專利名稱：Trx-hPTN融合蛋白及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)基因工程蛋白藥物技術(shù)，具體來說涉及一種Trx-hPTN融合蛋白及其生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
多效生長因子(pleiotrophin,PTN)最早是從牛的子宮中發(fā)現(xiàn)的,對成纖維細胞具有微弱增殖作用的一種肝素結(jié)合細胞因子。PTN基因包含5個外顯子及一個小的非翻譯的外顯子，編碼168個氨基酸，其中包括一個與分泌有關(guān)的32個氨基酸組成的信號肽識別序列，最終分泌的具有生物功能的成熟蛋白由136個氨基酸殘基組成。研究表明其具有多種信號功能，包括促進神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和膠質(zhì)母細胞的特異性分化，促進血管發(fā)生，刺激細胞增殖和遷移、促進神經(jīng)系統(tǒng)及骨發(fā)育等功能。PTN正常表達于胚胎期，在成年的健康組織中很少表達，但目前已發(fā)現(xiàn)包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤中都有PTN的高表達及內(nèi)源性PTN的持續(xù)活化。PTN是一種腫瘤相關(guān)信號因子已被越來越多的研究證實，其在不同類型乳腺癌中的表達也有大量報道。PTN的生物學(xué)活性分別由3種獨立的受體介導(dǎo)SDC3 (N-Syndecan)、受體蛋白酪氨酸磷酸酶和間變性淋巴瘤激酶。在PTN刺激15min后的細胞中，β -catenin與E_cadherin免疫共沉淀顯著地減少,從而導(dǎo)致細胞間黏附力降低，該作用是由PTN調(diào)節(jié)β-catenin的酪氨酸磷酸化水平而引起的。而這種細胞間黏附力的減弱恰恰是腫瘤從原位走向侵襲和轉(zhuǎn)移的開始。研究發(fā)現(xiàn)，ΡΤΝ/ΚΡΤΡβ/ζ信號通路能活化下游的黏附因子和ΡΙ3Κ通路，抑制肺癌細胞的遷移。綜上所述，PTN可通過下游信號通路調(diào)節(jié)包括MMP在內(nèi)的多種靶基因的表達，從而促進乳腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移?？茖W(xué)家日前通過實驗確認，多效生長因子可促進造血干細胞擴張和再生。他們將多效生長因子注入骨髓生長被抑制的實驗鼠體內(nèi)，后者的骨髓干細胞生長速度與未注射多效生長因子的實驗鼠相比提高了 10倍，而且不會導(dǎo)致實驗鼠出現(xiàn)癌變。這項成果將來有望使更廣泛的人群受益于臍帶血移植，對正在接受化療或放療的患者而言，利用多效生長因子進行治療或許具有加速患者血液和免疫系統(tǒng)恢復(fù)的潛力。隨著對人多效生長因子(human pleiotrophin, hPTN)作用機制的不斷深入，人hPTN作為藥物，其需求量將大大增加。目前，雖然該蛋白已利用大腸桿菌菌進行了表達，但它們的方法都存在諸多不足之處。例如目標蛋白的表達量很低或表達產(chǎn)物通常以包涵體形式存在，要通過變性復(fù)性得復(fù)雜操作才能得到活性形式的hPTN，從而減少了活性蛋白的產(chǎn)率；其次以融合蛋白的形式進行了表達，但融合的片段分子量很大且影響到了表達的重組蛋白的生物活性，所以必須要切除融合的片段，而要將PTN蛋白、融合、未經(jīng)切割的融合蛋白及加入的將融合片段與目標蛋白切除的相應(yīng)蛋白酶分離開來需要很多的蛋白質(zhì)純化步驟，純化的步驟多，蛋白質(zhì)的得率就明顯降低，且更可能導(dǎo)致目標產(chǎn)物的失活。因此，開發(fā)出一種可以大量、快速、低成本的制備具有生物活性的PTN蛋白是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容
基于此，本發(fā)明提供一種Trx-hPTN融合蛋白及其生產(chǎn)方法，根據(jù)該方法可獲得大量穩(wěn)定、可溶且具有生物活性的Trx-hPTN融合蛋白。解決上述問題的技術(shù)方案如下一種Trx-hPTN融合蛋白的生產(chǎn)方法，主要包括以下步驟(I)克隆hPTN基因用特異引物擴增出完整的基因片段，所用hPTN特異引物中引ABamH I酶切位點和Hind III酶切位點，回收PCR產(chǎn)物連接到質(zhì)粒pMD20_T載體，得質(zhì)粒hPTN/pMD20-T,經(jīng)過測序確定為正確表達序列；(2)構(gòu)建原核表達載體將表達載體pET32a⑴和步驟(I)所得的質(zhì)粒hPTN/PMD20-T經(jīng)過Hind III及BamH I雙酶切并純化回收，并利用T4DNA連接酶連接，得重組載 體 pET32a (+)/hPTN ；(3)大腸桿菌表達菌株轉(zhuǎn)化子的篩選利用T4DNA連接酶連接，將步驟(2)所得的重組載體pET32a(+)/hPTN轉(zhuǎn)化到大腸桿菌T0P10菌株中，再從T0P10中提取重組載體pET32a (+) /hPTN ;用熱激法將重組載體pET32a (+) /hPTN轉(zhuǎn)入到大腸桿菌表達菌株Rosetta中，LB Amp抗性平板篩選得到包含有重組質(zhì)粒pET32a(+)/hPTN的大腸桿菌表達菌株轉(zhuǎn)化子;(4) Trx-hPTN融合蛋白的表達將步驟(3)所得的大腸桿菌重組轉(zhuǎn)化子在37°C培養(yǎng)至OD600為O. 4-0. 8時加入濃度為O. 05-1. OmM的IPTG，于25-37。。誘導(dǎo)4-10小時，超聲破碎，離心取上清液，得到重組融合蛋白Trx-hPTN ；(5) Trx-hPTN融合蛋白的純化利用鎳親合層析對Trx-hPTN融合蛋白進行純化。在其中一些實施例中，步驟(I)所述特異引物為PTN-上游引物5’ -GCGGATCCATGCAGGCTC AACAGTACCAG-3’ ；PTN-下游引物5’ -GCAAGCTTTTAATCCAGCATCTTCTCCTGTTTC-3’。在其中一些實施例中，步驟(3)所述的表達菌株為大腸桿菌Rosetta。在其中一些實施例中，步驟(5)所述的鎳親合層析方法中所用的洗脫液為100-400mM咪唑的pH 8. OTris-HCl溶液；所得Trx-hPTN融合蛋白的純度為90%以上。在其中一些實施例中，步驟(5)所述的Trx-hPTN融合蛋白的純化方法為利用鎳親合層析對Trx-hPTN融合蛋白進行純化，然后再采用PBS透析和超濾濃縮。在其中一些實施例中，步驟(5)所述的鎳親合層析方法中所用的洗脫液為含有400mM 咪唑的 pH 8. OTris-HCl 溶液。本發(fā)明所述的一種Trx-hPTN融合蛋白及其生產(chǎn)方法具有以下優(yōu)點—是利用pET32_a(+)載體和菌株Rosetta,實現(xiàn)了表達產(chǎn)物與增溶因子Trx融合，得到大量可溶形式的Trx-hPTN融合蛋白；二是在該表達系統(tǒng)內(nèi)，Trx-hPTN融合蛋白按適當?shù)姆绞秸郫B，并保持天然構(gòu)象；是摸索出一條有效純化活性重組Trx-hPTN的方法；四是測定了大腸桿菌表達的Trx-hPTN融合蛋白的生物活性，測定結(jié)果表明細胞增殖試驗和信號通路激活實驗都證明表達的Trx-hPTN融合蛋白具有很好的生物活性。


圖I為hPTN基因PCR結(jié)果示意圖；圖2為載體構(gòu)建示意圖；圖3為表達載體的酶切驗證圖；圖4為表達產(chǎn)物的優(yōu)化圖；圖5為表達產(chǎn)物的純化過程的優(yōu)化；圖6為純化蛋白經(jīng)透析和超濾濃縮后的結(jié)果及WB驗證圖；圖7為重組蛋白的質(zhì)譜驗證結(jié)果；
圖8為表達產(chǎn)物的活性測定；圖9為密碼子未經(jīng)優(yōu)化的轉(zhuǎn)化子經(jīng)誘導(dǎo)后的可溶性蛋白的表達情況。
具體實施例方式實施例I本發(fā)明選用大腸桿菌表達菌株Rosetta、載體擴增菌株T0P10和表達載體pET32-a(+)均購自美國 Invritrogen 公司。所用培養(yǎng)基配方如下I)LB液體培養(yǎng)基NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸餾水1L，高壓滅菌，室溫保存；2) LB/Amp平板NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸餾水1L，瓊脂粉15g，高壓滅菌后，冷卻至70°C以下,加入ImL濃度為100mg/ml的氨節(jié)青霉素(Ampicillin),充分混均后倒板，4°C避光保存；3)LB/Amp培養(yǎng)基NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸餾水1L，高壓滅菌后，冷卻至70°C以下,加入ImL Ampicillin (100mg/ml),充分混均,4°C保存；LB液體培養(yǎng)基NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸餾水1L，高壓滅菌，室溫保存。4) 50 X TAE 瓊脂糖凝膠電泳緩沖液Tris 堿 121g，冰乙酸 28. 6mL,0. 5mol/LEDTA(pH 8. 0)50mL,加蒸懼水定容至500mL,室溫保存；5)50mg/mL氨芐青霉素保存液氨芐青霉素0. 5g，加蒸餾水溶解并定容至10mL，分裝后于-20°C保存；6) 5X SDS-PAGE 上樣緩沖液1M Tris-HCl (pH 6. 8) I. 25mL, SDS 0. 5g, BPB25mg,甘油2. 5mL，加去離子水溶解后定容至5mL，分裝(約500 μ L每份)后于室溫保存，使用每份加入25 μ L β -巰基乙醇混勻；7) 5 X SDS-PAGE 電泳緩沖液=Tris 15. lg，甘氨酸 94g，SDS 5. 0g，加入約 800mL 去
離子水，充分攪拌溶解后定容至1L，室溫保存；8)考馬斯亮藍R-250染色液考馬斯亮藍R-2500. 25g，加入225mL甲醇、46mL的冰乙酸、225mL去離子水并攪拌均勻，濾紙去除顆粒物質(zhì)后，室溫保存；9)考馬斯亮藍脫色液冰乙酸50mL，甲醇150mL，去離子水300mL，充分混合后，室
溫保存；本實施例所述的一種Trx-hPTN融合蛋白及其生產(chǎn)方法,主要包括以下步驟(I)克隆hPTN基因根據(jù)人PTN基因成熟蛋白的一級結(jié)構(gòu)，按大腸桿菌的密碼子偏好性，人工合成了成熟PTN基因。用hPTN特異引物擴增出完整人重組hPTN基因片段，所用hPTN特異引物中引入BamH I酶切位點和Hind III酶切位點，RT-PCR條件為95°C預(yù)變性，4min，一個熱循環(huán)；94°C熱變性30s，55°C褪火30s，72°C延伸45s，34個熱循環(huán)；72°C復(fù)性IOmin。所獲得的擴增片斷連接到pMD20-T載體(購自于廣州TAKARA公司)，得質(zhì)粒hPTN/PMD20-T，用PCR、酶切和核酸測序鑒定，測定序列與人工合成的hPTN的DNA序列一致。人工合成的hPTN基因的DNA序列如下SEQ ID NO: I GGGAAGAAAGAGAAACCAGAAAAGAAAGTGAAGAAGTCTGACTGTGGAGAATGGCAGTGGAGTGTGTGTGTGCCCACCAGTGGAGACTGTGGGCTGGGCACACGGGAGGGCACTCGGACTGGAGCTGAGTGCAAACAAACCATGAA GACCCAGAGATGTAAAATCCCCTGCAACTGGAAGAAGCAATTTGGCGCGGAGTGCAAATACCAGTTCCAGGCCT GGGGAGAATGTGACCTGAACACAGCCCTGAAGACCAGAACTGGAAGTCTGAAGCGAGCCCTGCACAATGCCGAATGCCAGAAGACTGTCACCATCTCCAAGCCCTGTGGCAAACTGACCAAGCCCAAACCTCAAGCAGAATCTAAGAAAAAGAAAAAGGAAGGCAAGAAACAGGAGAAGATGCTGGATPCR擴增引物為SEQ ID NO:2 PTN-上游引物5 ’ -GCGGATCCATGCAGGCTCAACAGTACCAG-3 ’(斜體加下劃線部分序列代表BamH I位點)；SEQ ID NO:3 PTN-下游引物5’ -GCAAGCTTTTAATCCAGCATCTTCTCCTGTTTC-3> (斜體加下劃線部分序列代表Hind III位點)；PCR結(jié)果示意圖如圖I所示。(2)構(gòu)建原核表達載體①用Hind III和BamH I雙酶切重組質(zhì)粒hPTN/pMD20_T，獲得目的片斷hPTN，反應(yīng)體系如下(所用內(nèi)切酶及緩沖液均購自大連TAKARA公司)
質(zhì)粒 hPTN/pMD20-T15
IOxK緩沖液5 μ .
Hind III^ L
BamH 丨5 U
無菌水至50 μ ②用Hind III和BamH I雙酶切pET32a (+)，獲得載體片斷，反應(yīng)體系如下(所用內(nèi)切酶及緩沖液均購自大連TAKARA公司)質(zhì)粒 pET32a(+)15 μ
IOxK緩沖液5μ[
HindIII5 U BamH Ii L
無菌水至50③由①及②步后所得目的片斷和載體片斷，DNA凝膠收回試劑盒回收，該試劑盒購自大連TAKARA公司，具體操作按試劑盒說明書進行；構(gòu)建示意圖見圖2。④回收得到的目的片斷和載體用T4DNA連接酶(購自大連TAKARA公司)進行連接 反應(yīng)，反應(yīng)體系如下
質(zhì)粒ρΕΤ32片段I uL
目的片段落3μ ,
IOx緩沖液I μΕ
Τ4 DNA 連接酶0.5 μL
無菌水至丨0卜山得重組載體pET32a (+) /hPTN。(3)大腸桿菌表達菌株轉(zhuǎn)化子的篩選①轉(zhuǎn)化重組載體至大腸桿菌T0P10pET32a(+)/hPTN連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli T0P10感受態(tài)細胞，涂布LB Amp平板，37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時；挑取培養(yǎng)板上長出的轉(zhuǎn)化子，接入5mLAmp+/LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)過夜，提取重組質(zhì)粒；對來自不同單克隆菌落的重組質(zhì)粒進行酶切，15 μ L酶切體系
12 μΕ pET32a(+)/hPTN 重組質(zhì)粒
1.5 μ Buffer K 0.75 μ ν BamFf I
0.75 μΕ Hind III酶切條件37°C水浴，3h。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定克隆結(jié)果，表達載體的酶切驗證圖，如圖3所示。②轉(zhuǎn)化重組載體至大腸桿菌表達菌Rosetta
將陽性克隆的重組載體pET32a(+)/hPTN熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細胞，涂板，37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時，即LB Amp抗性平板篩選得到包含有重組載體pET32a(+) /hPTN 的 Rosetta 轉(zhuǎn)化子。(4)Trx-hPTN融合蛋白的表達獎得到的大腸桿菌重組轉(zhuǎn)化子在37°C培養(yǎng)至0D_為O. 4 — O. 8時加入濃度為O. 05mM-l. OmM的IPTG，25_37°C誘導(dǎo)4小時以上(根據(jù)成本，可為4-10小時)，誘導(dǎo)表達重組蛋白體，表達產(chǎn)物的優(yōu)化圖，如圖4所示。可溶表達誘導(dǎo)條件的優(yōu)化得到的大腸桿菌重組轉(zhuǎn)化子在37°C培養(yǎng)至0D_為O. 5時，分別加入0mM、0. 05mM、
O.lmM、0. 2mM、0. 5mM和I. OmM的IPTG，于25_37°C誘導(dǎo)5小時，超聲破碎后，離心取上清液，加入SDS-PAGE樣品緩沖液，對其可溶蛋白進行分析，確定IPTG的濃度為O. 05mM-l. OmM時 (圖4所示)，都可以得到可溶性Trx-hPTN融合蛋白的較高水平表達；為節(jié)約成本，縮短生產(chǎn)周期，我們采用低濃度的IPTG (O. 05-0. ImM)進行誘導(dǎo)表達，菌體最佳收獲期為誘導(dǎo)5小時左右；而沒有經(jīng)過優(yōu)化的人PTN基因的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的Trx-hPTN融合蛋白量無法從SDS-PAGE膠中觀察到(圖9)。(5) Trx-hPTN融合蛋白的純化經(jīng)擴大培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(37°C，0. 05mM IPTG誘導(dǎo)5小時)，收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的表達菌的菌體，將菌體重懸液于50ml緩沖液A (50mM Tris-HCl, 300mM NaCl，20mM咪唑和ImM蛋白酶抑制劑PMSF，pH 8. O)用超聲破碎儀進行破碎，功率300W，破碎5s，間隙9s，90次；破碎后的菌液進行離心，4°C，30000g，15min ;離心所得到的上清液加入到經(jīng)緩沖液A預(yù)平衡的鎳親合層析柱中；經(jīng)IOOml緩沖液B (50mM Tris-HCl, 300mM NaCl，20_40mM咪唑和0. 5-1. 0%Triton X-114，pH 8. 0，先于冰浴上預(yù)冷至0_4°C )漂洗蛋白純化柱子后(以上操作均在4°C的環(huán)境中開展)，加入不同濃度咪唑的(40mM、60mM、80mM、100mM、200mM和400mM)緩沖液C (50mM Tris-HCl, 300mM NaCl, pH 8. 0)將蛋白洗脫下來，利用400mM的咪唑可以得到純度達90%的重組蛋白，融合蛋白的分子量約為35-40kDa，表達產(chǎn)物的純化過程的優(yōu)化如圖5所示；所得蛋白經(jīng)WB分析，WB結(jié)果表明，該蛋白是Trx-hPTN融合蛋白，融合蛋白的分子量約在35-40kDa之間(圖6所示)。以上蛋白經(jīng)PBS透析后，超濾濃縮7_10倍，經(jīng)上述純化步驟，IL誘導(dǎo)表達的菌液可純化得到約IOmg的重組蛋白(純化效率如表I所示)，純度超過90%,純化的蛋白質(zhì)經(jīng)質(zhì)譜分析,進一步證明該蛋白就是Trx-hPTN融合蛋白(圖7所示)。表ITrx-hPTN融合蛋白和純化效率表
權(quán)利要求
1.ー種Trx-hPTN融合蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于，主要包括以下步驟 (1)克隆hPTN基因用特異引物擴增出完整的基因片段，所用hPTN特異引物中引入BamH I酶切位點和Hind III酶切位點，回收PCR產(chǎn)物連接到質(zhì)粒pMD20_T載體，得質(zhì)粒hPTN/pMD20-T,經(jīng)過測序確定為正確表達序列； (2)構(gòu)建原核表達載體將表達載體pET32a(+)和步驟(I)所得的質(zhì)粒hPTN/pMD20_T經(jīng)過Hind III及BamH I雙酶切并純化回收，并利用T4DNA連接酶連接，得重組載體pET32a(+)/hPTN ； (3)大腸桿菌表達菌株轉(zhuǎn)化子的篩選利用T4DNA連接酶連接，將步驟(2)所得的重組載體pET32a (+) /hPTN轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP IO菌株中，再從TOP IO中提取重組載體pET32a (+) /hPTN ;用熱激法將重組載體pET32a (+) /hPTN轉(zhuǎn)入到大腸桿菌表達菌株Rosetta中，LB Amp抗性平板篩選得到包含有重組載體pET32a(+)/hPTN的大腸桿菌表達菌株轉(zhuǎn)化子; (4)Trx-hPTN融合蛋白的表達將步驟(3)所得的大腸桿菌重組轉(zhuǎn)化子在37°C培養(yǎng)至OD600為O. 4-0. 8時，加入濃度為O. 05-1. OmM的IPTG，于25_37°C誘導(dǎo)4-10小時，超聲破碎，離心取上清液，得到重組融合蛋白Trx-hPTN ； (5)Trx-hPTN融合蛋白的純化利用鎳親合層析法對Trx-hPTN融合蛋白進行純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟(I)所述hPTN特異引物為 PTN-上游引物5’ -GCGGATCCATGCAGGCTCAACAGTACCAG-3’ ； PTN-下游引物5’ -GCAAGCTTTTAATCCAGCATCTTCTCCTGTTTC-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟(3)所述的表達菌株為大腸桿菌Rosetta。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟(5)所述的鎳親合層析方法中所用的洗脫液為含有100-400mM咪唑的pH 8. OTris-HCl溶液；所得的Trx-hPTN融合蛋白的純度為90%以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟(5)所述的Trx-hPTN融合蛋白的純化方法為利用鎳親合層析對Trx-hPTN融合蛋白進行純化，然后再采用PBS透析和超濾濃縮。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟(5)所述的鎳親合層析方法中所用的洗脫液為含有400mM咪唑的pH 8. OTris-HCl溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求I一 6任一項所述的生產(chǎn)方法制得的Trx-hPTN融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種Trx-hPTN融合蛋白及其生產(chǎn)方法，主要包括以下步驟克隆hPTN基因，得質(zhì)粒hPTN/pMD20-T；構(gòu)建原核表達載體，得重組載體pET32a(+)/hPTN；將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主中，得到大腸桿菌表達菌株轉(zhuǎn)化子；將所得轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)得Trx-hPTN融合蛋白；利用鎳親和層析、PBS透析和超濾濃縮純化，得純度90%以上的Trx-hPTN融合蛋白。本發(fā)明所述的生產(chǎn)方法，利用pET32-a(+)作為載體、優(yōu)化組合誘導(dǎo)表達條件，最終可高效表達可溶Trx-hPTN融合蛋白的方法，既保證了Trx-hPTN融合蛋白的生物學(xué)活性也高效地獲得了大量穩(wěn)定蛋白。
文檔編號C12N15/70GK102965387SQ20121041533
公開日2013年3月13日 申請日期2012年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月25日
發(fā)明者吳東海, 李洪波, 胡興, 徐愛民, 李鵬, 金守光, 李娜 申請人:中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院