專利名稱：一株具誘導(dǎo)大豆抗大豆胞囊線蟲的簡單芽孢桿菌及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具誘導(dǎo)大豆抗大豆胞囊線蟲的簡單芽孢桿菌及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大豆胞囊線蟲病(Soybean Cyst Nematode,簡稱SCN)是由大豆胞囊線蟲Qieterodera glycines)侵染引起的,是危害世界大豆生產(chǎn)最嚴(yán)重的病害之一。該病害具有分布廣、危害重、寄主范圍寬、傳播途徑多、休眠體(胞囊)存活時間長等特點，是一種極難防治的土傳病害。近年來隨著我國大豆栽培面積的不斷擴大，大豆胞囊線蟲的分布也越來越廣，主要發(fā)生在東北和黃淮海等共14個省市自治區(qū)，大豆受其為害后一般減產(chǎn)20% 30%，重者可達70% 80%，甚至顆粒無收。大豆胞囊線蟲是土傳的定居性內(nèi)寄生線蟲，侵染植株根系，成為目前世界各國大豆生產(chǎn)中的主要難題，化學(xué)防治使用的大多數(shù)殺線劑嚴(yán)重污染 環(huán)境，破壞生態(tài)平衡。近20年來，隨著可持續(xù)農(nóng)業(yè)和有機農(nóng)業(yè)的發(fā)展，人們已將防治線蟲病害的工作重點轉(zhuǎn)向了生物防治。大豆胞囊線蟲的生防因子有很多，包括真菌、細(xì)菌、病毒和原生動物等。利用植物根圍促生菌(plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)防治大豆胞囊線蟲病害已有研究，Becker等1988年報道了假單胞菌屬(Pseudomonas)和芽孢桿菌屬{Bacillus)對根結(jié)線蟲病害有防治作用。Racke和Sikora 1992年報道了根際細(xì)菌sp.和B. cereus對防治南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incogni ia)、大豆胞囊線蟲(/fe teroderaglycines)、玉米胞囊線蟲(/feferoofera zeae)和燕麥胞囊線蟲QioterochrB avenae)幼蟲有效。芽孢桿菌屬切―sp.)的細(xì)菌能夠產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，包括脂肽類、肽類、磷脂類、類噬菌體顆粒和細(xì)菌素等，具有抗細(xì)菌、真菌、病毒和支原體的功能。而且，芽孢桿菌易于繁殖，適應(yīng)環(huán)境能力強；絕大多數(shù)芽孢桿菌對人畜無毒，具有很強的環(huán)境適應(yīng)性和環(huán)境友好性，因而在生物防治中起著重要的作用，具有很大的開發(fā)利用價值。相關(guān)研究表明簡單芽孢桿菌有促生和生防作用，其對于大白菜軟腐病的防治率高達到83%，同時增加大白菜產(chǎn)量50%，而簡單芽孢桿菌對大豆胞囊線蟲病的防治還尚未有報道。針對生產(chǎn)上存在這一問題，通過系統(tǒng)篩選獲得一株細(xì)菌，利用該菌或該菌的代謝產(chǎn)物處理大豆種子，可誘導(dǎo)大豆在種子萌發(fā)和生長期間產(chǎn)生對大豆胞囊線蟲的抗性，從而解決了大豆胞囊線蟲病的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是選擇一株菌株對大豆種子處理后可以誘導(dǎo)苗期大豆對胞囊線蟲產(chǎn)生明顯的抗性，將菌株按常規(guī)液體發(fā)酵培養(yǎng)后，可以用該菌的代謝產(chǎn)物，開發(fā)出處理大豆種子的種子處理劑，經(jīng)過處理的大豆種子可以誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生對大豆胞囊線蟲的抗性。本發(fā)明篩選獲得的一株細(xì)菌菌株是簡單芽孢桿菌(feci77m simplex) Sneb545,保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期2012年10月11日；保藏登記入冊的編號CGMCC No. 6650。簡單芽孢桿菌{Bacillus 耶7α) Sneb545是從中國遼寧省沈陽市沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗田中篩選出的一株對大豆具有強誘導(dǎo)活性的細(xì)菌菌株。本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)，土壤細(xì)菌有很多株細(xì)菌都具有一定的誘導(dǎo)大豆抗胞囊線蟲的能力，從這些細(xì)菌中篩選出一株性狀相對較好的菌株——簡單芽孢桿菌{Bacillussimplex ) Sneb545進行了進一步的研究。本發(fā)明還涉及用于誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生抗胞囊線蟲抗性的細(xì)菌代謝物，其是由本發(fā)明的細(xì)菌菌株簡單芽孢桿菌{Bacillus si耶/^r)Sneb545經(jīng)過常規(guī)的液體發(fā)酵培養(yǎng)后獲得。本發(fā)明的細(xì)菌菌株簡單芽孢桿菌(Bacillus是通過培養(yǎng)皿培養(yǎng)后，再經(jīng)擴大發(fā)酵培養(yǎng)來制備，其具體方法如下
I.培養(yǎng)皿培養(yǎng)
培養(yǎng)基配方為牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(NA):牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，蔗糖10g，瓊脂 17-20g，蒸餾水 1000mL。2.液體發(fā)酵培養(yǎng)
其中液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為以重量百分比計，酵母浸膏0. 1%-0. 2%、蛋白胨
0.5%-0. 6%、牛肉浸膏0. 3%-0. 4%、蔗糖1%_2%，余下為蒸餾水，pH為6. 8-7. O。將菌種接種到250mL三角瓶(每瓶裝IOOmL)液體培養(yǎng)基中，25°C 28°C下，搖床轉(zhuǎn)速以 150r · mirf1 180r · mirf1、發(fā)酵 2_3d,優(yōu)選 3d。液體發(fā)酵的菌種可以通過大型發(fā)酵罐進行規(guī)模生產(chǎn)，其產(chǎn)品為發(fā)酵液或發(fā)酵液的制成品。本發(fā)明還涉及一種大豆種子處理劑，其包含有效量的本發(fā)明所述的簡單芽孢桿菌{Bacillus simplex) Sneb545本身或其代謝物作為有效活性成分。本發(fā)明的簡單芽孢桿菌(Bacillus或其代謝物具有對大豆的誘導(dǎo)活性，可用于大豆的種子處理，處理后的大豆對大豆胞囊線蟲的胞囊形成具有很好的抑制作用，解決了大豆胞囊線蟲病的難題。
具體實施例方式 為了更詳細(xì)地進一步闡明而不是為了限制本發(fā)明，給出了下列實施例。實施例I :簡單芽抱桿菌{Bacillus simplex) Sneb545的培養(yǎng)
首先對簡單芽孢桿菌咖Cillus W耶/^r)Sneb545菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，然后對發(fā)酵培養(yǎng)后的代謝產(chǎn)物進行大豆誘導(dǎo)活性試驗，確定其對大豆的誘導(dǎo)作用。將簡單芽孢桿菌、BacillusSneb545的菌體接種到培養(yǎng)基上,培養(yǎng)基配方為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，即成分牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，蔗糖10g，瓊脂17-20g，加蒸餾水至 1000mL，25°C培養(yǎng) 2d。再將菌種接種到250mL三角瓶海瓶裝IOOmL)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為以重量百分比計，酵母浸膏0. 1%-0. 2%、蛋白胨0. 5%-0. 6%、牛肉浸膏0. 3%-0. 4%、蔗糖1%_2%，余下為蒸懼水，pH為6. 8-7. O,發(fā)酵溫度為25_28°C,搖床轉(zhuǎn)速150r · mirT1 180r · mirT1、發(fā)酵時間2-3d。形成的發(fā)酵液或發(fā)酵液的制成品可以直接或間接處理大豆種子。被處理的大豆種子可以減輕由于大豆胞囊線蟲病害所造成的危害。實施例2 :簡單芽抱桿菌(Bacillus simplex、Sneb545的發(fā)酵基本同實施例1，不同之處是將液體培養(yǎng)的菌種接種到IOOOL的發(fā)酵罐進行發(fā)酵，在25°C下培養(yǎng)，pH為7.0，發(fā)酵3d。實施例3 :簡單芽孢桿菌{BacillusSneb545誘導(dǎo)大豆系統(tǒng)抗性的驗證利用裂根試驗設(shè)計(split-root system)探討了菌株Sneb545對大豆胞囊線蟲的
誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性。裂根試驗中的挑戰(zhàn)根系和應(yīng)答根系彼此在空間上完全隔離，應(yīng)答根系中的Sneb545發(fā)酵液與大豆胞囊線蟲沒有直接接觸，菌株對線蟲的控制作用完全依賴于其對植株的誘導(dǎo)抗性。該測定方法可靠，已被廣泛應(yīng)用于生防微生物對土傳病害的系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性研究。I.制備試驗用制劑
按前述液體發(fā)酵培養(yǎng)方法制備簡單芽孢桿菌菌株Sneb545的發(fā)酵液，待備用。 2.制備試驗用線蟲
大豆胞囊線蟲(/feieroofera glycines):大豆胞囊線蟲3號生理小種取自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)北方線蟲研究所試驗基地。采用改良淘洗-過篩法從采取的土樣中分離胞囊，在體視鏡下挑取新鮮、飽滿、成熟、均一的胞囊。胞囊先用O. 5%次氯酸鈉溶液消毒3min，再用無菌水沖洗5次，放在含有少量無菌水的培養(yǎng)皿里，25 °C恒溫箱中培養(yǎng)，淺盤孵化15天后得到2齡幼蟲，將2齡幼蟲懸浮液調(diào)節(jié)到200頭/ml。3.制備試驗用種子
遼豆15 :由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。4.種子處理方法
將大豆種子先用5%次氯酸鈉溶液表面消毒5min，再用無菌水沖洗5次。5試驗方法
采用溫室盆栽處理，取無大豆胞囊線蟲的土和沙，在干熱滅菌鍋中165°C，2h滅菌，然后以V(土)V (沙)為2 :1的比例混勻裝入16X 16cm塑料缽中。每缽中播種3粒遼豆15種子，待豆苗長至兩片子葉時，每缽留I株。將豆苗取出并洗凈，根系分為均等的兩部分。取3個同樣大小的塑料缽，成“品”字形放置，底部的塑料缽分別放于2個16cm直徑的盤托中。在頂部的塑料缽底部開2條IcmX 2cm，幼苗置于頂部的塑料缽中，使分開的根系分別通過2個裂縫到達下部的兩個塑料缽的土壤中，在底部兩個塑料缽中生長的根系分別為挑戰(zhàn)根系和應(yīng)答根系，3個缽中裝入土壤基質(zhì)固定植株。系統(tǒng)置于溫室(25°C、14h光照)，在挑戰(zhàn)根系的塑料缽中2cm表土以下接種Sneb545發(fā)酵液IOml,接種Sneb545發(fā)酵液I周后接種IOmlJ2懸浮液到應(yīng)答根系。以無菌水為對照，共2個處理，3次重復(fù)。35d后調(diào)查應(yīng)答根系缽中的土中的胞囊量和根內(nèi)的大豆胞囊線蟲總數(shù)。5. I 土壤中胞囊的分離與計數(shù)每個土樣稱取200cc(即用IOOOmL燒杯盛水800mL，加土至IOOOmL)，采用淘洗一過篩一貝曼漏斗法收集胞囊，在體視解剖鏡下記錄胞囊
的數(shù)量。5. 2根內(nèi)線蟲的染色與計數(shù)將根系用流水清洗干凈，稱根鮮重，然后用次氯酸鈉一酸性品紅染色法進行根內(nèi)線蟲的染色，在體視顯微鏡下觀察記錄根內(nèi)線蟲數(shù)量，并折成每克根鮮重線蟲的數(shù)量。5.3防治效果計算
胞囊抑制率 (％ )=
權(quán)利要求
1.一株處理大豆種子后具有誘導(dǎo)大豆抗大豆胞囊線蟲的細(xì)菌菌株，其特征在于該菌株為簡單芽孢桿菌Qiacillus已于2012年10月11日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 6650。
2.權(quán)利要求I所述的細(xì)菌菌株的液體發(fā)酵方法，其特征在于液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為以重量百分比計，酵母浸膏O. 1%-0. 2%、蛋白胨O. 5%-0. 6%、牛肉浸膏O. 3%-0. 4%、蔗糖1%_2%，余下為蒸餾水，pH為6. 8-7. 0，發(fā)酵溫度為25-28°C，搖床轉(zhuǎn)速150r · mirT1 180r · min \發(fā)酵時間 2_3d。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的液體發(fā)酵方法，其特征在于所述的發(fā)酵時間為3d。
4.具有誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生抗大豆胞囊線蟲抗性的發(fā)酵液原液的制備方法，其特征在于是由權(quán)利要求I所述的細(xì)菌菌株經(jīng)過液體發(fā)酵后形成的，液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為以重量百分比計，酵母浸膏O. 1%-0. 2%、蛋白胨O. 5%-0. 6%、牛肉浸膏O. 3%-0. 4%、蔗糖1%_2%，余下為蒸懼水，pH為6. 8-7. O,發(fā)酵溫度為25_28°C,搖床轉(zhuǎn)速150r · mirT1 180r · mirT1、發(fā)酵時間 2-3d。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的發(fā)酵時間為3d。
6.一種大豆種子處理劑，其特征在于，包含有效量的根據(jù)權(quán)利要求2所述的液體發(fā)酵方法中所形成的發(fā)酵液原液，用于誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生對大豆胞囊線蟲的抗性。
7.權(quán)利要求2所述液體發(fā)酵方法中形成的發(fā)酵液原液在誘導(dǎo)大豆抗大豆胞囊線蟲中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株處理大豆種子后具誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生對大豆胞囊線蟲抗性的簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex)Sneb545的培養(yǎng)方法及其應(yīng)用，屬于微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及的細(xì)菌菌株Sneb545，已于2012年10月11日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.6650。將菌株按常規(guī)液體發(fā)酵培養(yǎng)后，可以用該菌的代謝產(chǎn)物，開發(fā)出處理大豆種子的種子處理劑，經(jīng)過處理的大豆種子可以誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生對大豆胞囊線蟲的抗性。本發(fā)明的簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex)Sneb545代謝物處理大豆種子后可以誘導(dǎo)大豆對苗期第一代胞囊線蟲產(chǎn)生明顯的抗性，對大豆胞囊線蟲胞囊的形成有明顯的抑制作用，是很有潛力的生防菌，為防治大豆胞囊線蟲病開辟了新思路。
文檔編號C12R1/07GK102925387SQ20121041420
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月26日
發(fā)明者段玉璽, 陳立杰, 朱曉峰, 王媛媛, 項鵬 申請人:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)