專利名稱：一種同時(shí)提取和純化rna和dna的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種同時(shí)提取和純化RNA和DNA的試劑盒及方法，屬于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在動(dòng)物檢疫中，根據(jù)檢疫條款，一種樣品往往需要針對(duì)多種疫病開(kāi)展檢測(cè)。隨著多重PCR和基因芯片等高通量檢測(cè)方法的廣泛應(yīng)用，可以實(shí)現(xiàn)一次試驗(yàn)完成多種針對(duì)檢疫條款的檢疫性疫病。而核酸(DNA和RNA)的提取與純化是這些技術(shù)應(yīng)用的基礎(chǔ)與前提。核酸提取與純化主要分為以下幾種方法I.酚氯仿抽提法。該方法是核酸分離純化技術(shù)中最經(jīng)典的方法之一，是由冷泉港實(shí)驗(yàn)室中的研究人員首先提取的，并被大量的科研究工作者進(jìn)行改良使用。其原理是在酚氯仿的共同作用下，蛋白質(zhì)會(huì)被變性，形成不溶解的物質(zhì)。由于蛋白質(zhì)的密度小于酚而大于7K，所以離心后，會(huì)在酚相和水相于之間，形成蛋白質(zhì)中間層，從而有效地將蛋白質(zhì)和核酸分離開(kāi)來(lái)。2.鹽析法。該技術(shù)原理是在組織或細(xì)胞裂解液中，加入高濃度鹽(NaCl或NH4Cl,KI, KAC)來(lái)沉淀去除蛋白質(zhì)，從而得到高純度的基因組DNA。3.玻璃珠法。在高離液鹽(鹽酸胍，異硫氰酸胍，NaI)條件下，玻璃珠會(huì)同核酸發(fā)生吸附反應(yīng)，而在低鹽條件下，核酸又可以被洗脫下來(lái)。但是玻璃珠的殘留以及干燥問(wèn)題影響了這一技術(shù)的運(yùn)用。至目前為止，大部分的公司已經(jīng)去除這個(gè)純化技術(shù)。4.硅膠柱法。硅膠柱將核酸抽提或純化變成一種簡(jiǎn)單的過(guò)濾操作，以取代傳統(tǒng)溶液型抽提技術(shù)的離心方式。硅膠柱的純化原理就是使用一種特殊的玻璃纖維濾膜，這種濾膜在高離液劑(鹽酸胍，NaI1NaClO4)的條件下，可以同核酸發(fā)生吸附反應(yīng)，而在低鹽條件下，核酸又可以從濾膜中釋放出來(lái)，蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)不會(huì)被吸附，從而達(dá)到純化核酸的目的。硅膠柱的過(guò)濾吸附操作大大減少了抽提過(guò)程中離心和干燥時(shí)間，并去除耗時(shí)的醇類沉淀過(guò)程。5.磁珠法。磁珠法核酸純化技術(shù)采用了納米級(jí)磁珠微珠，這種磁珠微珠的表面標(biāo)記了一種官能團(tuán)，能同核酸發(fā)生吸附反應(yīng)。娃磁(Magnetic Silica Particle)就是指磁珠微珠表面包裹一層娃材料，來(lái)吸附核酸，其純化原理類型于玻璃奶的純化方式。離心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一層可發(fā)生離心交換的材料(如DEAE，C00H)等，從而達(dá)到吸附核酸目的。不同性質(zhì)的磁珠微珠所對(duì)應(yīng)的純化原理是不一致。本發(fā)明根據(jù)實(shí)際需要，建立了同時(shí)提取動(dòng)物細(xì)菌與病毒的RNA和DNA的提取方法并組裝了試劑盒。該方法與經(jīng)典的單獨(dú)提取RNA或者DNA單獨(dú)提取的方法相比較，提取效率相當(dāng)，同時(shí)在方法中還提供了對(duì)動(dòng)物細(xì)菌和病毒的RNA和DNA進(jìn)一步純化的方法。其優(yōu)勢(shì)在于能夠同時(shí)提取并純化動(dòng)物細(xì)菌和病毒的RNA和DNA，使用者可以根據(jù)實(shí)際的檢測(cè)需要，選取不同的方法進(jìn)行核酸提取。此外，本發(fā)明也為同時(shí)檢測(cè)兩種不同類型核酸的檢測(cè)技術(shù)提供了很好的基礎(chǔ)平臺(tái)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種同時(shí)提取和純化動(dòng)物細(xì)菌與病毒的RNA和DNA的試劑盒。本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種同時(shí)提取和純化動(dòng)物細(xì)菌與病毒的RNA和DNA的方法。為解決第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種同時(shí)提取和純化RNA和DNA的試劑盒，其包括共提取裂解液、2M醋酸鈉、水飽和酚、氯仿/異戊醇混合液、異丙醇、70%或75%DEPC酒精、滅菌DEPC水、反提萃取液和核酸純化柱。其中，所述共提取裂解液包含4. 5mol/L異硫氰酸胍，2g/L十二烷基肌酸鈉，體積分?jǐn)?shù)7 X 10_6% β -巰基乙醇、3g/L消泡劑-A、0. 05mol/L乙二胺四乙酸;其pH值為8. O。進(jìn)一步地，所述氯仿/異戊醇混合液中氯仿與異戊醇的體積比為24: I。進(jìn)一步地，所述反提萃取液包含4mol/L異硫氰酸胍、O. 05mol/L檸檬酸鈉、Imol/LTris ;其？!1 值為 8.0。進(jìn)一步地，所述核酸純化柱優(yōu)選為硅膠膜離心吸附柱。為解決第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案利用上述試劑盒的同時(shí)提取和純化RNA和DNA的方法，包括如下步驟( I)利用共提取裂解液對(duì)樣品進(jìn)行裂解得到裂解物； ( 2 )將裂解物輕微振蕩，加入2M醋酸鈉、水飽和酚、氯仿/異戊醇混合液，置冰上放置 IOmin ；(3)離心，得到上層液相及下層液相；(4)吸取步驟(3)中離心得到的上層液相，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，獲得混合液體A,然后進(jìn)行RNA提取與純化；進(jìn)一步地，如果對(duì)RNA的純度要求不高，可按照常規(guī)操作提取與純化RNA，具體方法為將混合液體A離心，棄上清，用70%或75%DEPC酒精洗滌，干燥后加入滅菌DEPC水溶解，即得。如果為了達(dá)到更高的純度要求，所述RNA提取與純化的具體方法為將混合液體A利用核酸純化柱提取與純化，得到高純度的RNA。( 5 )吸取步驟(3 )中離心得到的下層液相，加入反提萃取液，顛倒混勻，靜置，離心，吸取上層液相再加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，靜置，獲得混合液體B，然后進(jìn)行DNA提取
與純化。進(jìn)一步地，如果對(duì)DNA的純度要求不高，所述DNA提取與純化的具體方法為將混合液體B離心，棄上清，用70%或75%DEPC酒精洗滌，干燥后加入滅菌DEPC水溶解，即得。如果為了達(dá)到更高的純度要求，所述DNA提取與純化的具體方法為將混合液體B利用核酸純化柱提取與純化，得到高純度的DNA。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是建立了同時(shí)提取RNA和DNA的提取方法并組裝了試劑盒。該方法與經(jīng)典的RNA或者DNA單獨(dú)提取的方法相比較，提取效率相當(dāng)，同時(shí)在方法中還提供了對(duì)RNA和DNA進(jìn)一步純化的方法。其優(yōu)勢(shì)在于能夠同時(shí)提取并純化RNA和DNA，使用者可以根據(jù)實(shí)際的檢測(cè)需要，選取不同的方法進(jìn)行核酸提取或純化。此外，本發(fā)明也為同時(shí)檢測(cè)兩種不同類型核酸的檢測(cè)技術(shù)提供了很好的基礎(chǔ)平臺(tái)。下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，凡依照本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容所做的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。


圖I為應(yīng)用提取的核酸樣品進(jìn)行口蹄疫病毒RT-PCR檢測(cè)和豬鏈球菌2型PCR檢測(cè)結(jié)果，其中MMarker DL2000 ；I =Trizol法提取RNA，口蹄疫RT-PCR檢測(cè)結(jié)果；2 :實(shí)施例4的試劑盒提取核酸，口蹄疫RT-PCR檢測(cè)結(jié)果；3 :煮沸法提取DNA，豬鏈球菌2型PCR檢測(cè)結(jié)果；4 :實(shí)施例4的試劑盒提取核酸，豬鏈球菌2型PCR檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所用滅活的口蹄疫病毒為北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心保存，滅活的豬鏈球菌由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。實(shí)施例I :混合樣品的制備為了驗(yàn)證本發(fā)明試劑盒的提取效果，選擇本實(shí)驗(yàn)室保存的已滅活的口蹄疫病毒和豬鏈球菌作為參試材料，制備了含有動(dòng)物細(xì)菌和病毒的混合樣品。亞洲I型口蹄疫病毒(毒株編號(hào)為As-l/PK-l/2005)細(xì)胞培養(yǎng)物。滅活前病毒的濃度為:109TCID50/mL。滅活豬鏈球菌2型(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所饋贈(zèng))菌懸液，滅活前菌懸液的濃度為108CFU/mL。具體制備過(guò)程如下(I)在二級(jí)生物安全柜內(nèi)，用滅菌的I3BS(pH7. 2)將上述兩種參試菌/毒株的濃縮懸液分別稀釋至105TCID5Q/mL和105CFU/mL。(2)將兩種稀釋后的懸液分別取5mL，充分混合均勻，分裝至I. 5mL滅菌離心管中，制成混合樣品，-80 V保存?zhèn)溆?。?shí)施例2 =Trizol法單獨(dú)提取混合樣品的RNA用Trizol法提取實(shí)例I中混合樣品的RNA，具體步驟如下(I)取5個(gè)滅菌的I. 5mL滅菌離心管，編號(hào)分別為1_5 ；(2)每管加入600 μ L裂解液，加入被檢樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各100 μ L，一份樣本換用一個(gè)吸頭，再加入200 μ L氯仿，混勻器上振蕩混勻5s (不能過(guò)于強(qiáng)烈，以免產(chǎn)生乳化層，也可以用手顛倒混勻)。于4°C、12000r/min離心15min ；(3)取與5個(gè)滅菌的I. 5mL滅菌離心管，加入500 μ L異丙醇(_20°C預(yù)冷)，做標(biāo)記。吸取2)中各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，上清液應(yīng)至少吸取500 μ L，不能吸出中間層，顛倒混勻；(4)于4°C、12000r/min離心15min (滅菌離心管開(kāi)口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置)，小心倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)；加
5Λ 600 μ L 75%乙醇，顛倒洗滌；(5)于4°C、12000r/min離心IOmin (滅菌離心管開(kāi)口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置)，小心倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)；(6)4000r/min離心IOs (滅菌離心管開(kāi)口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置)，將管壁上的殘余液體甩到管底部，小心倒去上清，用微量加樣器將其吸干，一份樣本換用一個(gè)吸頭，吸頭不要碰到有沉淀一面，室溫干燥3min，不能過(guò)于干燥，以免RNA不溶；(7)每管分別加入25 μ L DEPC水，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，2000r/min離心5s，冰上保存?zhèn)溆谩Ｈ粜栝L(zhǎng)期保存須放置-80°C冰箱。實(shí)施例3 :煮沸法單獨(dú)提取混合樣品DNA用DNA提取試劑提取混合樣品中的DNA，具體操作如下(I)取η個(gè)I. 5mL滅菌離心管，其中η為待檢樣品數(shù)、一管陽(yáng)性對(duì)照及一管陰性對(duì)照之和，對(duì)每個(gè)管進(jìn)行編號(hào)標(biāo)記。(2)每管加入200 μ L DNA提取液I，然后分別加入待測(cè)樣本、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各100 μ L，一份樣本換用一個(gè)吸頭；混勻器上震蕩混勻5s。于4°C 25°C條件下，13000r/min 離心 lOmin。(3)盡可能吸棄上清且不碰沉淀，再加入10 μ L DNA提取液II，混勻器上震蕩混勻5s。于 4°C 25°C條件下，2000r/min 離心 10s。(4) 100°C干浴或沸水浴 IOmin ；5000r/min 離心 5s,充分振蕩一下，5000r/min 再次離心5s,加入25 μ L無(wú)DNA酶的滅菌純化水,充分振蕩后，5000r/min離心5min,上清即為提取的DNA，冰上保存?zhèn)溆谩?5)提取的DNA放置于-80°C冰箱保存?zhèn)溆?。?shí)施例4 :同時(shí)提取和純化動(dòng)物細(xì)菌與病毒的DNA和RNA的試劑盒及其使用方法一、同時(shí)提取和純化動(dòng)物細(xì)菌與病毒的RNA和DNA的試劑盒，室溫保存，由以下試劑組成(I)共提取裂解液，包含4. 5mol/L異硫氰酸胍，2g/L十二烷基肌酸鈉，體積分?jǐn)?shù)7X 10_6%β -巰基乙醇、3g/L消泡劑-A、0. 05mol/L乙二胺四乙酸，pH值為8. O。配制方法為在2000mLDEPC處理過(guò)的燒杯中加入300mL滅菌DEPC水，加入531. 72g異硫氰酸胍，如果水不夠可以加適量的水使得異硫氰酸胍充分溶解，加入2g十二烷基肌酸鈉、7 μ L β -巰基乙醇、3g消泡劑-A和14. 61g乙二胺四乙酸，充分溶解后，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至8. 0，最后用滅菌DEPC水定容至lOOOmL。分裝25mL/瓶；(2) 2M醋酸鈉其配制方法為NaAc · 3H20 13. 6g加DEPC水定容至50mL,高壓滅菌。分裝3mL/管；(3)水飽和酚其配制方法為取重蒸酚200mL，于65°C水浴溶解，加IOOmL滅菌DEPC水混勻，靜置，取上層水相(大部分)，加O. 2g 8-巰基喹啉，混勻。分裝25mL/瓶；(4)氯仿/異戊醇混合液其配制方法為在2000mLDEPC處理過(guò)的燒杯中加入960mL氯仿,加入40mL異戍醇,充分混勻后分裝入棕色管中備用。分裝5mL/管；(5)異丙醇異丙醇，分析純。分裝IOOmL/瓶；(6) 70%或75%DEPC酒精其配制方法為在700mL無(wú)水乙醇中加入300mL滅菌的DEPC水或在750mL無(wú)水乙醇中加入250mL滅菌的DEPC水，充分混勻分裝備用。分裝IOOmL/
6瓶；(7)滅菌DEPC水5mL/管X I管；其配制方法為在IOOOmL三蒸水中加入lmLDEPC，磁力器攪拌過(guò)夜，高壓滅菌121°C 25min ;分裝5mL/管；(8)反提萃取液,包含4mol/L異硫氰酸胍、O. 05mol/L梓檬酸鈉、lmol/L Tris, pH值為8. O。其配制方法為在2000mL滅菌燒杯中加入300mL滅菌三蒸水，加入472. 64g異硫氰酸胍，使異硫氰酸胍充分溶解，加入12.90g檸檬酸鈉和121. 14g Tris，充分溶解后，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8. O,最后用滅菌三蒸水定容至IOOOmL,分裝5mL/管；(9)核酸純化柱娃膠膜離心吸附柱(微量)(silica spin column for miniprep),包括50個(gè)spin column和100個(gè)2mL離心管。該硅膠膜離心吸附柱(微量)，型號(hào)60911A-50，購(gòu)買自北京天恩澤基因科技有限公司。二、利用所述試劑盒進(jìn)行同時(shí)提取和純化RNA和DNA的方法(I)按照標(biāo)準(zhǔn)的要求進(jìn)行樣品的采集。組織樣品或者固體樣品取2g，用手術(shù)剪刀剪碎,加IOmL PBS(Ph7. 2),在高壓滅菌的研磨中磨碎。離心3000r/min離心10秒取上清100 μ L加入400 μ L共提取裂解液中；液體樣品直接取100 μ L，加入400 μ L溶液A中；(2)輕微震蕩5s，加入40 μ L2M醋酸鈉、400 μ L水飽和酚、200 μ L氯仿/異戊醇混合液，置冰上放置IOmin ；(3) 13000r/min 4°C,離心15min,得到上層液相及下層液相；(4)RNA的提取與純化吸取步驟(3)中離心得到的上層液相入另一個(gè)無(wú)核酸酶的
I.5mL滅菌離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，要輕柔，獲得混合液體A ;如果對(duì)RNA的純度要求不高，可按照常規(guī)操作提取RNA。通常使用的方法例如將上述混合液體A，13000r/min 4°C，離心15min，棄掉上清，用750 μ L 70%或75%DEPC酒精洗滌3次，自然干燥3min。加入25 μ L滅菌DEPC水溶解，即得到動(dòng)物細(xì)菌與病毒的RNA。置-20°C或_80°C保存?zhèn)溆?。如果為了達(dá)到更高的純度要求,還可以利用silica spin column for miniprep,具體方法為a.將silica spin column for miniprep置于2mL離心管中，加入上述混合液體A,靜置I分鐘，12000r/min離心Imin (此spin column之最大容量為800 μ L,若樣品體積超過(guò)800 μ L，則需分次加入)；b.離心后，倒掉離心管流出液，將spin column置回原離心管中，加入750 μ L70%或75%DEPC酒精，靜置5min ；c. 13，000r/min離心I分鐘,倒掉離心管流出液,將spin column置于原離心管中，重復(fù)13，000r/min離心I分鐘；d.將spin column置于另一個(gè)干凈的I. 5mL離心管中，自然干燥3分鐘，加入25 μ L滅菌DEPC水，靜置3分鐘；e. 13，000r/min離心2分鐘,丟棄spin column,此溶液即為提取并純化好的動(dòng)物細(xì)菌與病毒的RNA，置-20°C或_80°C保存?zhèn)溆茫?5)DNA的提取與純化吸取步驟(3)中離心得到的下層液相，加入250 μ L反提萃取液，顛倒混勻，要輕柔，室溫靜置IOmin ；13000r/min 4°C,離心15min,吸取上層液相入另一個(gè)無(wú)核酸酶的I. 5mL滅菌離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，要輕柔，室溫靜置15min,獲得混合液體B ；如果對(duì)DNA的純度要求不高，可按照常規(guī)操作提取DNA。通常使用的方法例如13000r/min 4°C，離心15min，棄掉上清，用750 μ L75%DEPC酒精洗滌3次，自然干燥3min。加入25 μ L滅菌DEPC水溶解，即得到動(dòng)物細(xì)菌與病毒的DNA。置_20°C或_80°C保存?zhèn)溆谩Ｈ绻麨榱诉_(dá)到更高的純度要求,還可以利用silica spin column for miniprep,具體方法為a.將silica spin column for miniprep置于2mL離心管中，加入上述混合液體B,靜置I分鐘，12000r/min離心Imin (此spin column之最大容量為800 μ L,若樣品體積超過(guò)800 μ L，則需分次加入)；b.離心后，倒掉離心管流出液，將spin column置回原離心管中，加入750 μ L70%或75%DEPC酒精，靜置5min ；c. 13，000r/min離心I分鐘,倒掉離心管流出液,將spin column置于原離心管中，重復(fù)13，000r/min離心I分鐘；d.將spin column置于另一個(gè)干凈的I. 5mL離心管中，自然干燥3分鐘，加入25 μ L滅菌DEPC水，靜置3分鐘；e. 13，000r/min離心2分鐘,丟棄spin column,此溶液即為提取并純化好的動(dòng)物細(xì)菌與病毒的DNA，置-20°C或_80°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例5 :單獨(dú)提取DNA與RNA方法與本發(fā)明試劑盒提取效果的比較一、方法I.核酸濃度及純度的測(cè)定采用紫外吸收法。分別測(cè)定Trizol法、煮沸法和本發(fā)明試劑盒方法提取的核酸的純度具體方法如下將每組中提取的5管核酸樣品，各取5ul充分混合，每組有25ul混合核酸。取每組I中的混合核酸10ul，用滅菌的DEPC水稀釋至1000ml，每組兩管。取潔凈離心管兩支，分別標(biāo)記為甲乙，分別準(zhǔn)確加入I. OmL稀釋好的DNA/RNA樣液，然后向甲管加入I. OmL蒸餾水，向乙管加入1.0ml過(guò)氯酸-鑰酸銨沉淀劑，搖勻后置_20°C內(nèi)30min，使沉淀完全。3000r/min離心lOmin，各吸取上清液0. 5mL轉(zhuǎn)入相應(yīng)的甲乙兩容量瓶?jī)?nèi)，定容至50mL。以蒸餾水作空白對(duì)照，使用紫外光度計(jì)分別測(cè)定上述甲乙兩稀釋A26tl值和A28tlt5I)通過(guò)的公式數(shù)值來(lái)計(jì)算核酸的濃度DNA (ug/mL)=(甲 A260 —乙 A260) X V 總 X D/0. 020RNA (ug/mL)=(甲 A260 —乙 A260) X V 總 X D/0. 022式中甲A26tl:被測(cè)稀釋液在260nm處的總光密度值；乙A26tl:加沉淀劑除去大分子核酸后被測(cè)稀釋液260nm處的光密度值；兩者之差(甲A26tl ―乙A26tl)為被測(cè)稀釋液的光密度值；V總:被測(cè)試液總體積(mL)D:樣液的稀釋倍數(shù)。2)純度判定方法從A26(i/A28(i的比值可判斷樣品的純度。純RNA的A26(i/A28(i ^ 2. O ；DNA的A260ZA280彡I. 8。當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)含量較高時(shí)，則比值下降。RNA和DNA的比值分別低于2. O和I. 8時(shí),表不此樣品不純。
2.提取的核酸的實(shí)際應(yīng)用為了進(jìn)一步驗(yàn)證試劑盒的核酸提取效果，選取實(shí)例2-4提取并保存的核酸作為試驗(yàn)樣品。參照趙戰(zhàn)勤等(2008)《豬鏈球菌2型PCR快速檢測(cè)試劑盒的研制及初步應(yīng)用》中的方法進(jìn)行豬鏈球菌2型PCR檢測(cè)，參照婁高明等(2002)《RT-PCR快速檢測(cè)口蹄疫病毒》中的方法進(jìn)行口蹄疫病毒RT-PCR檢測(cè)。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，比較樣品在實(shí)際檢測(cè)中的效
果O二、結(jié)果I.核酸濃度及純度的測(cè)定結(jié)果詳情見(jiàn)表2。表2 :核酸濃度及純度測(cè)定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種同時(shí)提取和純化RNA和DNA的試劑盒，其特征在于，包括共提取裂解液、2M醋酸鈉、水飽和酚、氯仿/異戊醇混合液、異丙醇、70%或75%DEPC酒精、滅菌DEPC水、反提萃取液和核酸純化柱，其中，所述共提取裂解液包含4. 5mol/L異硫氰酸胍，2g/L十二烷基肌酸鈉，體積分?jǐn)?shù)7X 10_6%β -巰基乙醇、3g/L消泡劑-A、0. 05mol/L乙二胺四乙酸，pH值為8. O。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述氯仿/異戊醇混合液中氯仿與異戊醇的體積比為24:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述反提萃取液包含4mol/L異硫氰酸胍、O. 05mol/L 檸檬酸鈉、lmol/L Tris, pH 值為 8. O。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述核酸純化柱為硅膠膜離心吸附柱。
5.利用權(quán)利要求1-4任一所述的試劑盒同時(shí)提取和純化RNA和DNA的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)利用共提取裂解液對(duì)樣品進(jìn)行裂解得到裂解物；(2)將裂解物輕微振蕩，加入2M醋酸鈉、水飽和酚、氯仿/異戊醇混合液，置冰上放置IOmin ；(3)離心，得到上層液相及下層液相；(4)吸取步驟(3)中離心得到的上層液相，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，獲得混合液體A,然后進(jìn)行RNA提取與純化；(5)吸取步驟(3)中離心得到的下層液相，加入反提萃取液，顛倒混勻，靜置，離心，吸取上層液相再加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，靜置，獲得混合液體B，然后進(jìn)行DNA提取與純化；其中，所述共提取裂解液包含4. 5mol/L異硫氰酸胍，2g/L十二烷基肌酸鈉，體積分?jǐn)?shù)7X 10_6%β -巰基乙醇、3g/L消泡劑-A、0. 05mol/L乙二胺四乙酸，pH值為8. O。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述RNA提取與純化的具體方法為將混合液體A離心，棄上清，用70%或75%DEPC酒精洗滌，干燥后加入滅菌DEPC水溶解，即得。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述RNA提取與純化的具體方法為將混合液體A利用核酸純化柱提取與純化，得到高純度的RNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述DNA提取與純化的具體方法為將混合液體B離心，棄上清，用70%或75%DEPC酒精洗滌，干燥后加入滅菌DEPC水溶解，即得。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述DNA提取與純化的具體方法為將混合液體B利用核酸純化柱提取與純化，得到高純度的DNA。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種同時(shí)提取和純化RNA和DNA的試劑盒及方法。本發(fā)明所述的試劑盒包括共提取裂解液、2M醋酸鈉、水飽和酚、氯仿/異戊醇混合液、異丙醇、70%或75%DEPC酒精、滅菌DEPC水、反提萃取液和核酸純化柱。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是建立了同時(shí)提取RNA和DNA的提取方法并組裝了試劑盒。該方法與經(jīng)典的單獨(dú)提取RNA或者DNA單獨(dú)提取的方法相比較，提取效率相當(dāng)，同時(shí)在方法中還提供了RNA和DNA進(jìn)一步純化的方法。其優(yōu)勢(shì)在于能夠同時(shí)提取并純化RNA和DNA，使用者可以根據(jù)實(shí)際的檢測(cè)需要，選取不同的方法進(jìn)行核酸提取。此外，本發(fā)明也為同時(shí)檢測(cè)兩種不同類型核酸的檢測(cè)技術(shù)提供了很好的基礎(chǔ)平臺(tái)。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102911932SQ201210414019
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月25日
發(fā)明者張偉, 蒲靜, 高志強(qiáng), 凌鳳俊, 汪琳, 谷強(qiáng), 喬彩霞, 尹義, 張利峰, 張鶴曉 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局