專利名稱：一種體細(xì)胞核移植中的電融合方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞核融合方法，具體涉及一種體細(xì)胞核移植中的電融合方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞核移植(nuelea rtransfer 或 nuelear transplantation)技術(shù)也即廣為人知的動(dòng)物克隆技術(shù)。通常是通過顯微操作的方法，將供體細(xì)胞的細(xì)胞核注入預(yù)先去核的成熟卵母細(xì)胞或早期合子內(nèi)，形成一個(gè)新的核質(zhì)重組體(即重構(gòu)卵)，移入的核在受體胞質(zhì)的作用下，發(fā)生發(fā)育程序重編Oteprogramming)，使得核質(zhì)重組體與正常受精卵一樣，經(jīng)細(xì)胞分裂、分化并在母體內(nèi)發(fā)育成一個(gè)新的個(gè)體(張運(yùn)海，2005)，其獲得的個(gè)體與親本具有相同遺傳性狀。將供體細(xì)胞的細(xì)胞核導(dǎo)入到卵母細(xì)胞質(zhì)中，這個(gè)過程稱之為融合。最早使用的融合方法是使用滅活的仙臺病毒(HVJ) (McGrath and Solter, 1983)介導(dǎo)細(xì)胞融合融合,獲得了成功，但是效果很不穩(wěn)定而且毒性大。Willadsen等(1986)在利用胚胎細(xì)胞克隆羊試驗(yàn)中采用的是直流電介導(dǎo)融合的方法，簡便而且高效，電融合技術(shù)也是從這個(gè)時(shí)候開始發(fā)展起來的，其原理是通過電流的刺激使緊密接觸的細(xì)胞膜磷脂雙分子層發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而形成細(xì)胞間的孔道，隨著孔道逐漸擴(kuò)大使胞質(zhì)交融在一起。目前已經(jīng)成為動(dòng)物克隆中普遍采用的融合方法。然而，由于技術(shù)操作上的差異和供體細(xì)胞類型等因素的影響導(dǎo)致融合率不穩(wěn)定，是影響克隆效率的重要因素。在現(xiàn)有技術(shù)中普遍的操作是重構(gòu)卵放入融合槽內(nèi)后，使供體細(xì)胞-受體卵細(xì)胞膜接觸面與電極平行后即施加不同參數(shù)的的直流電脈沖誘導(dǎo)融合，而沒有考慮體細(xì)胞朝向正極或負(fù)極對融合效率的影響，從而使融合效率很不穩(wěn)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種融合效率高的電融合方法。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案，一種體細(xì)胞核移植中的電融合方法，包括以下步驟SI、將恢復(fù)后的重構(gòu)卵分批轉(zhuǎn)移到融合液中平衡；S2、用融合激活液洗滌重構(gòu)卵；S3、將洗滌后的重構(gòu)卵放入裝有融合液的融合槽內(nèi)，調(diào)整供體細(xì)胞-受體卵細(xì)胞膜接觸面與電極平行并使供體細(xì)胞一端朝向電極的負(fù)極，用融合儀施加直流電脈沖誘導(dǎo)融合同時(shí)激活重構(gòu)卵；S4、將融合激活后的重構(gòu)卵用胚胎培養(yǎng)液洗滌，然后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱中，在礦物油覆蓋的胚胎培養(yǎng)液中或輔助激活液中融合；該方法在融合的過程中，將供體細(xì)胞一端朝向電極的負(fù)極，提高了融合效率。所述融合激活液中含有含有濃度為O. 2 W O. 5mmol/L甘露醇、濃度為O. 05 ^ O. 2mmol/L CaCl2 · 2H20、濃度為 0· 05 …O. 2mmol/L MgCl2 · 6H20、濃度為0. 5 ^ 2mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸、濃度為O. 01%聚乙烯醇(W/V)。所述步驟SI中平衡的時(shí)間為1-5分鐘。所述步驟SI中每批放入裝有融合液的融合槽內(nèi)的重構(gòu)卵的數(shù)量為5-8個(gè)。所述步驟S3中融合激活參數(shù)電場強(qiáng)度為80-100v/mm，脈沖時(shí)間為80-100 μ S，實(shí)施2-3次電脈沖。
所述步驟S4中培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度為38. 5°〇或39°〇。所述步驟S4中培養(yǎng)箱內(nèi)的C02的飽和度為5%。本發(fā)明的有益效果，采用本融合方法能顯著提高融合效率。
具體實(shí)施例方式將供體細(xì)胞的細(xì)胞核注入到去核的卵母細(xì)胞以后形成重構(gòu)卵，因?yàn)檫@個(gè)過程對卵母細(xì)胞是一個(gè)傷害的過程，需放置于培養(yǎng)箱內(nèi)，待卵母細(xì)胞胞質(zhì)恢復(fù)30min后利于后面的融合操作，即恢復(fù)過程。每批將5-8個(gè)恢復(fù)后的重構(gòu)卵轉(zhuǎn)移到融合液中平衡2min，當(dāng)換一種液體時(shí)，都需預(yù)先放入相應(yīng)的液體中，相當(dāng)于一個(gè)適應(yīng)的過程，即平衡。用融合激活液洗滌3遍，再將洗滌后的重構(gòu)卵放入已經(jīng)鋪滿融合液的融合槽內(nèi)，用拉制的很細(xì)的實(shí)心玻璃針撥動(dòng)重組卵，使供體細(xì)胞-受體卵細(xì)胞膜接觸面與電極平行同時(shí)使供體細(xì)胞一端都朝向電極的負(fù)極，用BLS-150B融合儀(匈牙利)施加不同融合參數(shù)的的直流電脈沖誘導(dǎo)融合同時(shí)激活，其中融合激活參數(shù)為電場強(qiáng)度為80-100v/mm，電脈沖時(shí)間為80-100 μ s，實(shí)施2-3次電脈沖。接著將重構(gòu)卵用培養(yǎng)液洗滌3遍，立即將洗滌后的重構(gòu)卵轉(zhuǎn)入礦物油覆蓋的胚胎培養(yǎng)液中或輔助激活液中，放置入38. 5°C或39°C，5%C02飽和度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4h后在體視顯微鏡下判定融合。其中融合激活液中含有含有濃度為O. 2 ^ O. 5mmol/L 的甘露醇(Mannitol )、濃度為 O. 05 ^ O. 2mmol/L 的 CaCl2 · 2H20、濃度為O. 05 O. 2mmol/L 的Mg Cl2 ·6Η20、濃度為 O. 5 …2mmol/L 的 4-輕乙基喊嚷乙橫酸(HEPES)、濃度為O. 01% (W/V)的聚乙烯醇(PVA)。經(jīng)多次試驗(yàn)，得到如表I的結(jié)果表I、融合時(shí)體細(xì)胞朝向?qū)艘浦残实挠绊?br> 權(quán)利要求
1.一種體細(xì)胞核移植中的電融合方法，其特征在于，包括以下步驟 51、將恢復(fù)好的重構(gòu)卵分批轉(zhuǎn)移到融合激活液中平衡； 52、用融合激活液洗滌重構(gòu)卵； 53、將洗滌后的重構(gòu)卵放入裝有融合激活液的融合槽內(nèi)，調(diào)整供體細(xì)胞-受體卵細(xì)胞膜接觸面使之與電極平行并使供體細(xì)胞一端都朝向電極的負(fù)極，用融合儀施加直流電脈沖誘導(dǎo)融合同時(shí)激活重構(gòu)卵； 54、將融合激活后的重構(gòu)卵用胚胎培養(yǎng)液洗滌，然后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱中，在礦物油覆蓋的胚胎培養(yǎng)液中或輔助激活液中融合。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的體細(xì)胞核移植中的電融合方法，其特征在于，所述融合激活液中含有含有濃度為O. 2 μ O. 5mmol/L甘露醇、濃度為O. 05 ^ O. 2mmol/L CaCl2 · 2H20、濃度為O. 05 ^ O. 2mmol/L MgCl2 · 6H20、濃度為O. 5 ^ 2mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸、濃度為O. 01%聚乙烯醇(W/V)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的體細(xì)胞核移植中的電融合方法，其特征在于，所述步驟SI中平衡的時(shí)間為1-5分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的體細(xì)胞核移植中的電融合方法，其特征在于，所述步驟SI中每批移入融合液平衡的重構(gòu)卵的數(shù)量為5-8個(gè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的體細(xì)胞核移植中的電融合方法，其特征在于，所述步驟S3中融合激活參數(shù)電場強(qiáng)度為80-100v/mm，脈沖時(shí)間為80-100 μ S，實(shí)施2_3次電脈沖。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的體細(xì)胞核移植中的電融合方法，其特征在于，所述步驟S4中培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度為38. 5°〇或39°〇。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的體細(xì)胞核移植中的電融合方法，其特征在于，所述步驟S4中培養(yǎng)箱內(nèi)的C02的飽和度為5%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種體細(xì)胞核移植中的電融合方法，包括以下步驟S1、將恢復(fù)后的重構(gòu)卵分批轉(zhuǎn)移到融合液中平衡；S2、用融合激活液洗滌重構(gòu)卵；S3、將洗滌后的重構(gòu)卵放入裝有融合液的融合槽內(nèi)，調(diào)整供體細(xì)胞-受體卵細(xì)胞膜接觸面與電極平行并使供體細(xì)胞一端朝向電極的負(fù)極，用融合儀施加直流電脈沖誘導(dǎo)融合同時(shí)激活重構(gòu)卵；S4、將融合激活后的重構(gòu)卵用胚胎培養(yǎng)液洗滌，然后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱中，在礦物油覆蓋的胚胎培養(yǎng)液中或輔助激活液中融合；該方法在融合的過程中，將供體細(xì)胞一端朝向電極的負(fù)極，提高了融合效率。
文檔編號C12N15/873GK102876719SQ20121041970
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月27日
發(fā)明者吳珍芳, 周榮, 石俊松 申請人:廣東溫氏食品集團(tuán)有限公司