專利名稱：一種陰溝腸桿菌特異性pcr檢測引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測的引物，具體涉及ー種用于檢測陰溝腸桿菌PCR檢測的引物，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)為革蘭氏陰性菌,廣泛存在于自然界中，在人和動物糞便、土壌、植物、昆蟲中均可檢出，它是人和動物腸道正常菌種之一，同時它也是ー種重要的條件致病菌。近年來，由于第三代和第四代頭孢菌素、碳青酶烯類等超廣譜抗菌藥物在臨床上的廣泛使用，使該菌在其選擇壓力下不斷發(fā)展耐藥機(jī)制，耐藥菌株日益增多，已成為重要的醫(yī)院感染病原菌，其引起的細(xì)菌感染性疾病常累及多個器官，包括皮膚軟組織感染、泌尿系統(tǒng)感染、呼吸道感染以及敗血癥等。已有研究報道，陰溝腸桿菌作為條件致病菌不僅對人具有致病性，同時還對魚類具有致病性。近年來，本課題組反復(fù)研究發(fā)現(xiàn)該菌對羅氏沼蝦幼體具有極強(qiáng)的致病性，發(fā)病幼體主要表現(xiàn)為不吃食、無活力、應(yīng)激強(qiáng)烈、成活率低。由于該菌的影響，導(dǎo)致許多羅氏沼蝦育苗単位育苗不順，嚴(yán)重者無法出苗，造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。在不明病原菌的情況下，濫用藥物，一則針對性不強(qiáng)，效果不明顯；ニ則導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)。因此，臨床上迫切需要ー種快速、精準(zhǔn)的檢測手段，辨明病原，針對防治。傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法主要是通過細(xì)菌生理生化特性進(jìn)行分類，需要大量的時間進(jìn)行生理生化反應(yīng)的結(jié)果判讀，不利于及時診斷病因，查找病原，控制病情蔓延。PCR技術(shù)具有操作簡便、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點，已逐步應(yīng)用于細(xì)菌的快速檢測。已有學(xué)者以DnaJ為靶基因建立了陰溝腸桿菌real-time PCR檢測方法，但該法的特異性不強(qiáng)。此外，與普通PCR相比real-time PCR需要實時熒光定量PCR儀，且實驗成本與實驗技術(shù)等要求都相對較高。因此，該法在基層使用具有一定局限性。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，尚未發(fā)明與本發(fā)明的陰溝腸桿菌PCR檢測方法、核酸及引物相關(guān)報道。本發(fā)明建立的檢測方法可為臨床上陰溝腸桿菌快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支撐。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種陰溝腸桿菌PCR檢測引物。該引物可用于產(chǎn)氣腸桿菌的PCR檢測，具有檢測時間短，成本低，檢測結(jié)果特異性高，結(jié)果易判斷，實用性強(qiáng)。本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)的
ー種陰溝腸桿菌特異性PCR檢測引物，包括正向引物和反向引物
正向引物 F :5’ -CATGACACCGGTGITTCCCCAGT-3’
反向引物 R :5’ -CGGTCGGTGAAGCCCAGAACCACTA-3’。所述引物在用于產(chǎn)氣腸桿菌的PCR檢測時，具體如下操作
步驟一，提取樣品DNA，PCR法擴(kuò)增；
PCR檢測體系為20 ii L的反應(yīng)體系,具體為IOXPCR buffer (含 Mg2+) 2 u L,
2. 5mmol/L 的 dNTPI. 6 u L,
5 U/ ii L 的 rTaq 酶0. 16 ii L,
20 PM的引物對0.8 u L,
模板 DNA1-2 uL,
最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)至20 uL；PCR檢測反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性4min ;進(jìn)入循環(huán)，94°C變性30s，61°C退火30s，72°C延伸45s, 30個循環(huán)；72°C延伸5min,降溫至4°C，結(jié)束。步驟ニ，取10 y L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，判斷樣品種是否含有陰溝腸桿菌；所述判斷具體為1%凝膠電泳電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，若電泳結(jié)果在385bp出現(xiàn)單ー條帶，則說明樣品種含有陰溝腸桿菌；反之，則樣品中不含陰溝腸桿菌。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果采用本發(fā)明的檢測方法檢測陰溝腸桿菌所需時間短、特異性強(qiáng)、靈敏度高。本發(fā)明避免了采用傳統(tǒng)鑒定方法操作繁瑣、耗時長、準(zhǔn)確性低、檢出率低等缺點。同時，本發(fā)明所涉及的儀器設(shè)備、試劑等較為常用，一般基層實驗室即可開展檢測工作，實用性更強(qiáng)。本發(fā)明檢測靶點具有単一特異性，檢測結(jié)果特異，易于判定。


圖I為實施例中PCR檢測方法特異性評估實驗?zāi)z電泳結(jié)果 圖2為實施例中PCR檢測方法靈敏度評價實驗?zāi)z電泳結(jié)果 圖3為實施例中臨床樣品檢測凝膠電泳結(jié)果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件例如 Sambrook 等分子克隆實驗室手冊' (New York Cold Spring Habor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。步驟一，設(shè)計特異性擴(kuò)增陰溝腸桿菌的引物對 引物序列為:F :5，-CATGACACCGGTGTTTCCCCAGT-3，
R :5，-CGGTCGGTGAAGCCCAGAACCACTA-3，。步驟ニ，DNA模板制備
將陰溝腸桿菌接種于5ml營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，于35°C恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)12h增菌后，取Iml菌液,放入I. 5ml無菌離心管中；12000r/min離心15min,棄盡上清液，加入500 u L滅菌雙蒸水，用移液器輕輕吹打，重懸菌體，12000r/min離心15min，棄盡上清液，收集細(xì)菌；加入100 u L滅菌雙蒸水，用移液器輕輕吹打，重懸菌體，置于沸水中煮15min，立即取出，在-20°C放置30min。隨后35°C解凍，12000r/min離心15min，取上清液放置4°C備用或-20°C保存。步驟三，陰溝腸桿菌特異性PCR檢測方法建立
PCR 檢測體系為20 ii L 反應(yīng)體系具體為，10 X PCR buffer (含 Mg2+) 2 u L,2. 5mmol/L 的 dNTP I. 6 ii L，5 U/ii L rTaq 酶 0. 16 u I, 20 y M 引物對 0.8 yL，模板 DNAト2 u L,最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)至20 ii L ;PCR檢測反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性4min ;進(jìn)入循環(huán)，94°C變性30s，61°C退火30s，72°C延伸45s，30個循環(huán)；72°C延伸5min，降溫至4°C，結(jié)束。步驟四，PCR擴(kuò)增結(jié)果凝膠電泳判定
所述判斷具體為1%凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，紫外燈照射下觀察電泳結(jié)果，如果出現(xiàn)385bp的單ー擴(kuò)增條帶，則說明樣品種含有陰溝腸桿菌；反之，則樣品中不含陰溝腸桿菌。PCR檢測方法特異性評估實驗
按實施例I中DNA模板制備與PCR檢測方法，對本實驗室保存的陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、大腸桿菌、生癌腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、粘質(zhì)沙雷菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、腐敗希瓦氏菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。特異性檢測結(jié)果見圖I。圖中泳道M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道I為模板為滅·菌水蒸水的陰性對照；泳道2-10為陰溝腸桿菌Enterobacter cloacae 315B株、產(chǎn)氣腸桿菌 Enterobacter aerogenes NTHOl 株、大腸桿菌 Escherichia coli DH5 株、生癌腸桿菌Enterobacter cancerogenus CXl 株、弗氏朽1 樣酸桿菌 Citrobacter freundii CX2 株、粘質(zhì)沙雷菌 Serratia marcescens NTH03 株、嗜水氣單胞菌 Aeromonas hydrophila NTHO71株、溫和氣單胞菌 Aeromonas sobria NTH072 株、腐敗希瓦氏菌 Shewanella putrefaciensNTH04株。圖I中電泳結(jié)果為只有陰溝腸桿菌Enterobacter cloacae 315B株在385bp處出現(xiàn)特異條帶，而其他菌種未出現(xiàn)特異條帶。PCR檢測方法靈敏度評價實驗
接種陰溝腸桿菌于3ml營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，置于35°C恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)12h增菌后，用滅菌營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基10倍梯度稀釋后，平板法計數(shù)得到細(xì)菌濃度為108cfu/ml，取Iml菌液按實施例I提取基因組DNA，用滅菌雙蒸水按10-7-10-1進(jìn)行10倍梯度稀釋基因組DNA，以7個梯度稀釋液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，紫外燈照射下觀察凝膠電泳結(jié)果，如圖2所示。圖2中泳道M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1-8為初始模板DNA的10-7-10-1稀釋液PCR擴(kuò)增結(jié)果。由圖2可知，在泳道2可以看到清晰條帶，相對應(yīng)檢測細(xì)菌濃度為102cfu/ml，本法具有較好的靈敏度。實施例4 臨床疑似菌株檢測
利用實施例I建立的陰溝腸桿菌特異性PCR檢測方法對從羅氏沼蝦幼體中分離到的13株疑似菌株進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果見圖3，圖中泳道M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道I為陰溝腸桿菌陽性對照，泳道2為模板為滅菌雙蒸水的陰性對照，泳道3-15為13株疑似菌株。圖中可知，5、9、10、11、12、15號等6株菌株呈陽性結(jié)果。應(yīng)當(dāng)理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1. 一種陰溝腸桿菌特異性PCR檢測引物，包括正向引物和反向引物，其特征在于正向引物 F :5’ -CATGACACCGGTGTTTCCCCAGT-3’反向引物 R :5’ -CGGTCGGTGAAGCCCAGAACCACTA-3’。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測的引物，具體涉及一種用于檢測陰溝腸桿菌PCR檢測的引物，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。一種陰溝腸桿菌特異性PCR檢測引物，包括正向引物和反向引物正向引物F5’-CATGACACCGGTGTTTCCCCAGT-3’；反向引物R5’-CGGTCGGTGAAGCCCAGAACCACTA-3’。采用本發(fā)明的檢測方法檢測陰溝腸桿菌所需時間短、特異性強(qiáng)、靈敏度高。本發(fā)明避免了采用傳統(tǒng)鑒定方法操作繁瑣、耗時長、準(zhǔn)確性低、檢出率低等缺點。
文檔編號C12N15/11GK102952881SQ20121041263
公開日2013年3月6日 申請日期2012年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月25日
發(fā)明者陳雪峰, 楊國梁, 王軍毅, 高強(qiáng), 張宇飛, 黃雪娜 申請人:浙江省淡水水產(chǎn)研究所