專利名稱：一種菊酯類農(nóng)藥降解酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)藥降解酶的制備方法技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種菊酯類農(nóng)藥降解酶的制備方法。
背景技術(shù)：
菊酯類農(nóng)藥是廣譜性殺蟲劑，具有速效、高效、低毒、低殘留的特點(diǎn)，對(duì)140多種害蟲的防治有特效。然而，用農(nóng)藥對(duì)農(nóng)作物進(jìn)行害蟲防治時(shí)將使農(nóng)作物的表面或多或少殘留一些農(nóng)藥，尤其是菊酯類農(nóng)藥降解速度慢，不僅對(duì)人體健康造成危害，而且對(duì)生態(tài)系統(tǒng)也造成一定的影響。為此，人們采用微生物對(duì)農(nóng)藥進(jìn)行降解，而微生物對(duì)農(nóng)藥的作用方式多樣，多數(shù)屬于通過(guò)酶促反應(yīng)降解農(nóng)藥。
中山大學(xué)的劉玉煥等通過(guò)(一種新型酯酶及其應(yīng)用，ZL201010547206. 8)中的高通量功能篩選的方法克隆了Sp.ZD112中具有菊酯類農(nóng)藥降解能力的新基因est825，構(gòu)建了重組表達(dá)的大腸桿菌萬(wàn).coli BL21 (DE3)/pET-28a_est825，酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)此重組大腸桿菌生產(chǎn)的重組酶在常溫下對(duì)氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯的降解率分別達(dá)到80. 82%, 82. 98%, 69. 23%和69. 65%，菊酯類農(nóng)藥降解酶降解效率高、安全無(wú)毒、環(huán)境適應(yīng)強(qiáng)，具有良好的應(yīng)用前景。目前，國(guó)內(nèi)外已出現(xiàn)通過(guò)構(gòu)建基因組文庫(kù)克隆一個(gè)菊酯類農(nóng)藥降解酶的新基因，并構(gòu)建能高效表達(dá)該基因的工程菌等相關(guān)研究，如山東農(nóng)業(yè)大學(xué)的聞艷春等(一種工程菌的高酶活及其固定化細(xì)胞對(duì)農(nóng)藥的降解，中國(guó)環(huán)境科學(xué)，1999，19(5))將抗性尖音庫(kù)蚊五帶亞種的抗有機(jī)磷農(nóng)藥基因克隆到質(zhì)粒pRL-439中，獲得高酶活工程菌，表達(dá)的酶對(duì)兩類難降解農(nóng)藥(有機(jī)氯、菊酯類)可降解90%以上，但未提及產(chǎn)酶量；中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所的喬傳令等(一種超級(jí)工程菌及其表達(dá)的解毒酶和其構(gòu)建方法及應(yīng)用，ZL200410042712. 6)分別克隆解毒酯酶和水解酶基因，將此基因分別克隆到表達(dá)載體PETDuet-I上，構(gòu)建融合表達(dá)載體pETDuet-bl-opd，最后轉(zhuǎn)化得到重組菌株并進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，該超級(jí)工程菌和解毒酶可以同時(shí)降解馬拉硫磷、對(duì)硫磷、高效氯氰菊酯、三氯殺蟲酯等有機(jī)酸酯和有機(jī)磷類農(nóng)藥，但未提及降解率及產(chǎn)酶量；Heidari Rama等(Hydrolysis of pyrethroids bycarboxylesterases from Lucilia cuprina and Drosophila melanogaster with activesites modified by in vitro mutagenesis, Insect Biochemistry and MolecularBiology, 2職，35(6) :597飛09)通過(guò)基因突變技術(shù)改變來(lái)源于綠蠅與家蠅的羧酸酯酶的活性位點(diǎn)，使得該酶對(duì)順、反式菊酯類農(nóng)藥的降解能力比野生的提高很多倍，而且突變位點(diǎn)不同，也會(huì)影響其對(duì)順、反式菊酯類農(nóng)藥的降解能力。Stok Jeanette E等(Identification,expression, and purification of a pyrethroid-hydrolyzing carboxylesterase frommouse liver microsomes, Journal of Biological Chemistry, 279 (28):29863 29869)從小鼠肝微粒中克隆了 I個(gè)能降解菊酯類農(nóng)藥的羧酸酯酶基因，并在桿狀病毒中表達(dá)、純化，還研究該酶對(duì)順、反式菊酯類農(nóng)藥的催化常數(shù)，又從小鼠的肝微粒CDNA文庫(kù)中篩選分離第2個(gè)水解菊酯類農(nóng)藥的羧酸酯酶基因。
然而，目前國(guó)內(nèi)外暫缺有關(guān)采用基因工程菌高密度發(fā)酵技術(shù)高效生產(chǎn)菊酯類農(nóng)藥降解酶的技術(shù)，因此本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)高產(chǎn)菊酯類農(nóng)藥降解酶的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種菊酯類農(nóng)藥降解酶的制備方法，該制備方法利用重組大腸桿菌高效生產(chǎn)菊酯類農(nóng)藥降解酶。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
一種菊酯類農(nóng)藥降解酶的制備方法，包括以下步驟
O以重組大腸桿菌{E. coli BL21(DE3)/pET-28a-est825}作為生產(chǎn)菌種，用甘油管將生產(chǎn)菌種在_86°C的溫度下保存；
2)種子培養(yǎng)將甘油管中的生產(chǎn)菌種按2 4%的接種量接入搖瓶種子培養(yǎng)基，以轉(zhuǎn)速為20(T220r/min、溫度為37°C、培養(yǎng)時(shí)間為8 IOh的培養(yǎng)條件在恒溫?fù)u床中培養(yǎng)；在重組大腸桿菌的發(fā)酵過(guò)程中，質(zhì)粒穩(wěn)定性對(duì)產(chǎn)物表達(dá)非常重要，在較高的溫度如37°C下，重組大腸桿菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性較高。3)發(fā)酵培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子液以2 5%的接種量接入裝有3. 75^4. 5L發(fā)酵培養(yǎng)基的7. 5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為24 28h，在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)通入無(wú)菌空氣和改變攪拌轉(zhuǎn)速來(lái)控制發(fā)酵液溶氧值維持在20% 25% ;本發(fā)明的發(fā)酵規(guī)模不限于7. 5L，可根據(jù)實(shí)際需要適當(dāng)擴(kuò)大發(fā)酵規(guī)模。4)補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)4 6h后，流加甘油和酵母粉的混合補(bǔ)料液，控制菌體的比生長(zhǎng)速率為O. Γθ. 21Γ1，補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)階段持續(xù)的時(shí)間為l(Tl4h ;混合補(bǔ)料液通過(guò)流加的方式補(bǔ)充，補(bǔ)料速率以能夠維持菌體生長(zhǎng)的及表達(dá)菊酯類農(nóng)藥降解酶所需、且以維持發(fā)酵系統(tǒng)中較穩(wěn)定的溶氧和PH值為依據(jù)設(shè)定，保證重組大腸桿菌的發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)源。5)乳糖誘導(dǎo)補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)至菌體的OD6tltol值達(dá)到10(Γ140時(shí)，一次性添加乳糖溶液，使發(fā)酵液乳糖的濃度為5lg/L，將溫度降至3(T35°C開始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)過(guò)程中繼續(xù)流加步驟4)中的混合補(bǔ)料液，維持發(fā)酵液中甘油的濃度為f2g/L，乳糖誘導(dǎo)的時(shí)間持續(xù)8 10h ；采用乳糖誘導(dǎo)具有成本低、環(huán)保、對(duì)人體無(wú)害的優(yōu)點(diǎn)。6)酶粉制備發(fā)酵結(jié)束后，在4 8°C的溫度下離心收集菌體，將菌體用pH6. 5^7. O的磷酸鹽緩沖液配制成質(zhì)量濃度15°/Γ20%的菌懸液，將菌懸液在4°C的溫度下、150Mpa的壓力下高壓破碎得到破碎液，將破碎液在4°C的溫度下進(jìn)行高速離心制得上清液，或用低溫微膜過(guò)濾制得過(guò)濾液，再將上清液或過(guò)濾液真空冷凍干燥即制得酶粉。其中，所述步驟2)中，所述搖瓶種子培養(yǎng)基的pH為7. 0，所述搖瓶種子培養(yǎng)基包括以下組分胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素5(Tl00mg/L。其中，所述步驟3)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6. 8，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分甘油 5 8g/L，蛋白胨 3 10g/L，酵母粉 3 8g/L，(NH4)2SO4 5 10g/L，MgSO4·7Η20 I 3g/L, KH2PO4 3. 4 6. 85g/L, K2HPO4.12H20 5. 68 11. 35g/L,微量元素液 I 2mL/L，卡那霉素5(Tl00mg/L。本發(fā)明采用甘油、蛋白胨和酵母粉等原料進(jìn)行生產(chǎn)，適于大規(guī)模生產(chǎn)。其中，所述微量元素液包括以下組分=CaCl2 2. 0g/L, ZnSO4-7H20 5. 0g/L,MnS04.H20 0. 5g/L, Na2-EDTA 18. Og/L, FeSO4*7H20 10. 0g/L，CuS04.5H20 2. 5g/L，CoC12.6H200. 2g/L, (NH4) 6Mo7024 ·4Η20 0. lg/L。
其中，所述微量元素液為經(jīng)溶于無(wú)菌水中，再用0.22 μ m的濾膜過(guò)濾除菌后的微
量元素液。其中，所述步驟3)具體為發(fā)酵培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子液以2 5%的接種量接入裝有3. 75^4. 5L發(fā)酵培養(yǎng)基的7. 5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為24 28h，并在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)通入無(wú)菌空氣和改變攪拌轉(zhuǎn)速來(lái)控制發(fā)酵液溶氧值維持在209Γ25%，通氣量為O. 5 4vvm，攪拌轉(zhuǎn)速20(Tl000r/min，培養(yǎng)溫度37°C，流加20% 25%的氨水和3mol/L的鹽酸溶液控制發(fā)酵液的PH為6. 8^7. O。其中，所述步驟4)中，所述甘油和酵母粉的混合補(bǔ)料液包括以下組分甘油30(T500g/L，酵母粉 6(Tl00g/L，卡那霉素 5(Tl00mg/L。其中，甘油含量的測(cè)定方法
采用 HPLC (高效液相色譜法)Zorbax Extend_C18 (4. 6mmX 250mm, 5 μ m)色譜柱,柱溫37°C，進(jìn)樣量10μ 1，流動(dòng)相純水，流速1.0mL/min。在補(bǔ)料發(fā)酵階段每小時(shí)檢測(cè)一次發(fā)酵液甘油濃度，監(jiān)控甘油殘余量；在乳糖誘導(dǎo)階段同樣每小時(shí)檢測(cè)甘油濃度，通過(guò)控制補(bǔ)料速率控制甘油殘量在f 2g/L。其中，菌體濃度的測(cè)定方法
采用分光光度法在600nm波長(zhǎng)下檢測(cè)發(fā)酵液的光吸收值，根據(jù)菌體濃度確定誘導(dǎo)起始點(diǎn)。其中，菊酯類農(nóng)藥降解酶的酶活力的測(cè)定方法
以對(duì)硝基苯酚乙酸酯(pNPA)為底物，采用分光光度法測(cè)定，酶活定義為在pH6. 5、溫度40°C時(shí)每分鐘催化水解pNPA生成I μ mo I對(duì)硝基苯酚所需的酶量為一個(gè)酶活單位(U)。具體測(cè)定方法如下
(1)底物母液配制稱取18.Img pNPA溶解于ImL甲醇中，即配成O. IM的底物母液,并將底物母液在4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?br> (2)測(cè)定液配制取底物母液O.4mL,緩慢加入到9. 6mL pH6. 5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，并充分混勻，即配制好測(cè)定液；
(3)酶活測(cè)定取5μ I酶液加入200 μ I的測(cè)定液中，使酶液和測(cè)定液在40°C的溫度下反應(yīng)4min制得反應(yīng)液，同時(shí)以滅活酶液做空白對(duì)照,將反應(yīng)液稀釋至一定倍數(shù)后取300 μ I加入酶標(biāo)板，在405nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，根據(jù)對(duì)硝基苯酚的濃度與405nm下的吸光值所做的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出酶促反應(yīng)所生成對(duì)硝基苯酚的量，進(jìn)而計(jì)算出酶活力。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明利用重組大腸桿菌高密度發(fā)酵技術(shù)，采用大腸桿菌\E. coli BL21(DE3)/pET-28a-est825}高效表達(dá)菊酯類農(nóng)藥降解酶，發(fā)酵過(guò)程中采用乳糖對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行誘導(dǎo)，具有成本低、環(huán)保、對(duì)人體無(wú)害的優(yōu)點(diǎn)，在發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液OD6tltol值達(dá)125 165，發(fā)酵液降解酶酶活為200(T3000U/mL，最終制得的降解酶酶粉產(chǎn)量25 40g/L，酶粉酶活為4800(T60000U/g，大大提高了菊酯類農(nóng)藥降解酶的產(chǎn)量，降低菊酯類農(nóng)藥降解酶的使用成本，為規(guī)模化生產(chǎn)菊酯類農(nóng)藥降解酶提供了一條有效、經(jīng)濟(jì)、可行的途徑。


圖I為本發(fā)明的實(shí)施例一的發(fā)酵過(guò)程曲線圖。圖2為本發(fā)明的實(shí)施例二的發(fā)酵過(guò)程曲線圖。
圖3為本發(fā)明的實(shí)施例三的發(fā)酵過(guò)程曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例一。本實(shí)施例的一種菊酯類農(nóng)藥降解酶的制備方法，包括以下步驟
O以重組大腸桿菌{E. coli BL21(DE3)/pET-28a-est825}作為生產(chǎn)菌種，用甘油管將生產(chǎn)菌種在_86°C的溫度下保存。2)種子培養(yǎng)將甘油管中的生產(chǎn)菌種按2%的接種量接入搖瓶種子培養(yǎng)基，以轉(zhuǎn)速為220r/min、溫度為37°C、培養(yǎng)時(shí)間為9h的培養(yǎng)條件在恒溫?fù)u床中培養(yǎng)；所述搖瓶種子培養(yǎng)基的PH為7. 0，所述搖瓶種子培養(yǎng)基包括以下組分胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L,卡那霉素 50mg/L。3)發(fā)酵培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子液以4%的接種量接入裝有4L發(fā)酵培養(yǎng)基的7. 5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為26h，在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)通入無(wú)菌空氣和改變攪拌 轉(zhuǎn)速來(lái)控制發(fā)酵液溶氧值維持在20%，通氣量為O. 5^4vvm,攪拌轉(zhuǎn)速20(Tl000r/min，培養(yǎng)溫度37°C，流加25%的氨水和3mol/L的鹽酸溶液控制發(fā)酵液的pH為6. 8 ;
本實(shí)施例中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH為6. 8，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分甘油5g/L，蛋白胨 5g/L，酵母粉 3g/L，(NH4)2SO4 5g/L，MgSO4.7H20 2. 5g/L，KH2PO4 6. 85g/L，K2HPO4* 12H20 11. 35g/L，微量元素液 I. 5mL/L，卡那霉素 50mg/L ；
本實(shí)施例中，所述微量元素液包括以下組分CaCl2 2. Og/L, ZnSO4-7H20 5. Og/L,MnS04.H20 0. 5g/L, Na2-EDTA 18. Og/L, FeSO4*7H20 10. 0g/L，CuS04.5H20 2. 5g/L，CoC12.6H200. 2g/L，(NH4) 6Μο7024 ·4Η20 0. lg/L ；
本實(shí)施例中，所述微量元素液為經(jīng)溶于無(wú)菌水中，再用0. 22 μ m的濾膜過(guò)濾除菌后的微量元素液。4)補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)4h后，流加甘油和酵母粉的混合補(bǔ)料液，控制菌體的比生長(zhǎng)速率為0. Γθ. 21Γ1，補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)階段持續(xù)的時(shí)間為12h ;所述甘油和酵母粉的混合補(bǔ)料液包括以下組分甘油500g/L，酵母粉100g/L，卡那霉素50mg/L ；
5)乳糖誘導(dǎo)補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)至菌體的OD6tltol值達(dá)到120時(shí)，一次性添加乳糖溶液，使發(fā)酵液乳糖的濃度為5g/L，將溫度降至33°C開始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)過(guò)程中繼續(xù)流加步驟4)中的混合補(bǔ)料液，維持發(fā)酵液中甘油的濃度為l 2g/L，乳糖誘導(dǎo)的時(shí)間持續(xù)10h。6)酶粉制備發(fā)酵結(jié)束后，在4°C的溫度下離心收集菌體，將菌體用pH6. 8的磷酸鹽緩沖液配制成質(zhì)量濃度15%的菌懸液，將菌懸液在4°C的溫度下、150Mpa的壓力下高壓破碎得到破碎液，將破碎液在4°C的溫度下進(jìn)行高速離心制得上清液，或用低溫微膜過(guò)濾制得過(guò)濾液，再將上清液或過(guò)濾液真空冷凍干燥即制得酶粉。本實(shí)施例中，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液OD6tltlnm值達(dá)165，發(fā)酵液降解酶酶活為3000U/mL，最終制得的降解酶酶粉產(chǎn)量40g/L，酶粉酶活為60000U/g。發(fā)酵過(guò)程曲線見(jiàn)圖I。實(shí)施例二。本實(shí)施例的一種菊酯類農(nóng)藥降解酶的制備方法，包括以下步驟
O以重組大腸桿菌{E. coli BL21(DE3)/pET-28a-est825}作為生產(chǎn)菌種，用甘油管將生產(chǎn)菌種在_86°C的溫度下保存。2)種子培養(yǎng)將甘油管中的生產(chǎn)菌種按2%的接種量接入搖瓶種子培養(yǎng)基，以轉(zhuǎn)速為200r/min、溫度為37°C、培養(yǎng)時(shí)間為IOh的培養(yǎng)條件在恒溫?fù)u床中培養(yǎng)；所述搖瓶種子培養(yǎng)基的PH為7. 0，所述搖瓶種子培養(yǎng)基包括以下組分胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L,卡那霉素 50mg/L。3)發(fā)酵培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子液以2%的接種量接入裝有3. 75L發(fā)酵培養(yǎng)基的7. 5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為28h，并在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)通入無(wú)菌空氣和改變攪拌轉(zhuǎn)速來(lái)控制發(fā)酵液溶氧值維持在20%,通氣量為O. 5^4vvm,攪拌轉(zhuǎn)速20(Tl000r/min，培養(yǎng)溫度37°C，流加25%的氨水和3mol/L的鹽酸溶液控制發(fā)酵液的pH為
6.9 ；
本實(shí)施例中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH為6. 8，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分甘油8g/L， 蛋白胨 5g/L，酵母粉 5g/L，(NH4)2SO4 8g/L，MgSO4.7H20 lg/L, KH2PO4 4. 57g/L, K2HPO4* 12H20
7.57g/L，微量元素液lmL/L，卡那霉素50mg/L ；
本實(shí)施例中，所述微量元素液包括以下組分CaCl2 2. Og/L, ZnSO4-7H20 5. Og/L,MnS04.H20 0. 5g/L, Na2-EDTA 18. Og/L, FeSO4*7H20 10. 0g/L，CuS04.5H20 2. 5g/L，CoC12.6H200. 2g/L，(NH4) 6Μο7024 ·4Η20 0. lg/L ；
本實(shí)施例中，所述微量元素液為經(jīng)溶于無(wú)菌水中，再用0. 22 μ m的濾膜過(guò)濾除菌后的微量元素液。4)補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)6h后，流加甘油和酵母粉的混合補(bǔ)料液，控制菌體的比生長(zhǎng)速率為0. Γθ. 21Γ1，補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)階段持續(xù)的時(shí)間為12h ;所述甘油和酵母粉的混合補(bǔ)料液包括以下組分甘油400g/L,酵母粉80g/L,卡那霉素50mg/L ；
5)乳糖誘導(dǎo)補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)至菌體的OD6tltol值達(dá)到140時(shí)，一次性添加乳糖溶液，使發(fā)酵液乳糖的濃度為6g/L，將溫度降至30°C開始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)過(guò)程中繼續(xù)流加步驟4)中的混合補(bǔ)料液，維持發(fā)酵液中甘油的濃度為l 2g/L，乳糖誘導(dǎo)的時(shí)間持續(xù)10h。6)酶粉制備發(fā)酵結(jié)束后，在4°C的溫度下離心收集菌體，將菌體用pH6. 5的磷酸鹽緩沖液配制成質(zhì)量濃度18%的菌懸液，將菌懸液在4°C的溫度下、150Mpa的壓力下高壓破碎得到破碎液，將破碎液在4°C的溫度下進(jìn)行高速離心制得上清液，或用低溫微膜過(guò)濾制得過(guò)濾液，再將上清液或過(guò)濾液真空冷凍干燥即制得酶粉。本實(shí)施例中，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液OD6tltlnm值達(dá)150，發(fā)酵液降解酶酶活為2600U/mL，最終制得的降解酶酶粉產(chǎn)量33g/L，酶粉酶活為52000U/g。發(fā)酵過(guò)程曲線見(jiàn)圖2。實(shí)施例三。本實(shí)施例的一種菊酯類農(nóng)藥降解酶的制備方法，包括以下步驟
O以重組大腸桿菌{E. coli BL21(DE3)/pET-28a-est825}作為生產(chǎn)菌種，用甘油管將生產(chǎn)菌種在_86°C的溫度下保存。2)種子培養(yǎng)將甘油管中的生產(chǎn)菌種按4%的接種量接入搖瓶種子培養(yǎng)基，以轉(zhuǎn)速為220r/min、溫度為37°C、培養(yǎng)時(shí)間為8h的培養(yǎng)條件在恒溫?fù)u床中培養(yǎng)；所述搖瓶種子培養(yǎng)基的PH為7. 0，所述搖瓶種子培養(yǎng)基包括以下組分胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L,卡那霉素 100mg/L。3)發(fā)酵培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子液以2%的接種量接入裝有3. 75L發(fā)酵培養(yǎng)基的7.5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為25h，在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)通入無(wú)菌空氣和改變攪拌轉(zhuǎn)速來(lái)控制發(fā)酵液溶氧值維持在20%，通氣量為O. 5 4VVm，攪拌轉(zhuǎn)速20(Tl000r/min，培養(yǎng)溫度37°C，流加25%的氨水和3mol/L的鹽酸溶液控制發(fā)酵液的pH為7. O ;
本實(shí)施例中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH為6. 8，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分甘油6g/L，蛋白胨 10g/L，酵母粉8g/L，(MM)2SO4 10g/L,MgS04*7H20 3g/L,KH2PO4 3. 4g/L,K2HPO4*12H205. 68g/L，微量元素液2mL/L，卡那霉素lOOmg/L ；
本實(shí)施例中，所述微量元素液包括以下組分CaCl2 2. Og/L, ZnSO4-7H20 5. Og/L,MnS04.H20 0. 5g/L, Na2-EDTA 18. Og/L, FeSO4*7H20 10. 0g/L，CuS04.5H20 2. 5g/L，CoC12.6H200. 2g/L，(NH4) 6Μο7024 ·4Η20 0. lg/L ；
本實(shí)施例中，所述微量元素液為經(jīng)溶于無(wú)菌水中，再用0. 22 μ m的濾膜過(guò)濾除菌后的微量元素液。
4)補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)5h后，流加甘油和酵母粉的混合補(bǔ)料液，控制菌體的比生長(zhǎng)速率為0. Γθ. 21Γ1，補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)階段持續(xù)的時(shí)間為IOh ;所述甘油和酵母粉的混合補(bǔ)料液包括以下組分甘油300g/L，酵母粉60g/L，卡那霉素100mg/L ；
5)乳糖誘導(dǎo)補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)至菌體的OD6tltol值達(dá)到100時(shí)，一次性添加乳糖溶液，使發(fā)酵液乳糖的濃度為8g/L，將溫度降至35°C開始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)過(guò)程中繼續(xù)流加步驟4)中的混合補(bǔ)料液，維持發(fā)酵液中甘油的濃度為l 2g/L，乳糖誘導(dǎo)的時(shí)間持續(xù)10h。6)酶粉制備發(fā)酵結(jié)束后，在4°C的溫度下離心收集菌體，將菌體用pH6. 5的磷酸鹽緩沖液配制成質(zhì)量濃度20%的菌懸液，將菌懸液在4°C的溫度下、150Mpa的壓力下高壓破碎得到破碎液，將破碎液在4°C的溫度下進(jìn)行高速離心制得上清液，或用低溫微膜過(guò)濾制得過(guò)濾液，再將上清液或過(guò)濾液真空冷凍干燥即制得酶粉。本實(shí)施例中，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液OD6tltlnm值達(dá)125，發(fā)酵液降解酶酶活為2000U/mL，最終制得的降解酶酶粉產(chǎn)量25g/L，酶粉酶活為48000U/g。發(fā)酵過(guò)程曲線見(jiàn)圖3。本發(fā)明的實(shí)施例一至實(shí)施例三中，甘油含量的測(cè)定方法
采用 HPLC (高效液相色譜法)Zorbax Extend_C18 (4. 6mmX 250mm, 5 μ m)色譜柱,柱溫37°C，進(jìn)樣量10μ 1，流動(dòng)相純水，流速1.0mL/min。在補(bǔ)料發(fā)酵階段每小時(shí)檢測(cè)一次發(fā)酵液甘油濃度，監(jiān)控甘油殘余量；在乳糖誘導(dǎo)階段同樣每小時(shí)檢測(cè)甘油濃度，通過(guò)控制補(bǔ)料速率控制甘油殘量在f 2g/L。菌體濃度的測(cè)定方法
采用分光光度法在600nm波長(zhǎng)下檢測(cè)發(fā)酵液的光吸收值，根據(jù)菌體濃度確定誘導(dǎo)起始點(diǎn)。菊酯類農(nóng)藥降解酶的酶活力的測(cè)定方法
以對(duì)硝基苯酚乙酸酯(pNPA)為底物，采用分光光度法測(cè)定，酶活定義為在pH6. 5、溫度40°C時(shí)每分鐘催化水解pNPA生成I μ mo I對(duì)硝基苯酚所需的酶量為一個(gè)酶活單位(U)。具體測(cè)定方法如下
(1)底物母液配制稱取18.Img pNPA溶解于ImL甲醇中，即配成0. IM的底物母液,并將底物母液在4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?br> (2)測(cè)定液配制取底物母液0.4mL,緩慢加入到9. 6mL pH6. 5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，并充分混勻，即配制好測(cè)定液；(3)酶活測(cè)定取5 μ I酶液加入200 μ I的測(cè)定液中，使酶液和測(cè)定液在40°C的溫度下反應(yīng)4min制得反應(yīng)液，同時(shí)以滅活酶液做空白對(duì)照,將反應(yīng)液稀釋至一定倍數(shù)后取300 μ I加入酶標(biāo)板，在405nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，根據(jù)對(duì)硝基苯酚的濃度與405nm下的吸光值所做的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出酶促反應(yīng)所生成對(duì)硝基苯酚的量，進(jìn)而計(jì)算出酶活力。 以上所述實(shí)施方式，只是本發(fā)明的較佳實(shí)施方式，并非來(lái)限制本發(fā)明實(shí)施范圍，故 凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所述的構(gòu)造、特征及原理所做的等效變化或修飾，均應(yīng)包括本發(fā)明專利申請(qǐng)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種菊酯類農(nóng)藥降解酶的制備方法，其特征在于包括以下步驟 1)以重組大腸桿菌{E.coli BL21(DE3)/pET-28a-est825}作為生產(chǎn)菌種，用甘油管將生產(chǎn)菌種在_86°C的溫度下保存； 2)種子培養(yǎng)將甘油管中的生產(chǎn)菌種按2 4%的接種量接入搖瓶種子培養(yǎng)基，以轉(zhuǎn)速為20(T220r/min、溫度為37°C、培養(yǎng)時(shí)間為8 IOh的培養(yǎng)條件在恒溫?fù)u床中培養(yǎng)； 3)發(fā)酵培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子液以2 5%的接種量接入裝有3. 75^4. 5L發(fā)酵培養(yǎng)基的7. 5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為24 28h，在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)通入無(wú)菌空氣和改變攪拌轉(zhuǎn)速來(lái)控制發(fā)酵液溶氧值維持在20% 25% ； 4)補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)4 6h后，流加甘油和酵母粉的混合補(bǔ)料液，控制菌體的比生長(zhǎng)速率為O. Γθ. 21Γ1，補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)階段持續(xù)的時(shí)間為l(Tl4h ； 5)乳糖誘導(dǎo)補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)至菌體的OD6tltol值達(dá)到10(Γ140時(shí)，一次性添加乳糖溶液，使發(fā)酵液乳糖的濃度為5lg/L，將溫度降至3(T35°C開始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)過(guò)程中繼續(xù)流加步驟4)中的混合補(bǔ)料液，維持發(fā)酵液中甘油的濃度為l 2g/L，乳糖誘導(dǎo)的時(shí)間持續(xù)8 IOh ； 6)酶粉制備發(fā)酵結(jié)束后，在4 8°C的溫度下離心收集菌體，將菌體用pH6.5^7. O的磷酸鹽緩沖液配制成質(zhì)量濃度15°/Γ20%的菌懸液，將菌懸液在4°C的溫度下、150Mpa的壓力下高壓破碎得到破碎液，將破碎液在4°C的溫度下進(jìn)行高速離心制得上清液，或用低溫微膜過(guò)濾制得過(guò)濾液，再將上清液或過(guò)濾液真空冷凍干燥即制得酶粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種菊酯類農(nóng)藥降解酶的制備方法，其特征在于所述步驟2)中，所述搖瓶種子培養(yǎng)基的pH為7.0，所述搖瓶種子培養(yǎng)基包括以下組分胰蛋白胨IOg/L,酵母粉 5g/L，NaCl 10g/L,卡那霉素 5(Tl00mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種菊酯類農(nóng)藥降解酶的制備方法，其特征在于所述步驟3)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6. 8，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分甘油5lg/L，蛋白胨TlOg/L，酵母粉 3 8g/L，(NH4)2SO4 5 10g/L，MgS04.7H20 I 3g/L，KH2PO4 3· 4 6. 85g/L，K2HPO4* 12H20 5. 68 IL 35g/L，微量元素液 I 2mL/L，卡那霉素 5(Tl00mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種菊酯類農(nóng)藥降解酶的制備方法，其特征在于所述微量元素液包括以下組分CaCl2 2. Og/L, ZnSO4*7H20 5. 0g/L, MnS04*H20 (λ 5g/L，Na2-EDTA18. Og/L, FeS04*7H20 10. Og/L, CuSO4·5Η20 2. 5g/L, CoC12*6H20 0. 2g/L, (NH4)6Μο7024 ·4Η200.lg/Lo
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種菊酯類農(nóng)藥降解酶的制備方法，其特征在于所述微量元素液為經(jīng)溶于無(wú)菌水中，再用0. 22 μ m的濾膜過(guò)濾除菌后的微量元素液。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種菊酯類農(nóng)藥降解酶的制備方法，其特征在于所述步驟3)具體為發(fā)酵培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子液以2 5%的接種量接入裝有3.75^4. 5L發(fā)酵培養(yǎng)基的7. 5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為24 28h，并在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)通入無(wú)菌空氣和改變攪拌轉(zhuǎn)速來(lái)控制發(fā)酵液溶氧值維持在20% 25%,通氣量為0. 5^4vvm,攪拌轉(zhuǎn)速20(Tl000r/min，培養(yǎng)溫度37°C，流加20% 25%的氨水和3mol/L的鹽酸溶液控制發(fā)酵液的pH 為 6. 8 7. O。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種菊酯類農(nóng)藥降解酶的制備方法，其特征在于所述步驟4)中，所述甘油和酵母粉的混合補(bǔ)料液包括以下組分甘油30(T500g/L，酵母粉6(Tl00g/L，卡那霉素 5(Tl00mg/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及農(nóng)藥降解酶的制備方法技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種菊酯類農(nóng)藥降解酶的制備方法，包括以下步驟1)以重組大腸桿菌{E.coliBL21(DE3)/pET-28a-est825}作為生產(chǎn)菌種，用甘油管將生產(chǎn)菌種在-86℃的溫度下保存；2)種子培養(yǎng)；3)發(fā)酵培養(yǎng)；4)補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)；5)乳糖誘導(dǎo)；6)酶粉制備。本發(fā)明采用重組大腸桿菌高效表達(dá)菊酯類農(nóng)藥降解酶，最終制得的降解酶酶粉產(chǎn)量25~40g/L，酶粉酶活為48000~60000U/g，大大提高了菊酯類農(nóng)藥降解酶的產(chǎn)量，降低菊酯類農(nóng)藥降解酶的使用成本，為規(guī)?；a(chǎn)菊酯類農(nóng)藥降解酶提供了一條有效、經(jīng)濟(jì)、可行的途徑。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102876642SQ20121041221
公開日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月25日
發(fā)明者黃皓, 羅華建, 劉玉煥, 梁衛(wèi)驅(qū), 胡珊, 劉遠(yuǎn)星, 羅詩(shī), 莫忠興, 李艷芳, 陳仕麗, 徐匆 申請(qǐng)人:東莞市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中心, 中山大學(xué)