具有殺線蟲活性的芽孢桿菌屬細菌及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了具有殺線蟲活性的芽孢桿菌屬細菌及其制備方法和應用。本發(fā)明菌株名稱為B-RS-06，保藏編號為CGMCCNo.5352。本發(fā)明從植物根際土壤分離出菌株，并將菌株的代謝物作用于植物寄生線蟲。本發(fā)明的殺線蟲劑原材料來源于植物根際土壤，對于環(huán)境及植物、人、動物等所有生物無不良影響，而且生產成本低，生產過程簡單，不污染環(huán)境。
【專利說明】具有殺線蟲活性的芽孢桿菌屬細菌及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種具有殺線蟲活性的芽孢桿菌屬細菌及其制備方法和應用，屬于微生物農藥【技術領域】。
【背景技術】
[0002]植物寄生線蟲是植物的主要病原物之一，是我國乃至世界農業(yè)生產上一類重要的土傳病害。據FAQ的保守估計，全世界每年因線蟲的危害所造成的經濟損失約1000億美元。我國每年僅大豆因線蟲造成的損失就達I億美元，各種蔬菜線蟲的危害損失達30億美元以上。目前，生產上急需防治線蟲的作物面積至少在5000萬畝。嚴重威脅我國農林業(yè)生產的線蟲病害有各種作物的根結線蟲spp.)病、馬鈴薯腐爛莖線蟲(Λ? tylenchus des true tor )病、胞囊線蟲(/? terodera spp.)病、水稻干尖線蟲(.Aphelenchoides Ae1S1Seja')病和松材線蟲(及xylophiIusV病等。植物寄生性線蟲病的防治目前多采用化學防治、輪作及抗病品種，但效果均不太理想，且存在弊端多。如目前使用的化學殺線蟲劑多為劇毒或高毒、高殘留農藥，對土壤微生物、植物、水源和大氣層帶來嚴重污染或破壞，而且藥物在植物體內殘留會直接對人類造成危害。因此，急需開發(fā)對環(huán)境友好，對人、畜無毒的防治植物寄生線蟲的藥劑。
[0003]植物寄生線蟲生防細菌的研究是最近幾年興起的新的研究熱點，越來越多的細菌被分離，不同的作用方式被報道。目前主要研究的有植物根圍促生細菌(Plantgrowth-promoting rhizobacteria, PGPR)、穿刺巴氏桿菌ira/75.)、假單胞桿菌spp.)、蘇云金芽孢桿菌等,它們在線蟲生物防治中有著巨大的開發(fā)潛力，其價值也為人們逐漸認識。如PGPR主要通過誘導作物的系統(tǒng)抗性來防治作物病蟲害；穿刺巴氏桿菌為線蟲專性寄生菌，對線蟲防效顯著，但是該菌必須依靠線蟲才能大量繁殖，而線蟲的生長又必須通過寄主植物來實現(xiàn)，故大量生產受到限制。此外，銅綠假單胞菌0°.aerwgifliosa)和突光假單孢菌0°./Ywore1Scefl1S)也具有防治根結線蟲病的能力，而且熒光假單孢菌產生的一種胞外蛋白酶在防治南方根結線蟲(#.的過程中發(fā)揮了重要作用。蘇云金芽孢桿菌在微生物防治病蟲害方面占有極其重要的地位，其伴孢晶體蛋白具有殺線蟲能力。
[0004]植物根際微生物定殖于植物根際系統(tǒng)，通過產生抵抗多種病原菌的抗生素類物質或毒素，幫助植物抵抗生物類侵害，包括病原細菌、真菌、病毒及線蟲等，是重要的植物病害防治菌種資源。由于植物根際微生物和植物寄生線蟲同時生存在植物根際微生態(tài)系統(tǒng)內，因此，將具有殺線蟲作用的植物根際微生物的代謝物作用于植物寄生線蟲病得感病部位，使代謝物直接到達感染寄生線蟲的植物組織中發(fā)揮作用，不僅可以防治寄生線蟲還能發(fā)揮根際微生物促進植物生長的作用。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種具有殺線蟲活性的芽孢桿菌屬細菌及其制備方法和應用。
[0006]本發(fā)明從植物根際土壤分離出菌株，并將菌株的代謝物作用于植物寄生線蟲。
[0007]一種具有殺線蟲活性的芽孢桿菌屬細菌，菌株為芽孢桿菌UaciBm sp.)B-RS-06 ;該菌株B-RS-06已于2011年10月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心地址是:北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編是 100101，保藏編號為 CGMCC N0.5352。
[0008]本發(fā)明所提供的菌株B-RS-06屬于芽孢桿菌屬Ofeci77M)，其菌落白色，光滑濕潤，具有光澤。革蘭氏陽性菌，細胞長桿狀，單生，芽孢卵圓形，端生，膨大。
[0009]一種具有殺線蟲活性的芽孢桿菌屬細菌的制備方法，其特征在于該方法用無菌磷酸緩沖液(phosphate buffered Saline,PBS)浸泡并振蕩瑞香狼毒(Stellera chamaejasmL.)根系，獲得瑞香狼毒根際土壤懸浮母液，對懸浮液進行系列梯度稀釋，得到不同濃度的稀釋液，分別取一定體積的不同濃度稀釋液，均勻涂抹在細分離培養(yǎng)基(nutrient agar,NA)平板上，將平板在特定的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，待長出肉眼可見的細菌菌落后，挑取適合計數(shù)的濃度平板，進行計數(shù)，并將所有的菌落在新鮮的NA培養(yǎng)基上純化，得到純的細菌菌株后，在低溫短期或長期保存。
[0010]本發(fā)明所述的制備方法中，無菌磷酸緩沖液(phosphate buffered Saline, PBS)由 NaCl 8 g、KCl 0.2 g,Na2HPO4 1.15 g、KH2PO4 0.2 g 以及無菌水 1000 ml 組成，pH 7.3。
[0011]本發(fā)明所述的制備方法中，將瑞香狼毒(Stellera chamae jasm L.)根系浸入無菌磷酸緩沖液中，充分振蕩瑞香狼毒新鮮根系，將附著在根系表面的土壤洗進緩沖液，得到1/10的瑞香狼毒根際土壤懸浮母液。
[0012]本發(fā)明所述的制備方法中，瑞香狼毒根際土壤懸浮液的梯度稀釋方法，以10倍體積為單位，用無菌水進行系列稀釋，得到濃度梯度為10_\10_2直至10_8的系列稀釋液。
[0013]本發(fā)明所述的制備方法中，取一定體積的系列稀釋液的方法，就是從濃度梯度為10_4-10_8的系列稀釋倍數(shù)中，分別取0.1 ml均勻涂布在NA平板培養(yǎng)基上。
[0014]本發(fā)明所述的制備方法中，NA細菌分離培養(yǎng)基由牛肉膏3 g,蛋白胨5 g, NaCl8 g,瓊脂粉12 g，蒸餾水1000 ml組成，pH 7.2-7.4。
[0015]本發(fā)明所述的制備方法中，特定培養(yǎng)條件為在NA平板培養(yǎng)基上，28±2°C避光培養(yǎng)。
[0016]本發(fā)明所述的制備方法中，肉眼可見的細菌菌落(colony-forming units,CFU)為平均直徑在I mm (含I mm)以上的菌落。
[0017]本發(fā)明所述的制備方法中，選擇適合計數(shù)的濃度平板方法，在直徑為90 mm的培養(yǎng)皿中，肉眼可見的單個分散的菌落數(shù)在100-150 CFU。
[0018]所述的細菌菌株保存方法，短期保存可采用NA斜面培養(yǎng)基劃線在4°C下保存，如果做長期保存，可在NA液體培養(yǎng)基和甘油的混合液中在_70°C下保存，NA液體培養(yǎng)基和甘油的體積比為1:1。
[0019]一種用菌株為芽孢桿菌(Mcillus sp.) B-RS-06作為殺蟲劑，其特征在于B-RS-06的代謝物對植物寄生線蟲的具有觸殺活性。
[0020]本發(fā)明菌株適合于以其代謝物觸殺植物寄生線蟲，是開發(fā)微生物源殺線蟲劑的優(yōu)良活性先導物質。[0021]本發(fā)明的生物殺線蟲劑為純生物制劑，可用于對松材線蟲、馬鈴薯腐爛莖線蟲等植物寄生線蟲的生物防治。不同稀釋濃度代謝物的處理和對照NA培養(yǎng)液處理有顯著差異，代謝物原液的殺線蟲效果可達到100%以上。
[0022]本發(fā)明的殺線蟲劑原材料來源于植物根際土壤，對于環(huán)境及植物、人、動物等所有生物無不良影響，而且生產成本低，生產過程簡單，不污染環(huán)境。
[0023]本發(fā)明對于植物線蟲的生物防治、微生物殺線蟲劑的開發(fā)應用和農產品的無公害生產，具有極其重要的意義，適合于推廣應用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為菌株B-RS-06CGMCC N0.5352的代謝物原液作用于植物寄生線蟲24 h后的情況，主要展示線蟲的觸殺死亡情況(X40倍，A為對照，B為處理)。
[0025]圖2為菌株B-RS-06CGMCC N0.5352的代謝物10倍液作用于植物寄生線蟲24 h后的情況，主要展示線蟲死亡形態(tài)(X 250倍，A為對照，B為處理)。
[0026]圖3為菌株B-RS-06CGMCC N0.5352的代謝物原液作用于植物寄生線蟲24 h后的情況，主要展示線蟲部分體壁破損，內含物溢出(X400倍，A為對照，B為處理)。
[0027]圖4菌株B-RS-06的不同濃度代謝物對馬鈴薯腐爛莖線蟲觸殺活性，示代謝物原液和10倍稀釋液的線蟲觸殺活性。
[0028]圖5菌株B-RS-06的不同濃度代謝物對松材線蟲觸殺活性，示代謝物原液和10倍稀釋液的線蟲觸殺活性。
【具體實施方式】
[0029]下述實施例中所使用的實驗方法，如無特殊說明均為常規(guī)方法。
[0030]實施例1.利用系列梯度稀釋法分離植物根際土壤細菌
1、甘肅省蘭州市蘭州大學榆中校區(qū)萃英山瑞香狼毒根際樣品細菌的分離從采自蘭州大學榆中校區(qū)萃英山頂(35° 56’ N, 104° 08’ W ;海拔1965.8 m)的瑞香狼毒(Sie J7 era chamae jasm L.)根際土壤中分離菌株B-RS-06。其方法如下:選取長勢旺盛的瑞香狼毒，整株挖出后，輕輕抖落根系上的多余土壤，將3 g根系樣品浸入I體積的無菌PBS緩沖液中，得到1/10的稀釋液樣品，充分振蕩的新鮮根系5 min，將附著在根系表面的土壤洗進緩沖液，然后以10倍體積為單位進行系列稀釋，直到得到最小濃度為10_8的系列稀釋液，從濃度梯度為10-4-10-8的稀釋液中，分別取0.1 ml均勻涂布在NA平板培養(yǎng)基上，28±2°C避光培養(yǎng)，待平板上長出肉眼可見的細菌菌落后，用無菌牙簽挑取少許菌落轉移至新的NA培養(yǎng)基上進行純化，沒有污染，則轉入NA斜面培養(yǎng)基，4°C短期保存。
[0031]2、甘肅省定西市岷縣寺溝鄉(xiāng)崖寺村瑞香狼毒根際樣品細菌的分離
從采自甘肅省定西市岷縣寺溝鄉(xiāng)崖寺村(34° 24’ N, 104° 05’ W ;海拔2588.1 m)的瑞香狼毒根際土壤中分離菌株B-RS-06。其方法同實施例1-1。
[0032]3、甘肅省武威市天祝藏族自治縣抓西秀龍鄉(xiāng)碳窯溝村瑞香狼毒根際樣品細菌的分離 從采自甘肅省武威市天祝藏族自治縣抓西秀龍鄉(xiāng)碳窯溝村(37° 07’ N, 102° 47’W ;海拔3280.4 m)的瑞香狼毒根際土壤中分離菌株B-RS-06。其方法同實施例1_1。[0033]PBS緩沖液和NA培養(yǎng)基的具體組成成分與
【發(fā)明內容】
中的一致。
[0034]本發(fā)明所提供的菌株為芽孢桿菌(Bacillus sp.) B-RS-06?該菌株B-RS-06已于2011年10月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心地址是:北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編是100101，保藏編號為CGMCCN0.5352。
[0035]實施例2.菌的培養(yǎng)及代謝物的制備
1、一級菌種培養(yǎng):將保存在斜面培養(yǎng)基上的菌株B-RS-06轉接活化到NA平板培養(yǎng)基上，28-30°C避光培養(yǎng)，待長出肉眼可見的菌落后作為一級菌種。
[0036]2、二級菌種培養(yǎng):將經過活化的一級菌種接種到NA液體培養(yǎng)基上，放置在溫度為28-30°C，轉速為180 rpm的搖床上避光培養(yǎng)，定期觀察記錄，待培養(yǎng)液變渾濁(約72 h)后，停止振蕩培養(yǎng)，轉入4°C冰箱短期保存。
[0037]3、代謝物的制備:將液體菌劑置于低溫高速離心機中，設定離心溫度為4°C，轉速為10000轉，離心10 min后，緩慢收集上清液，即為菌株B-RS-06的代謝物。
[0038]4、不同濃度代謝物的制備:采用NA培養(yǎng)液作為稀釋劑，將菌株B-RS-06的代謝物配成10倍、50倍、100倍的稀釋液，用紫外可見分光光度計(島津，UV-1750)測定代謝物原液及各稀釋液的吸光值及濃度。
[0039]實施例3.芽孢桿 菌B-RS-06代謝物的線蟲觸殺活性
1、線蟲的培養(yǎng)
本實施例中以馬鈴薯腐爛莖線蟲iDitylenchus destructor)和松材線蟲{Bursaphelenchus xylophilus)為實驗材料,線蟲是按照常規(guī)方法培養(yǎng)獲得的。待線蟲繁殖長滿整個培養(yǎng)皿后，將培養(yǎng)皿倒置，給培養(yǎng)皿蓋中加入3-5 ml無菌水，放置6 h以上，線蟲進入無菌水中。在顯微鏡下鏡檢，根據線蟲密度，進行適當?shù)南♂?，使顯微鏡放大倍數(shù)在40倍時，每視野的線蟲數(shù)約在100-200條。
[0040]2、不同濃度代謝物對線蟲的觸殺活性
實驗在24孔板中進行，選取按照實施例2-4中，菌株B-RS-06代謝物及不同倍數(shù)稀釋液的制備方法得到的代謝物，將原液、10倍液、50倍液和100倍液的菌株代謝物，分別加入按照實施例3-1中得到的線蟲懸浮液，代謝物和線蟲懸浮液的體積比為1:1，以加入NA液體培養(yǎng)液為陰性對照，每個處理重復3次。處理后3 h、7 h、12 h、16 h和24 h觀察記錄線蟲的死亡情況，每次觀察不同的5個視野，記錄的線蟲死亡數(shù)，計算公式為:線蟲死亡率(％)=(死亡線蟲數(shù)/供試線蟲總數(shù))X 100%,實驗結果用SPSS vl6.0軟件進行統(tǒng)計分析。
[0041]3、結果
(I)代謝物對植物寄生線蟲的觸殺活性
處理后3 h和7 h觀察，加入原液和10倍液的代謝物的線蟲行動緩慢，活性受到抑制，50倍和100倍液的處理線蟲未見變化，運動速度快，活力旺盛；處理后12 h觀察，在原液中大部分線蟲，蟲體僵直，10倍液中也有小部分線蟲死亡；而50倍液的線蟲活力稍有下降，運動速度變慢，100倍液處理的線蟲和對照無差別；處理16 h后，原液中的線蟲基本全部死亡，10倍液中線蟲死亡數(shù)量也有增加,但仍可活動緩慢的活線蟲,50倍液和100倍液的線蟲未見死亡，但是50倍液的線蟲活力低于100倍液中得線蟲；處理24 h后，原液中已幾乎全部死亡，蟲體干枯(見圖1), 10倍液中線蟲也大部分死亡(見圖2)，50倍液和100倍液中線蟲活力有所下降，但未出現(xiàn)死亡。具體數(shù)據見表1，2和圖4，5。
[0042](2)線蟲死亡后的形態(tài)變化
用菌株B-RS-06代謝物原液處理線蟲24 h后，所有線蟲死亡，死亡的線蟲大部分蟲體僵直，干枯，內含物溢縮，體壁與內含物發(fā)生了嚴重的分離；線蟲的部分體壁破損，內含物溢出，有的線蟲甚至所有體壁全部消失，僅剩內含物的殘骸，死亡蟲體的殘骸明顯比對照線蟲小(見圖2，3)，由此表明，菌株B-RS-06代謝物觸殺植物寄生線蟲的毒力強，且這種觸殺不是短暫的麻醉或活性抑制，而是徹底的破壞線蟲結構，達到不可逆的致命毒殺。
[0043]表1菌株B-RS-06的不同濃度代謝物對馬鈴薯腐爛莖線蟲觸殺活性 表1菌株B-RS-06的不同濃度代謝物對馬鈴薯腐爛莖線蟲觸殺活性
【權利要求】
1.一種具有殺線蟲活性的芽孢桿菌屬細菌，菌株為芽孢桿菌sp.B-RS-06 ；該菌株的保藏編號為CGMCC N0.5352。
2.一種如權利要求1所述的具有殺線蟲活性的芽孢桿菌屬細菌的制備方法，其特征在于該方法用無菌磷酸緩沖液浸泡并振蕩瑞香狼毒根系，獲得瑞香狼毒根際土壤懸浮母液，對懸浮液進行系列梯度稀釋，得到不同濃度的稀釋液，分別取一定體積的不同濃度稀釋液，均勻涂抹在細分離培養(yǎng)基即nutrient agar, NA平板上,將平板在特定的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，待長出肉眼可見的細菌菌落后，挑取適合計數(shù)的濃度平板，進行計數(shù)，并將所有的菌落在新鮮的NA培養(yǎng)基上純化，得到純的細菌菌株后，在低溫短期或長期保存。
3.如權利要求2所述的具有殺線蟲活性的芽孢桿菌屬細菌的制備方法，其特征在于無菌磷酸緩沖液由 NaCl 8 g、KCl 0.2 g,Na2HPO4 1.15 g、KH2PO4 0.2 g 以及無菌水 1000 ml組成，pH 7.3。
4.如權利要求2所述的具有殺線蟲活性的芽孢桿菌屬細菌的制備方法，其特征在于將瑞香狼毒根系浸入無菌磷酸緩沖液中，充分振蕩瑞香狼毒新鮮根系，將附著在根系表面的土壤洗進緩沖液，得到1/10的瑞香狼毒根際土壤懸浮母液。
5.如權利要求2所述的具有殺線蟲活性的芽孢桿菌屬細菌的制備方法，其特征在于瑞香狼毒根際土壤懸浮液的梯度稀釋方法，以10倍體積為單位，用無菌水進行系列稀釋，得到濃度梯度為10_\10_2直至10_8的系列稀釋液。
6.如權利要求2所述的具有殺線蟲活性的芽孢桿菌屬細菌的制備方法，其特征在于取一定體積的系列稀釋液的方法，就是從濃度梯度為10_4-10_8的系列稀釋倍數(shù)中，分別取0.1ml均勻涂布在NA平板培養(yǎng)基上。
7.如權利要求2所述的具有殺線蟲活性的芽孢桿菌屬細菌的制備方法，其特征在于NA細菌分離培養(yǎng)基由牛肉膏3 g,蛋白胨5 g, NaCl 8 g,瓊脂粉12 g，蒸餾水1000 ml組成，pH 7.2-7.4。
8.如權利要求2所述的具有殺線蟲活性的芽孢桿菌屬細菌的制備方法，其特征在于特定培養(yǎng)條件為在NA平板培養(yǎng)基上，28 ±2°C避光培養(yǎng)。
9.如權利要求2所述的具有殺線蟲活性的芽孢桿菌屬細菌的制備方法，其特征在于肉眼可見的細菌菌落即colony-forming units, CFU為平均直徑在大于等于I mm以上的菌落。
10.如權利要求2所述的具有殺線蟲活性的芽孢桿菌屬細菌的制備方法，其特征在于選擇適合計數(shù)的濃度平板方法，在直徑為90 _的培養(yǎng)皿中，肉眼可見的單個分散的菌落數(shù)在 100-150 CFU。
11.如權利要求2所述的具有殺線蟲活性的芽孢桿菌屬細菌的制備方法，其特征在于短期保存可采用NA斜面培養(yǎng)基劃線在4°C下保存，如果做長期保存，可在NA液體培養(yǎng)基和甘油的混合液中在_70°C下保存，NA液體培養(yǎng)基和甘油的體積比為1:1。
12.—種 用菌株為芽孢桿菌sp.B-RS-06作為殺蟲劑，其特征在于B-RS-06的代謝物對植物寄生線蟲的具有觸殺活性；用于對松材線蟲、馬鈴薯腐爛莖線蟲等植物寄生線蟲的生物防治。
【文檔編號】C12N1/20GK103773707SQ201210413059
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年10月26日 優(yōu)先權日:2012年10月26日
【發(fā)明者】秦波, 金輝, 劉權, 張等宏, 燕志強 申請人:中國科學院蘭州化學物理研究所