10菌株中，再從T0P10中提取重組載體pET32-a (+) /hIGF2 ;用熱激法，將重組載體pET32_a (+) /hIGF2轉(zhuǎn)入到大腸桿菌表達菌株BL21 CodonPlus (DE3)中，經(jīng)LBAmp抗性平板篩選得到了大腸桿菌重組轉(zhuǎn)化子；(3)Trx-hIGF2融合蛋白的表達將步驟(2)所得的大腸桿菌重組轉(zhuǎn)化子于37°C培養(yǎng)至OD6tltl為O. 55 — O. 65，加入O. 05 — I. OmM的IPTG，于溫度為20°C的條件下誘導5-7小時，超聲破碎，離心取上清液，得到大量表達的可溶性的N端帶有His X 6標記的Trx-hIGF2融合蛋白；
(4) Trx-hIGF2融合蛋白的純化利用鎳親合層析法對步驟(3)所得的Trx_hIGF2融合蛋白進行純化；(5)利用帶有HisX6標記的腸激酶對步驟(4)所得的Trx_hIGF2融合蛋白進行酶切，經(jīng)鎳親合層析，未經(jīng)切割的Trx-hIGF2融合蛋白、Trx-His X 6蛋白片段及加入的腸激酶吸附在鎳親合層析樹脂上，而經(jīng)切割的不帶HisX6的hIGF2重組蛋白存在于穿透液中，穿透液經(jīng)超濾濃縮后得到hIGF2重組蛋白。在其中一些實施例中，步驟(I)所述hIGF2特異引物為hIGF2-上游引物5’ -GCGGATCCGCTTACCGCCCCAGTGAGAC-3’hIGF2-下游引物5，-GCTTAGTCTAGATCGGACTTGGCGGGGGTAG-3，。
在其中一些實施例中，步驟(2)所述的表達載體為pET32_a(+)，表達菌株為大腸桿菌 BL21CodonPlus (DE3)。在其中一些實施例中，步驟(4)所述的鎳親合層析方法中，所用的洗脫液為含有300mM咪唑的pH 8. O Tris-HCl溶液；所得的Trx_hIGF2融合蛋白純度為90%以上。在其中一些實施例中，步驟(5)所述濃縮后的hIGF2重組蛋白純度為95%以上。本發(fā)明所述的一種重組hIGF2蛋白及其生產(chǎn)方法具有以下優(yōu)點一是利用pET32_a(+)載體和BL21 CodonPlus (DE3)菌株，實現(xiàn)了表達產(chǎn)物與增溶因子Trx融合，得到可溶形式的hIGF2重組蛋白，優(yōu)化了可溶性重組蛋白的表達條件；二是表達產(chǎn)物帶有HisX6標簽，摸索出一條有效純化重組融合hIGF2蛋白的方法;三是利用帶有HisX6標記的腸激酶對Trx_hIGF2融合蛋白進行酶切，經(jīng)鎳親合層析，將未經(jīng)切割的的Trx-hIGF2融合蛋白、Trx-HisX6蛋白片段及加入的腸激酶吸附在鎳親合層析樹脂上，而經(jīng)切割的在氨基酸一級結(jié)構(gòu)上與天然hIGF2完全相同的重組hIGF2蛋白存在于穿透液中，穿透液經(jīng)超濾濃縮后得到高純度的hIGF2重組蛋白，所得蛋白經(jīng)M0DLI-T0F-T0F確定為hIGF2蛋白；該蛋白在一級結(jié)構(gòu)上與天然的hIGF2完全相同，既保證了 hIGF2重組蛋白的生物學活性也高效地獲得了大量穩(wěn)定的與天然hIGF2 —級結(jié)構(gòu)完全相同的重組蛋白。四是測定了大腸桿菌表達的hIGF2重組蛋白的生物活性，測定結(jié)果表明利用該方法得到的hIGF2重組蛋白，能刺激NIH/3T3的增殖并激活Akt信號通路的磷酸化。


圖I為hIGF2基因PCR結(jié)果示意圖；圖2為載體構(gòu)建示意圖；圖3為表達載體的酶切驗證圖；圖4為表達產(chǎn)物的優(yōu)化圖；圖5為表達產(chǎn)物的純化及驗證圖；圖6為融合蛋白的切割及純化圖；圖7為重組人IGF2的質(zhì)譜驗證結(jié)果；圖8-A為表達產(chǎn)物刺激NIH/3T3細胞增殖實驗分析 圖8-B為表達產(chǎn)物激活Akt信號通路的磷酸化結(jié)果分析圖。
具體實施例方式本發(fā)明選用大腸桿菌表達菌株BL21 CodonPlus (DE3)、載體擴增菌株TOPlO和表達載體pET32_a(+)均購自美國Invritrogen公司。所用的培養(yǎng)基配方如下I)LB液體培養(yǎng)基NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸餾水1L，高壓滅菌，室溫保存；2) LB/Amp平板NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸餾水1L，瓊脂粉15g，高壓滅菌后，冷卻至70°C以下,加入ImL氨節(jié)青霉素(Ampicillin) (100mg/ml),充分混均后倒板，4°C避光保存；3)LB/Amp培養(yǎng)基NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸餾水1L，高壓滅菌后，冷卻至70°C以下，加入ImL氨芐青霉素(100mg/ml)，充分混均，4°C保存；4) 50 X TAE 瓊脂糖凝膠電泳緩沖液Tris 堿 121g，冰乙酸 28. 6mL,0. 5mol/LEDTA(pH 8. 0)50mL,加蒸懼水定容至500mL,室溫保存；5)50mg/mL氨芐青霉素保存液氨芐青霉素O. 5g，加蒸餾水溶解并定容至10mL，分裝后于-20°C保存；6) 5X SDS-PAGE 上樣緩沖液1M Tris-HCl (pH 6. 8) I. 25mL, SDS O. 5g, BPB25mg,甘油2. 5mL，加去離子水溶解后定容至5mL，分裝(每份約500 μ L)后于室溫保存，使用時每份加入25 μ L β -巰基乙醇混勻；7) 5 X SDS-PAGE 電泳緩沖液=Tris 15. lg，甘氨酸 94g，SDS 5. Og，加入約 800mL 去
離子水，充分攪拌溶解后定容至1L，室溫保存；8)考馬斯亮藍R-250染色液考馬斯亮藍R-2500. 25g，加入225mL甲醇、46mL的冰乙酸、225mL去離子水并攪拌均勻，濾紙去除顆粒物質(zhì)后，室溫保存；9)考馬斯亮藍脫色液冰乙酸50mL，甲醇150mL，去離子水300mL，充分混合后，室
溫保存；所述一種重組人胰島素樣生長因子-2 (hIGF2)蛋白的生產(chǎn)方法，主要包括以下步驟I、克隆 hIGF2 基因設計一對引物，以人腎臟細胞中提取的總mRNA為模板，先用RT-PCR擴增總cDNA，再用hIGF2特異引物擴增出完整人重組hIGF2基因片段，所用hIGF2特異引物中引入BamHI酶切位點和HindIII酶切位點，PCR條件為95°C預變性，4min，一個熱循環(huán)；94°C熱變性30s，55°C褪火30s，72°C延伸30s，34個熱循環(huán)；72°C復性lOmin。所獲得的擴增片斷連接到PMD20-T載體(購自于廣州TAKARA公司)，得到重組質(zhì)粒hIGF2/pMD20-T，用PCR，酶切和核酸測序鑒定，測定序列與Genebank公布的hIGF2的序列一致?！IGF2特異引物為SEQ ID NO: I hIGF2-上游引物5，-GCGGATCCGCTTACCGCCCCAGTGAGAC-3，(斜體加下劃線部分序列代表BamH I酶切位點)；SEQ ID NO:2 hIGF2-下游引物5’ -GCTTAGTCTAGATCGGACTTGGCGGGGGTAG-3> ;(斜體加下劃線部分序列代表HindIII酶切位點)PCR結(jié)果如圖I所示。2、構(gòu)建原核表達載體(I)用經(jīng)過Hind III和BamH I雙酶切重組質(zhì)粒hIGF2/pMD20_T，獲得目的片斷hIGF2，反應體系如下(所用內(nèi)切酶及緩沖液均購自大連TAKARA公司)
權(quán)利要求
1.一種Trx-hIGF2融合蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于，主要包括以下步驟 (1)克隆hIGF2基因以人腎臟細胞中提取的總mRNA為模板，先用RT-PCR擴增總cDNA，再以該cDNA為模板，用特異引物擴增出完整hIGF2基因片段，所用hIGF2特異引物中引入BamH I酶切位點和HindIII酶切位點；回收PCR產(chǎn)物連接到質(zhì)粒pMD20_T載體，得重組質(zhì)粒hIGF2/pMD20-T，經(jīng)過測序確定為讀碼框正確的重組載體； (2)構(gòu)建原核表達載體將表達載體pET32-a(+)和步驟(I)所得的重組質(zhì)粒hIGF2/PMD20-T經(jīng)Hind III及BamH I雙酶切并純化回收，并用T4DNA連接酶連接，得重組載體pET32-a(+)/hIGF2，將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOPlO菌株中，再從T0P10中提取重組載體pET32-a (+) /hIGF2 ;用熱激法，將重組載體pET32_a (+) /hIGF2轉(zhuǎn)入到大腸桿菌表達菌株BL21CodonPlus (DE3)中，經(jīng)LBAmp抗性平板篩選得到大腸桿菌重組轉(zhuǎn)化子； (3)Trx-hIGF2融合蛋白的表達將步驟(2)所得的大腸桿菌重組轉(zhuǎn)化子于37°C培養(yǎng)至OD600為O. 55 — O. 65，加入O. 05 — I. OmM的IPTG，于溫度為20°C的條件下誘導5-7小時，超聲破碎，離心取上清液，得到大量表達的可溶性的N端帶有His X 6標記的Trx-hIGF2融合蛋白； (4)Trx-hIGF2融合蛋白的純化利用鎳親合層析法對步驟(3)所得的Trx_hIGF2融合蛋白進行純化。
2.—種hIGF2重組蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于，主要包括以下步驟 (1)克隆hIGF2基因以人腎臟細胞中提取的總mRNA為模板，先用RT-PCR擴增總cDNA，再以該cDNA為模板，用特異引物擴增出完整hIGF2基因片段，所用hIGF2特異引物中引入BamH I酶切位點和HindIII酶切位點；回收PCR產(chǎn)物連接到質(zhì)粒pMD20_T載體，得重組質(zhì)粒hIGF2/pMD20-T，經(jīng)過測序確定為讀碼框正確的重組載體； (2)構(gòu)建原核表達載體將表達載體pET32-a(+)和步驟(I)所得的重組質(zhì)粒hIGF2/PMD20-T經(jīng)Hind III及BamH I雙酶切并純化回收，并用T4DNA連接酶連接，得重組載體pET32-a(+)/hIGF2，將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌T0P10菌株中，再從T0P10中提取重組載體pET32-a (+) /hIGF2 ;用熱激法，將重組載體pET32_a (+) /hIGF2轉(zhuǎn)入到大腸桿菌表達菌株BL21CodonPlus (DE3)中，經(jīng)LBAmp抗性平板篩選得到了大腸桿菌重組轉(zhuǎn)化子； (3)Trx-hIGF2融合蛋白的表達將步驟(2)所得的大腸桿菌重組轉(zhuǎn)化子于37°C培養(yǎng)至OD600為O. 55 — O. 65，加入O. 05 — I. OmM的IPTG，于溫度為20°C的條件下誘導5-7小時，超聲破碎，離心取上清液，得到大量表達的可溶性的N端帶有His X 6標記的Trx-hIGF2融合蛋白； (4)Trx-hIGF2融合蛋白的純化利用鎳親合層析法對步驟(3)所得的Trx_hIGF2融合蛋白進行純化； (5)利用帶有HisX6標記的腸激酶對步驟(4)所得的Trx-hIGF2融合蛋白進行酶切，經(jīng)鎳親合層析，未經(jīng)切割的Trx-hIGF2融合蛋白、Trx-HisX6蛋白片段及加入的腸激酶吸附在鎳親合層析樹脂上，而經(jīng)切割的不帶HisX6的hIGF2重組蛋白存在于穿透液中，穿透液經(jīng)超濾濃縮后得到hIGF2重組蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟(I)所述hIGF2特異引物為 hIGF2-上游引物5’ -GCGGATCCGCTTACCGCCCCAGTGAGAC-3’hIGF2-下游引物5’ -GCTTAGTCTAGATCGGACTTGGCGGGGGTAG-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟(2)所述的表達載體為pET32-a(+)，表達菌株為大腸桿菌 BL21 CodonPlus (DE3)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟(4)所述的鎳親合層析方法中，所用的洗脫液為含有300mM咪唑的pH 8.0 Tris-HCl溶液；所得的Trx_hIGF2融合蛋白純度為90%以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟(5)所述濃縮后的hIGF2重組蛋白純度為95%以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求2- 6任一項所述的生產(chǎn)方法制得的hIGF2重組蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開一種重組人胰島素樣生長因子-2蛋白及其生產(chǎn)方法，表達宿主BL21(DE3)，載體pET32-a(+)，步驟如下克隆hIGF2基因；構(gòu)建原核表達載體；可溶性的N端帶有His×6標記的Trx-hIGF2融合蛋白的表達；Trx-hIGF2融合蛋白的純化；利用帶His×6標記的腸激酶對Trx-hIGF2融合蛋白進行酶切，得高純度的hIGF2。本發(fā)明首次用BL21(DE3)和pET32-a(+)，實現(xiàn)hIGF2高效可溶性融合表達；用His×6標簽及腸激酶切割技術(shù)，實現(xiàn)在蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)上，與hIGF2完全相同的重組hIGF2蛋白的制備，表達產(chǎn)物也具有生物活性。
文檔編號C12N15/70GK102936602SQ201210411529
公開日2013年2月20日 申請日期2012年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月24日
發(fā)明者吳東海, 李洪波, 胡興, 徐愛民, 李鵬, 金守光, 李娜 申請人:中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院