專利名稱：一種原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化選育高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶菌株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化選育高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶菌株的方法，具體地說是利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化育種技術(shù)將重組質(zhì)粒PMA-BSAP轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌Zj016原生質(zhì)體，適宜的條件下再生細胞壁，成功獲得一株重組轉(zhuǎn)化菌ZH-ZjOie ;傳代多次實驗證明該重組轉(zhuǎn)化菌的遺傳性能穩(wěn)定。初步優(yōu)化該轉(zhuǎn)化菌的搖瓶培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件后，重組轉(zhuǎn)化菌ZH-ZjOie發(fā)酵產(chǎn)亮氨酸氨肽酶酶活為161U/mL，達原始菌株Zj016的23倍。屬于酶制劑、食品添加劑技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)是20世紀60年代發(fā)展起來的一項重要的分子生物學(xué)技術(shù)，應(yīng)用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)進行微生物選育，因為酶解去除了細胞壁，去除了細胞與外源DNA相互接觸和交流的天然屏障，可以打破微生物的種屬界限，實現(xiàn)遠源菌株間的基因重組；且遺 傳信息量大，遺傳物質(zhì)的傳遞更為完整，有利于提高育種速度，從而使得人們能夠在短時間內(nèi)選育到理想菌株。微生物菌種是發(fā)酵工業(yè)的核心，由其代謝產(chǎn)生的酶類已經(jīng)應(yīng)用于人們生活的方方面面，蛋白酶就在食品、皮革、洗滌劑等工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域都有重要的應(yīng)用，酶制劑是發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的核心產(chǎn)品，酶制劑行業(yè)推動了發(fā)酵工業(yè)和相關(guān)行業(yè)的發(fā)展，并產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟和社會效益。氨肽酶是一類從蛋白質(zhì)或肽鏈的氮端酶切氨基酸殘基的外肽酶的總稱，其在食品行業(yè)、醫(yī)學(xué)、化工等方面都具有廣泛的應(yīng)用。國內(nèi)在氨肽酶生產(chǎn)方面的研究處于快速發(fā)展的階段，對于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，填補國內(nèi)產(chǎn)品的空白，替代進口產(chǎn)品，增強我國酶制劑行業(yè)競爭力，打破該產(chǎn)品被國外的壟斷有著重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)篩選高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶菌株的方法，篩選到的高產(chǎn)菌株產(chǎn)酶能力相對出發(fā)菌株有顯著提高。本發(fā)明的技術(shù)方案一種原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化選育高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶菌株的方法，對可產(chǎn)亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢桿菌Zjoie的原生質(zhì)體制備及再生條件進行優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上，將重組質(zhì)粒PMA-BSAP與所制備的枯草芽孢桿菌Zj016的原生質(zhì)體混合于高滲緩沖液中，在PEG介導(dǎo)下，使原生質(zhì)體與PMA-BSAP發(fā)生相互凝聚，進行遺傳轉(zhuǎn)化，適宜的條件下再生細胞壁，成功獲得一株重組轉(zhuǎn)化菌ZH-Zj016，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號=CGMCC No. 6559，初步優(yōu)化該重組轉(zhuǎn)化菌的搖瓶培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件，獲得高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶菌株，工藝為
A.高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶菌株篩選
(1)出發(fā)菌株枯草芽孢桿菌(feci77心subtilisnm^(食品與發(fā)酵工業(yè)2006年32卷第3期已公開，本校實驗室保藏，申請日起20年內(nèi)向公眾提供)；
(2)質(zhì)粒重組質(zhì)粒PMA-BSAP，詳見中國專利CN102492645A；
(3)高滲緩沖液(SMM液)(mol/L):蔗糖O.5，順丁烯二酸O. 02，MgCl2 O. 02，用去離子水配制，調(diào)pH為7.0 ;
(4)融合劑用SMM液配制質(zhì)量濃度40%PEG6000，調(diào)pH為7. O ;
(5)溶菌酶溶液用SMM高滲液配制成20mg/mL，過濾除菌，_20°C保存；
(6)液體培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，氯化鈉5，牛肉膏5，用去離子水配制，pH7.2，121°C 滅菌 20 min ；
⑵固體培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，氯化鈉5，牛肉膏5，瓊脂20，用去離子水配制，pH7. 2，121°C 滅菌 20 min ；
(8)再生培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，牛肉膏5，NaCl5，瓊脂粉40，用SMM液配制，pH
7. 2 ；
(9)轉(zhuǎn)化子再生培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，牛肉膏5，酪蛋白氨基酸水解物5，葡萄糖6，氯化鈉I. 2，瓊脂20，卡那霉素O. 05，用SMM溶液配制，pH 7.2;
(10)高產(chǎn)菌株篩選培養(yǎng)基(g/L):可溶性淀粉6，豆柏18，酵母膏24，甘油2.5，K2HPO4 ·3H20 6，CoCl2O. 015，L-亮氨酸-4-硝基苯胺O. 5，卡那霉素O. 05，瓊脂20，用去離子水配制，pH 8. O ； (11)種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，氯化鈉5，牛肉膏5，用去離子水配制，pH7.2;
(12)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):可溶性淀粉6，豆柏18，酵母膏24，甘油2.5，K2HPO4 · 3H20 6，CoCl2 O. 015，卡那霉素O. 05，用去離子水配制，pH 8. 0，121°C滅菌20 min ；
(13)枯草芽孢桿菌Zj016原生質(zhì)體制備將培養(yǎng)至對數(shù)期的Zj016菌液5000r/min離心10 min,去上清，用無菌生理鹽水洗滌菌體2次，SMM液洗滌2次后重懸，然后加入溶菌酶液至酶終濃度為2. O mg/mL, 37°C下振蕩酶解30 min, 2000r/min離心收集原生質(zhì)體,用SMM液洗滌后重懸，重懸液中Zj016原生質(zhì)體量為8 X IO9個/mL ；
(14)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化取8X IO9個/mL的枯草芽孢桿菌Zj016原生質(zhì)體懸液500 μ L，依次加入20 μ L O. I μ g/ μ L的質(zhì)粒PMA-BSAP及20 μ L的高滲緩沖液SMM，用槍頭輕輕吹吸混勻；再加入I. 5mL融合劑,輕輕顛倒混勻后，37°C、80 r/min處理5 min, 2000 r/min離心10 min ;用SMM洗滌2次后重懸；
(15)再生將所得重懸液稀釋涂布于轉(zhuǎn)化子再生培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，得轉(zhuǎn)化子；重組質(zhì)粒PMA-BSAP自身帶有卡那霉素抗性，在轉(zhuǎn)化子再生培養(yǎng)基上長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子;
(16)高產(chǎn)菌株篩選初篩將獲得的轉(zhuǎn)化子點接于高產(chǎn)菌株篩選培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24h，，記錄菌落周圍顏色的變化產(chǎn)生的時間及其顏色深淺，菌落特征及其變色圈直徑大小，根據(jù)平板上單菌落周圍顏色的變化顯著及其變色圈直徑的較大者，初步篩選產(chǎn)亮氨酸氨肽酶菌株；
復(fù)篩將初篩后的菌株進行搖瓶發(fā)酵試驗，回轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速225 r/min，37°C培養(yǎng)30 h，測定酶活。得到一株優(yōu)良的轉(zhuǎn)化菌株，產(chǎn)酶酶活力達126 U/mL,產(chǎn)酶水平是出發(fā)菌Zj016的18倍。B.轉(zhuǎn)化菌搖瓶培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化
通過單因素實驗考察了碳源、氮源、初始pH、培養(yǎng)溫度、裝液量，接種量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。得出的最佳條件為可溶性淀粉6 g/L，豆柏18 g/L，酵母膏24 g/L，甘油2 mL/L,K2HPO4 ·3Η20 6g/L，CoCl2 O. 6mmol/L，卡那霉素 O. 05g/L，用去離子水配制；初始 pH 8.0，發(fā)酵溫度37°C，接種量4%，裝液量50mL/250mL。往復(fù)式搖床225 r/min，發(fā)酵30 h條件下，CGMCC No. 6559發(fā)酵產(chǎn)亮氨酸氨肽酶酶活為161 U/mL，達出發(fā)菌株Zj016的23倍。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明成功獲得一株重組轉(zhuǎn)化菌ZH-Zj016，傳代多次實驗證明該重組轉(zhuǎn)化菌的遺傳性能穩(wěn)定。初步優(yōu)化該重組轉(zhuǎn)化菌的搖瓶培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件后，重組轉(zhuǎn)化菌ZH-Zj016發(fā)酵產(chǎn)亮氨酸氨肽酶酶活為161 U/mL,達原始菌株的23倍。生物材料樣品保藏一株高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶的重組轉(zhuǎn)化菌，該重組轉(zhuǎn)化菌命名為枯草芽孢桿菌(Macillus subtil is) ZH_Zj016,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號=CGMCC No. 6559，保藏日期:2012年9月7號。


圖I原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化選育高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶菌株過程示意圖 圖2原生質(zhì)體顯微觀察
圖3高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶菌株初篩平板 圖4不同碳源對產(chǎn)酶的影響 圖5不同氮源對產(chǎn)酶的影響 圖6初始pH對產(chǎn)酶的影響 圖7發(fā)酵產(chǎn)酶曲線。
具體實施例方式實施例I
將500 μ L原生質(zhì)體懸液，分別加入20 μ L O. I μ g/μ L的質(zhì)粒PMA-BSAP及等體積的SMM緩沖液，用槍頭輕輕吹吸混勻；再加入I. 5 mL融合劑，輕輕顛倒混勻后，37°C，80 r/min處理5 min, 2000 r/min離心10 min ;用SMM洗漆2次后重懸,稀釋涂布轉(zhuǎn)化子再生培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24 h，重組質(zhì)粒PMA-BSAP自身帶有卡那霉素抗性，在上述培養(yǎng)基上長出即為轉(zhuǎn)化子。將獲得的轉(zhuǎn)化子點接于高產(chǎn)菌株篩選培養(yǎng)基上，經(jīng)初篩37°C培養(yǎng)24h，記錄菌落周圍顏色的變化產(chǎn)生的時間及其顏色深淺，菌落特征及其變色圈直徑大小，根據(jù)平板上單菌落周圍顏色的變化顯著及其變色圈直徑的較大者，篩選產(chǎn)亮氨酸氨肽酶菌株。將初篩后的菌株進行搖瓶發(fā)酵試驗，回轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速225 r/min，37°C培養(yǎng)30 h，測定酶活。得到一株優(yōu)良的轉(zhuǎn)化菌株，產(chǎn)酶酶活力達126 U/mL,產(chǎn)酶水平是出發(fā)菌Zj016的18倍。搖瓶培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化在可溶性淀粉6 g/L，豆柏18 g/L，酵母膏24 g/L，甘油 2mL/L，K2HPO4 · 3H20 6 g/L, CoCl2 O. 6 mmol/L，卡那霉素 O. 05g/L，用去離子水配制；發(fā)酵條件為初始PH 8.0，發(fā)酵溫度371，接種量4%，裝液量50111172501^，往復(fù)式搖床225 r/min，發(fā)酵30 h條件下，重組轉(zhuǎn)化菌ZH-Zj016發(fā)酵產(chǎn)亮氨酸氨肽酶酶活為161 U/mL，達原始菌株的23倍。
權(quán)利要求
1.一種原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化選育高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶菌株的方法，其特征在于 (1)轉(zhuǎn)化利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，將8X IO9個/mL的枯草芽孢桿菌ZjOie原生質(zhì)體懸液500 μ L，依次加入20 μ L O. I μ g/ μ L的質(zhì)粒PMA-BSAP及20 μ L的高滲緩沖液SMM，用槍頭輕輕吹吸混勻；再加入I. 5 mL融合劑,輕輕顛倒混勻后,37°C、80r/min處理5min,2000 r/min離心10 min ;用SMM洗滌2次后重懸； 所述高滲緩沖液SMM以mol/L計為蔗糖O. 5，順丁烯二酸O. 02，MgCl2 O. 02，用去離子水配制，調(diào)pH為7.0 ; 所述融合劑為40% PEG6000，用SMM液配制，調(diào)pH為7. O ; (2)再生將步驟(I)所得重懸液稀釋涂布于轉(zhuǎn)化子再生培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，得轉(zhuǎn)化子； 所述轉(zhuǎn)化子再生培養(yǎng)基以g/L計為蛋白胨10，牛肉膏5，酪蛋白氨基酸水解物5，葡萄糖6，氯化鈉I. 2，瓊脂20，卡那霉素O. 05，用SMM溶液配制，pH 7.2; (3)篩選挑選步驟(2)所得轉(zhuǎn)化子劃線涂布于高產(chǎn)菌株篩選培養(yǎng)基，成功選育獲得高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶菌株； 所述高產(chǎn)菌株篩選培養(yǎng)基以g/L計為可溶性淀粉6，豆柏18，酵母膏24，甘油2. 5，K2HPO4 · 3H20 6，CoCl2 O. 015，L-亮氨酸-4-硝基苯胺O. 5，卡那霉素O. 05，瓊脂20，用去離子水配制，pH 8. O0
2.用權(quán)利要求I所述原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化選育高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶菌株的方法獲得一株高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶的重組轉(zhuǎn)化菌，該重組轉(zhuǎn)化菌分類命名為枯草芽孢桿菌OfeCiJAASsubtil is) ZH-Z j016,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號CGMCC No. 6559，其產(chǎn)酶酶活力達126 U/mL,產(chǎn)酶水平是出發(fā)菌Zj016的18倍，傳代多次實驗證明該重組轉(zhuǎn)化菌的遺傳性能穩(wěn)定。
3.用權(quán)利要求2所述CGMCCNo. 6559菌株發(fā)酵產(chǎn)亮氨酸氨肽酶的方法，其特征在于通過單因素實驗對該轉(zhuǎn)化菌的搖瓶培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件初步優(yōu)化后，在搖瓶培養(yǎng)基成分為:可溶性淀粉 6 g/L，豆柏 18 g/L，酵母膏 24 g/L，甘油 2 mL/L, K2HPO4·3Η20 6g/L，CoCl2O.6mmol/L,卡那霉素O. 05g/L,用去離子水配制；發(fā)酵條件為初始pH 8. O,發(fā)酵溫度37°C,接種量4%，裝液量50mL/250mL，往復(fù)式搖床225 r/min，發(fā)酵30 h條件下，CGMCC No. 6559發(fā)酵產(chǎn)亮氨酸氨肽酶酶活為161U/mL，達出發(fā)菌株Zj016的23倍。
全文摘要
一種原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化選育高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶菌株的方法，屬于酶制劑、食品添加劑技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)將重組質(zhì)粒PMA-BSAP與從枯草芽孢桿菌Zj016所制備的原生質(zhì)體混合于高滲緩沖液中，在PEG介導(dǎo)下，使原生質(zhì)體與PMA-BSAP發(fā)生相互凝聚，進行遺傳轉(zhuǎn)化，適宜的條件下再生細胞壁，成功獲得一株重組轉(zhuǎn)化菌ZH-Zj016，該重組轉(zhuǎn)化菌已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCCNo.6559；傳代多次實驗證明該重組轉(zhuǎn)化菌的遺傳性能穩(wěn)定。初步優(yōu)化該重組轉(zhuǎn)化菌的搖瓶培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件后，重組轉(zhuǎn)化菌ZH-Zj016發(fā)酵產(chǎn)亮氨酸氨肽酶酶活為161U/mL，達原始菌株的23倍。
文檔編號C12N9/48GK102876705SQ20121041860
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月29日
發(fā)明者田亞平, 汪曉東, 高新星 申請人:江南大學(xué)