專利名稱：抗glipr-2單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗glipr-2單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及抗GLIPR-2單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗GLIPR-2單克隆抗體。
背景技術(shù)：
GLIPR-2 (glioma pathogenesis related-2,GLIPR-2)屬于 PR-1 (pathogenesisrelated-1)家族，普遍表達(dá)于哺乳動(dòng)物外周血單核細(xì)胞和脾臟。最近的研究發(fā)現(xiàn)，腎臟纖維化中GLIPR-2表達(dá)基因在腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)增加，提示它在這一病理過程中具有重要作用。 腎臟纖維化是一種病理生理改變，是腎臟的功能由健康到損傷，再到損壞，直至功能喪失的漸進(jìn)過程，主要包括腎間質(zhì)纖維化與腎小球硬化。以往認(rèn)為腎功能減退是由于腎小球病變所致，然而自1970年Schainuch提出腎小管間質(zhì)(Tubuleinterstitium, TI)損害與腎功能減退呈顯著相關(guān)的觀點(diǎn)以來，TI損害日益得到重視。研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)GLIPR-2的腎小管上皮細(xì)胞明顯向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，是腎臟成纖維細(xì)胞的主要來源之一。但目前對(duì)于GLIPR-2在纖維化中作用的分子機(jī)制尚不清楚，主要原因是缺乏有效的試驗(yàn)工具，特別是抗GLIPR-2的特異性抗體。因此，提供一種抗GLIPR-2的單克隆抗體，對(duì)進(jìn)一步研究GLIPR-2的分子作用機(jī)制具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供抗GLIPR-2單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗GLIPR-2單克隆抗體。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案抗GLIPR-2單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，保藏編號(hào)為CCTCC NO :C201221。本發(fā)明所述抗GLIPR-2單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞由以下方法制備獲得GLIPR-2蛋白免疫BALB/C小鼠，然后取BALB/C小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞在50%聚乙二醇作用下進(jìn)行融合，融合后進(jìn)行HAT培養(yǎng)，然后吸取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行ELISA檢測(cè)，篩選出陽性雜交瘤細(xì)胞用有限稀釋法克隆至能穩(wěn)定分泌抗GLIPR-2單克隆抗體，即獲得抗GLIPR-2單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞。其中，所述GLIPR-2蛋白免疫BALB/C小鼠優(yōu)選為 取GLIPR-2蛋白100 μ g加等質(zhì)量福氏完全佐劑對(duì)BALB/C小鼠進(jìn)行第一次免疫注射，3周后取GLIPR-2蛋白300 μ g加等質(zhì)量福氏不完全佐劑對(duì)BALB/C小鼠進(jìn)行第二次免疫注射，7周后取GLIPR-2蛋白500μ g對(duì)BALB/C小鼠進(jìn)行第三次免疫注射。本發(fā)明免疫所用GLIPR-2蛋白可參照文獻(xiàn)《人GLIPR-2基因的克隆及在原核中可溶性表達(dá)》(黃紹光，李強(qiáng)，鈕芹，倪丹妮，蒲曉允，免疫學(xué)雜質(zhì)，2010年5月第26卷第5期)記載的內(nèi)容獲得。所述HAT培養(yǎng)具體操作優(yōu)選為
用含20%胎牛血清的HAT選擇性培養(yǎng)基與雜交瘤細(xì)胞混勻并加入到種有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中培養(yǎng)2周。所述ELISA檢測(cè)具體操作優(yōu)選為雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液加入到GLIPR-2蛋白包被的酶標(biāo)板中于37°C孵育20min，洗滌后以工作濃度為1:2000的標(biāo)準(zhǔn)加HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG于37°C孵育20min，然后加鄰苯二胺底物顯色15min后終止反應(yīng)。經(jīng)過上述方法制備后,最終篩選出能夠穩(wěn)定分泌抗GLIPR-2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，命名為IAlIAl 1C9E2，并于2012年7月5日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國(guó)武漢大學(xué)。此外，本發(fā)明還提供一種抗GLIPR-2單克隆抗體，由保藏編號(hào)為CCTCC NO:C201221的雜交瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生。制備抗GLIPR-2單克隆抗體可采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)方法，如用雜交瘤細(xì)胞株誘導(dǎo)小鼠腹水，本發(fā)明優(yōu)選為
將保藏編號(hào)為CCTCC N0:C201221的雜交瘤細(xì)胞傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞計(jì)數(shù)，小鼠腹腔接種5 X IO5個(gè)/只，誘導(dǎo)腹水，離心，收集上清，用DEAE-SephadeXA50離子交換柱層析法純化抗GLIPR-2單克隆抗體。本發(fā)明所述保藏編號(hào)為CCTCC N0:C201221的雜交瘤細(xì)胞染色體穩(wěn)定，其分泌產(chǎn)生的抗GLIPR-2單克隆抗體均為IgGl型，效價(jià)較高，直接培養(yǎng)的上清可達(dá)I :2000，小鼠腹水可達(dá)10mg/mL，效價(jià)可達(dá)I : 10000，完全能夠應(yīng)用于GLIPR-2的分子作用機(jī)制的研究中。因此，本發(fā)明還提供了保藏編號(hào)為CCTCC NO :C201221的雜交瘤細(xì)胞在制備抗GLIPR-2單克隆抗體中的應(yīng)用。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一株抗GLIPR-2單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其分泌產(chǎn)生的抗GLIPR-2單克隆抗體，該雜交瘤細(xì)胞能夠穩(wěn)定產(chǎn)生抗GLIPR-2單克隆抗體，且細(xì)胞染色體穩(wěn)定、抗體效價(jià)高，完全能夠應(yīng)用于GLIPR-2的分子作用機(jī)制的研究中。生物保藏信息說明雜交瘤細(xì)胞株1A11A11C9E2于2012年7月5日保藏在保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國(guó)武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC NO :C201221。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了抗GLIPR-2單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗GLIPR-2單克隆抗體，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。下面就本發(fā)明提供的抗GLIPR-2單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗GLIPR-2單克隆抗體做進(jìn)一步說明。實(shí)施例I:免疫小鼠I、材料
抗原GLIPR_2蛋白，根據(jù)文獻(xiàn)《人GLIPR-2基因的克隆及在原核中可溶性表達(dá)》(黃紹光，李強(qiáng)，鈕芹，倪丹妮，蒲曉允，免疫學(xué)雜質(zhì)，2010年5月第26卷第5期)的方法制備；試驗(yàn)動(dòng)物6周齡、17g左右BALB/C小鼠(由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)；試劑福氏完全佐劑和不完全佐劑(購自Promega公司)；2、方法BALB/C小鼠后腿肌肉及背部皮內(nèi)注射抗原免疫，第一次100 μ g加等量福氏完全佐劑，3周后用100 μ g加等量福氏不完全佐劑，7周后500 μ g不加佐劑腹腔注射，腹腔注射后第4天準(zhǔn)備進(jìn)行細(xì)胞融合。實(shí)施例2 :細(xì)胞融合I、材料 骨髓瘤細(xì)胞SP2/0細(xì)胞(由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心提供)；培養(yǎng)基胎牛血清(購自Invitrogen公司);HAT選擇性培養(yǎng)基(購自Sigma公司)；飼養(yǎng)細(xì)胞2、方法腹腔注射后第4天取BALB/C小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞在50%聚乙二醇作用下融合。融合后的雜交瘤細(xì)胞用含20%進(jìn)口胎牛血清的HAT選擇性培養(yǎng)基混均加入種有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中培養(yǎng)，2周后在倒置顯微鏡下挑選克隆孔。接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板7塊共660孔(對(duì)照孔除外)，其中420孔有克隆生長(zhǎng)，融合率為 64% (420/660) ο實(shí)施例3 =ELISA檢測(cè)GLIPR-2蛋白包被酶標(biāo)板，封閉后加雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液37°C孵育20min，洗滌后加HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG (工作濃度I : 2000)，37°C孵育20min后洗滌，加鄰苯二胺(OPD)底物顯色15min后終止反應(yīng)。同時(shí)設(shè)陰性、陽性和空白對(duì)照，篩選出能分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞。結(jié)果顯示，抗體陽性有16孔，陽性率為2. 4% (16/660)。實(shí)施例3 :克隆化培養(yǎng)及染色體鑒定將前述篩選出的陽性雜交瘤細(xì)胞用有限稀釋法進(jìn)行多次克隆化培養(yǎng)，至克隆細(xì)胞抗體陽性率為100%，獲得10株能穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，選擇其中一株活性最強(qiáng)的雜交瘤細(xì)胞，命名為1A11A11C9E2。秋水仙素處理傳代培養(yǎng)的1A11A11C9E2雜交瘤細(xì)胞，O. O75mol/LKC1溶液低滲處定、鋪片，10%Giemsa染色，鏡檢。結(jié)果顯示，正常BALB/C小鼠脾細(xì)胞染色體的數(shù)目恒定為40對(duì)，同品系的SP2/0細(xì)胞的染色體眾數(shù)目為68對(duì)，1A11A11C9E2雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目約為兩種親本染色體數(shù)目的總合，染色后計(jì)數(shù)為102對(duì)。實(shí)施例4 :腹水誘導(dǎo)抗GLIPR-2單克隆抗體及抗體亞型檢測(cè)1A11A11C9E2雜交瘤細(xì)胞經(jīng)傳代取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞計(jì)數(shù)，小鼠腹腔接種5 X IO5個(gè)/只，誘導(dǎo)腹水，離心，收集上清，用DEAE_SephadexA50離子交換柱層析法純化單克隆抗體。用鼠源性單克隆抗體亞型檢測(cè)試劑盒(購自于Sigma)鑒定，結(jié)果顯示，制備的單克隆抗體均為IgGl型。實(shí)施例5 :抗GLIPR-2單克隆抗體特異性及效價(jià)檢測(cè)
I、特異性檢測(cè)采用常規(guī)的Western Blot印跡測(cè)定抗體純度，操作步驟參見《分子生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)》(趙亞力，馬學(xué)斌，韓為東主編)，一抗為本發(fā)明腹水純化后的抗GLIPR-2單克隆抗體，二抗為羊抗鼠IgG/HRP，ECL試劑盒。結(jié)果顯示，抗GLIPR-2單克隆抗體可特異性識(shí)別分子量為17KD的抗GLIPR-2蛋白。2、ELISA法效價(jià)檢測(cè)按照常規(guī)ELISA法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，直接培養(yǎng)的上清可達(dá)I :2000，小鼠腹水可達(dá) 10mg/mL,效價(jià)可達(dá) I : 10000。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.抗GLIPR-2單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，其特征在于，保藏編號(hào)為CCTCCNO:C201221。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述抗GLIPR-2單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，其特征在于，由以下方法制備獲得 GLIPR-2蛋白免疫BALB/C小鼠，然后取BALB/C小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞在50%聚乙二醇作用下進(jìn)行融合 ，融合后進(jìn)行HAT培養(yǎng)，然后吸取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行ELISA檢測(cè)，篩選出陽性雜交瘤細(xì)胞用有限稀釋法克隆至能穩(wěn)定分泌抗GLIPR-2單克隆抗體，即獲得抗GLIPR-2單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述抗GLIPR-2單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，其特征在于，所述GLIPR-2蛋白免疫BALB/C小鼠具體為 取GLIPR-2蛋白100 μ g加等質(zhì)量福氏完全佐劑對(duì)BALB/C小鼠進(jìn)行第一次免疫注射，3周后取GLIPR-2蛋白300 μ g加等質(zhì)量福氏不完全佐劑對(duì)BALB/C小鼠進(jìn)行第二次免疫注射，7周后取GLIPR-2蛋白500 μ g對(duì)BALB/C小鼠進(jìn)行第三次免疫注射。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述抗GLIPR-2單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，其特征在于，所述HAT培養(yǎng)具體操作為 用含20%胎牛血清的HAT選擇性培養(yǎng)基與雜交瘤細(xì)胞混勻并加入到種有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中培養(yǎng)2周。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述抗GLIPR-2單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，其特征在于，所述ELISA檢測(cè)具體操作為 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液加入到GLIPR-2蛋白包被的酶標(biāo)板中于37°C孵育20min，洗滌后以工作濃度為1:2000的標(biāo)準(zhǔn)加HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG于37°C孵育20min，然后加鄰苯二胺底物顯色15min后終止反應(yīng)。
6.保藏編號(hào)為CCTCCNO :C201221的雜交瘤細(xì)胞在制備抗GLIPR-2單克隆抗體中的應(yīng)用。
7.抗GLIPR-2單克隆抗體，其特征在于，由保藏編號(hào)為CCTCCNO C201221的雜交瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了抗GLIPR-2單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗GLIPR-2單克隆抗體。本發(fā)明所述抗GLIPR-2單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞保藏編號(hào)為CCTCC NOC201221。本發(fā)明所述雜交瘤細(xì)胞能夠穩(wěn)定產(chǎn)生抗GLIPR-2單克隆抗體，且細(xì)胞染色體穩(wěn)定、抗體效價(jià)高，完全能夠應(yīng)用于GLIPR-2的分子作用機(jī)制的研究中。
文檔編號(hào)C12N5/20GK102876637SQ201210418849
公開日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月26日
發(fā)明者蒲曉允, 黃紹光, 蔣棟能, 劉飛 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院