專利名稱：一種用甜菊苷制備甜菊雙糖苷的方法
一種用甜菊苷制備甜菊雙糖苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于有機(jī)化合物生物合成技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種利用填充床酶促水解甜菊苷制備甜菊雙糖苷的方法。
背景技術(shù)：
甜菊糖是從甜葉菊(Stevia rebaudiana)葉子中提取的多種雙職糖苷的混合物，是一種天然強(qiáng)力甜味劑，其主要成分是甜菊苷(Stevioside, St)、萊鮑迪苷A(RebaudiosideA, RA)，其中萊鮑迪苷A甜味純正，而甜菊苷有一定的后苦澀味，目前大量研究主要用酶促轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)改變甜菊苷結(jié)構(gòu)以改善其甜味特性。此外有研究表明，通過酶法水解可以將甜菊苷轉(zhuǎn)化成甜味特性不好，但是具有一定生理活性的甜菊雙糖苷，而且甜菊雙糖苷可以作為中間產(chǎn)物進(jìn)一步衍生化成其他生理活性更好的物質(zhì)。
與甜菊苷相比，甜菊雙糖苷在19位少一個(gè)葡萄糖基，Wood H. B.等人在題為“The structure of the glucose moieties”( J. Org. Chem. , 20, p875_883,1955)中指出通過堿水解方法可以獲得甜菊雙糖苷，但是，這種化學(xué)法水解還可能破壞其化學(xué)結(jié)構(gòu)。與化學(xué)法水解相比，酶法水解具有反應(yīng)條件溫和、選擇性高、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。Nakano H.等人在 Bioscience, biotechnology, and biochemistry,64 (2), ρ333~340 (2000)與 Journalof Fermentation and Bioengineering, 85 (2), pl62_168 (1998)中分別描述了來源于Clavibacter michiganense 和 Flavobacterium johnsonae 的 β-葡萄糖苷酶可以將甜菊苷水解成甜菊雙糖苷，但是篩選出的兩種酶選擇性較差，而且在水解甜菊苷的同時(shí)，還會(huì)將萊鮑迪苷A水解成萊鮑迪苷B (Rebaudioside B, RB)，此外游離β -葡萄糖苷酶貯存穩(wěn)定性差，分離回收困難。為此，人們研究出一種適用的固化酶方法，例如劉虎等人在食品工業(yè)科技第4期(2011)和CN201010170786中描述了用海藻酸鈉作為包埋材料，對巨大芽孢桿菌所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行包埋固定處理，并將其固定β-葡萄糖苷酶應(yīng)用于水解甜菊苷，制備得到甜菊雙糖苷。但是，這些現(xiàn)有技術(shù)制備甜菊雙糖苷的反應(yīng)時(shí)間需要5天，其反應(yīng)時(shí)間太長，而且采用包埋方法固定的β -葡萄糖苷酶在重復(fù)使用4次后，其轉(zhuǎn)化活性只是其原活性的57. 72%，這種固定β -葡萄糖苷酶使用壽命過短。因此，本發(fā)明人在總結(jié)現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過大量的實(shí)驗(yàn)研究，終于完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容[要解決的技術(shù)問題]本發(fā)明的目的是提供一種用甜菊苷制備甜菊雙糖苷的方法。[技術(shù)方案]本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明涉及一種用甜菊苷制備甜菊雙糖苷的方法。本發(fā)明使用由諾維信公司提供的來自畢赤酵母(Picha pastoris)的β -葡萄糖苷酶，在本發(fā)明提供的使用條件下，它具有很高的選擇性，對甜葉菊提取物中的其他甜菊苷衍生物不具有水解活性。使用殼聚糖-戊二醛交聯(lián)固定化的β-葡萄糖苷酶，采用填充床式反應(yīng)裝置可以連續(xù)地將甜菊苷酶催化水解成甜菊雙糖苷，提高了該酶的熱穩(wěn)定性，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。該制備方法的步驟如下用水或磷酸鹽緩沖液溶解甜菊苷或含有甜菊苷的甜葉菊提取物得到甜菊苷溶液，所述的甜菊苷溶液在溫度30-50°C下預(yù)熱O. 5-1. O小時(shí)；然后將此預(yù)熱溶液以恒定的流速通過裝有固定化β -葡萄糖苷酶的填充柱，讓外循環(huán)水通過填充柱夾套，以便將其反應(yīng)溫度控制在30-50°C，所述預(yù)熱溶液與所述填充柱的體積比是1-6 ;用高效液相色譜檢測從所述填充柱底部流出的溶液并用峰面積歸一化法計(jì)算各組分含量，待甜菊苷轉(zhuǎn)化率不再升高時(shí)，開始收集并合并流出液，然后進(jìn)行蒸發(fā)濃縮，所得到的粗甜菊雙糖苷經(jīng)過重結(jié)晶后純度達(dá)到98%以上。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述磷酸鹽緩沖液是由KH2PO4與K2HPO4組成的 pH值為5. 7-8. O的O. 01-0. 2M磷酸鹽緩沖液。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述甜菊苷溶液的甜菊苷濃度是2-20mg/mL。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的甜菊苷溶液以速度l-6mL/h通過所述的填充柱。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的粗甜菊雙糖苷在無水甲醇或乙醇中在室溫下進(jìn)行重結(jié)晶。在本發(fā)明的方法中，所述的固定化β_葡萄糖苷酶是采用下述步驟制備得到的Α、配制透明凝膠按照以g計(jì)殼聚糖重量與以mL計(jì)乙酸水溶液體積的比O. 2-0. 5 16_24，將殼聚糖溶于1-5重量％乙酸水溶液中，然后用超聲波除去該溶液中的氣泡，得到一種透明殼聚糖凝膠；B、制備殼聚糖微球把在步驟A得到的透明殼聚糖凝膠滴加到一種凝結(jié)液中，然后在溫度2_6°C下進(jìn)行硬化10-16小時(shí)，得到一種殼聚糖微球，接著用去離子水將所述微球洗滌至中性，在溫度3-5 °C下保存過夜；所述的凝結(jié)液是由8-12重量％NaOH水溶液與92_98重量％乙醇水溶液按照體積比3-5 I組成的；C、β -葡萄糖苷酶固定化按照以克計(jì)殼聚糖微球與以毫升計(jì)戊二醛水溶液的比O. 8-1. 2 20-30，將步驟B得到的殼聚糖微球加到戊二醛水溶液中，在溫度20-40°C下振蕩交聯(lián)O. 5-8. O小時(shí)，再用水洗滌除去過量的戊二醛；然后，按照每克殼聚糖微球?yàn)?000-2000U游離β -葡萄糖苷酶的比例，再加入游離β -葡萄糖苷酶，在溫度15-35°C下振蕩固定2-12小時(shí)，用水洗滌除去未被固定的游離β_葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β_葡萄糖苷酶。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的戊二醛水溶液的濃度是O. 1-5. O重量％。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的殼聚糖微球與戊二醛的交聯(lián)時(shí)間是2. 0-5. Oh0
根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的游離β_葡萄糖苷酶的固定時(shí)間是5. 0-9. Oh0下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。本發(fā)明涉及一種用甜菊苷制備甜菊雙糖苷的方法。該制備方法的步驟如下用水或磷酸鹽緩沖液將甜菊苷或含有甜菊苷的甜葉菊提取物溶解得到一種甜菊苷溶液。甜菊苷為白色或微黃色粉末，易溶于水、乙醇和甲醇，不溶于苯、醚、氯仿等有機(jī)溶齊U，其甜度約為蔗糖的200倍，略帶后澀味。甜菊苷在一般食品加工的條件下對熱、酸、堿、 鹽穩(wěn)定，在PH大于9或小于3時(shí)，長時(shí)間加熱(100°C )會(huì)使甜菊苷分解，甜味降低。甜菊苷具有非發(fā)酵性，只是少數(shù)幾種酶能使甜菊苷水解。本發(fā)明使用的甜菊苷是目前在市場上廣泛銷售的產(chǎn)品，例如湖北大仝生物化工科技有限公司、上海西寶生物科技有限公司、寧波億諾化學(xué)品有限公司銷售的產(chǎn)品。甜葉菊提取物帶有明顯的苦澀味、甜味刺激緩慢、味覺延綿。甜葉菊糖具有降血壓、強(qiáng)壯身體、治糠尿病等藥用價(jià)值，對人體沒有任何不良的影響。本發(fā)明使用的甜葉菊提取物是目前在市場上廣泛銷售的產(chǎn)品，例如陜西康威生物工程有限公司、湖南大自然制藥有限公司、珠海甜菊糖科技發(fā)展有限公司。所述磷酸鹽緩沖液是由KH2PO4與K2HPO4組成的pH值為5. 7-8. O的O. 01-0. 2M磷
酸鹽緩沖液。優(yōu)選地，所述磷酸鹽緩沖液是由KH2PO4與K2HPO4組成的pH值為6. 2-7. 5的O. 05-0. 15M磷酸鹽緩沖液。更優(yōu)選地，所述磷酸鹽緩沖液是由KH2PO4與K2HPO4組成的pH值為6. 6-7. 2的O. 08-0. 12M的磷酸鹽緩沖液。所述甜菊苷溶液的甜菊苷濃度是2-20mg/mL。在本發(fā)明中，如果所述的甜菊苷濃度小于2mg/mL,生產(chǎn)效率會(huì)顯著下降；如果所述的甜菊苷濃度高于20mg/mL,則會(huì)發(fā)生填充床堵塞現(xiàn)象；因此，甜菊苷濃度為2-20mg/mL是合適的。優(yōu)選地，所述甜菊苷溶液的甜菊苷濃度是8_12mg/mL。所述的甜菊苷溶液在搖床中在溫度30-50°C的條件下預(yù)熱O. 5-1. O小時(shí)，然后將預(yù)熱溶液以恒定的流速通過裝有固定化β -葡萄糖苷酶的填充柱，填充柱夾套內(nèi)通外循環(huán)水控制反應(yīng)溫度在30-50°C，所述預(yù)熱溶液與所述填充床的體積比是1-6。優(yōu)選地，所述的甜菊苷溶液在溫度38_42°C的條件下預(yù)熱O. 6-0. 8小時(shí)。所述的甜菊苷溶液以速度l-6mL/h通過所述的填充柱。優(yōu)選地，所述的甜菊苷溶液以速度2-4mL/h通過所述的填充柱。在本發(fā)明中，如果所述預(yù)熱溶液與所述填充床的體積比小于I或者大于6，生產(chǎn)效率會(huì)顯著下降；因此，所述預(yù)熱溶液與所述填充床的體積比為1-6是合適的。優(yōu)選地，所述預(yù)熱溶液與所述填充床的體積比為2-4。所述的固定化β -葡萄糖苷酶是采用下述步驟制備得到的Α、配制透明凝膠按照以g計(jì)殼聚糖重量與以mL計(jì)乙酸水溶液體積的比O. 2-0. 5 16_24，將殼聚糖溶于1-5重量％的乙酸水溶液中，然后用超聲波除去溶液中的氣泡，得到一種透明殼聚糖凝膠。殼聚糖(chitosan)為聚葡萄糖胺(1_4) _2_氨基_B_D葡萄糖,這種天然高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等優(yōu)良性能被各行各業(yè)廣泛關(guān)注，在醫(yī)藥、食品、化工、化妝品、水處理、金屬提取及回收、生化和生物醫(yī)學(xué)工程等諸多領(lǐng)域的應(yīng)用研究取得了重大進(jìn)展優(yōu)選地，以重量計(jì)的殼聚糖與以體積計(jì)的乙酸水溶液的比為O. 2-0. 4 18-22。更優(yōu)選地，以重量計(jì)的殼聚糖與以體積計(jì)的乙酸水溶液的比為O. 3 20。乙酸水溶液濃度優(yōu)選地是2-4重量％。 本發(fā)明使用的超聲波設(shè)備是目前市場上銷售的普通實(shí)驗(yàn)設(shè)備，沒有特別限制。B、制備殼聚糖微球把經(jīng)步驟A得到的透明殼聚糖凝膠用滴管滴加到一種凝結(jié)液中，然后在溫度2-6°C下硬化10-16小時(shí)，得到一種殼聚糖微球，接著用去離子水洗滌所述微球至中性，在溫度3-5 °C下保存過夜；所述的凝結(jié)液是由8-12重量％NaOH水溶液與92_98重量％乙醇水溶液按照體積比3-5 I組成的。優(yōu)選地，所述的凝結(jié)液是由10重量％NaOH水溶液與95重量％乙醇水溶液按照體積比4 I組成的。所述的透明殼聚糖凝膠在凝結(jié)液中硬化時(shí)間優(yōu)選地為12-14小時(shí)。C、β-葡萄糖苷酶固定化按照以克計(jì)殼聚糖微球與以毫升計(jì)戊二醛水溶液的比O. 8-1. 2 20-30，將步驟B得到的殼聚糖微球加到戊二醛水溶液中，在溫度20-40°C下振蕩交聯(lián)O. 5-8小時(shí)，再用水洗滌除去過量的戊二醛；然后，按照每克殼聚糖微球?yàn)?000-2000U游離β -葡萄糖苷酶，再加入游離β-葡萄糖苷酶，在溫度15-35°C下振蕩固定2-12小時(shí)，用水洗滌除去未被固定的游離葡萄糖苷酶，得到所述的固定化葡萄糖苷酶。。本發(fā)明使用的游離β -葡萄糖苷酶是由諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司提供的來自畢赤酵母(Picha pastoris)的β _葡萄糖苷酶。優(yōu)選地，按照以克計(jì)殼聚糖微球與以毫升計(jì)戊二醛水溶液的比為1.0 25。所述戊二醛水溶液的濃度是O. 1-5. O重量％。如果所述戊二醛水溶液的濃度小于O. I重量％或高于5. O重量％，該交聯(lián)反應(yīng)會(huì)不充分或過度進(jìn)行，對固定化酶的比活和回收率有不良影響；因此，所述戊二醛水溶液濃度O. 1-5. O重量％是合適的，優(yōu)選地是1-4重量％，更優(yōu)選地是I. 5-3. O重量％。在本發(fā)明中，如果殼聚糖微球與戊二醛進(jìn)行交聯(lián)的溫度低于20°C，則交聯(lián)反應(yīng)會(huì)不充分；如果殼聚糖微球與戊二醛進(jìn)行交聯(lián)的溫度高于40°C，則會(huì)過度交聯(lián)；因此，殼聚糖微球與戊二醛進(jìn)行交聯(lián)的溫度為20-40°C是合適的，優(yōu)選地是25-35°C，更優(yōu)選地是28-32。。。所述的殼聚糖微球與戊二醛在溫度20_40°C下交聯(lián)時(shí)間若不到O. 5小時(shí)，則交聯(lián)反應(yīng)會(huì)不充分；如果交聯(lián)時(shí)間超過8小時(shí)，則只是浪費(fèi)時(shí)間；因此在溫度20-40°C下交聯(lián)時(shí)間O. 5-8. O小時(shí)是合適的，優(yōu)選地是2. 0-5. Oh,更優(yōu)選地是3. 0-4. Oh。
在本發(fā)明中，如果所述游離β_葡萄糖苷酶的固定溫度低于15°C或高于35°C，則固定不充分或者不均勻；因此，所述的固定溫度為15-35°C是合適的，優(yōu)選地是28-32°C，更優(yōu)選地是30°C。在本發(fā)明中，如果所述游離葡萄糖苷酶在溫度15_35°C下固定時(shí)間低于2小時(shí)，則固定不充分；如果所述游離β_葡萄糖苷酶的固定時(shí)間多于12小時(shí)，則只是浪費(fèi)時(shí)間；因此，所述游離葡萄糖苷酶在溫度15-35°C下固定時(shí)間為2-12小時(shí)是合適的，優(yōu)選地是5-9h，更優(yōu)選地是6-8h。本發(fā)明裝有固定化β -葡萄糖苷酶的填充柱裝置見附圖I。該反應(yīng)裝置由恒溫水浴槽I、蠕動(dòng)泵2、填充柱3、循環(huán)水泵4與結(jié)晶槽5組成。反應(yīng)原料混合物在恒溫水浴槽I 中預(yù)熱后通過蠕動(dòng)泵2送到填充柱3的上端，所述反應(yīng)原料混合物通過裝有固定化β -葡萄糖苷酶的填充柱3，所述原料在其中進(jìn)行酶解反應(yīng)，從所述填充柱底部流出的溶液采用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行檢測，待甜菊苷轉(zhuǎn)化率不再升高時(shí)，開始收集并合并流出液。本發(fā)明采用的高效液相色譜法是一種常規(guī)的高效液相色譜分析方法。本發(fā)明使用的高效液相色譜儀是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如Waters、Agilent、島津等品牌的高效液相色譜儀。高效液相色譜分析在下述條件下進(jìn)行高效液相色譜柱為Lichospher C18柱，它是美國Waters公司銷售的產(chǎn)品，250mm X 4. 6mm,填料粒徑 5 μ m,流動(dòng)相為乙臆:水=30:70 (Omin) -47. 5:52. 5 (IOmin) -30:70(20min) (v/v);流速 I. OmL/min;柱溫 40。。;檢測波長 210nm,進(jìn)樣量 10 μ L。用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行檢測，確定甜菊苷轉(zhuǎn)化率不再升高時(shí)，合并并蒸發(fā)濃縮流出液，得到粗甜菊雙糖苷。本發(fā)明進(jìn)行蒸發(fā)濃縮的條件為普通條件，沒有限制。考慮到產(chǎn)品色澤和操作經(jīng)濟(jì)性，推薦選擇在溫度88-92°C與真空O. 002-0. 008MPa下進(jìn)行蒸發(fā)。本發(fā)明使用的蒸發(fā)濃縮設(shè)備是目前市場上銷售的普通產(chǎn)品，沒有特殊要求，例如杭州圣亞機(jī)械有限公司、杭州惠合機(jī)械設(shè)備有限公司、浙江森力機(jī)械科技有限公司銷售的產(chǎn)品。得到的粗甜菊雙糖苷一般純度在95重量％以上，但還需要進(jìn)行重結(jié)晶，以便得到的結(jié)晶產(chǎn)物為純度98重量％以上的甜菊雙糖苷。所述的重結(jié)晶是讓所述的粗甜菊雙糖苷在無水甲醇或乙醇中在室溫下再次進(jìn)行結(jié)晶。為了加快或促進(jìn)甜菊雙糖苷晶體生長，在重結(jié)晶時(shí)可以添加甜菊雙糖苷晶種，甜菊雙糖苷晶種的添加量是以所述的粗甜菊雙糖苷重量計(jì)5-8%。本發(fā)明固定化β -葡萄糖苷酶連續(xù)水解甜菊苷的穩(wěn)定性試驗(yàn)見附圖2，該圖顯示，在反應(yīng)溫度40°C、甜菊苷濃度5mg/mL、流速3. OmL/h.pH 7. O、加酶量3195U的條件下，甜菊苷轉(zhuǎn)化率和甜菊雙糖苷生產(chǎn)強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。本發(fā)明采用殼聚糖-戊二醛交聯(lián)固定化可以大大提高酶的熱穩(wěn)定性，在溫度40°C下連續(xù)使用5次后，其甜菊苷的轉(zhuǎn)化率仍達(dá)到84%以上。本發(fā)明只是需要12h就可以將甜菊苷完全水解，因此生產(chǎn)周期大大縮短。采用本發(fā)明的填充柱制備甜菊雙糖苷的生產(chǎn)效率高，易于實(shí)現(xiàn)甜菊雙糖苷的連續(xù)化生產(chǎn)，具有非常廣泛的應(yīng)用前景。[有益效果]本發(fā)明具有下述有益效果現(xiàn)有技術(shù)制備甜菊雙糖苷的反應(yīng)時(shí)間需要5天，其β -葡萄糖苷酶在溫度40°C下重復(fù)使用4次后其轉(zhuǎn)化活性只是其原活性的57. 72%。本發(fā)明使用固定化β_葡萄糖苷酶制備甜菊雙糖苷的反應(yīng)時(shí)間只是需要12h，并且在溫度40°C下連續(xù)使用5次后其甜菊苷的轉(zhuǎn)化率仍達(dá)到84%以上。因此，本發(fā)明方法的生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)效率高，易于實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)，具有非常廣泛的應(yīng)用前景。

圖I表示本發(fā)明制備甜菊雙糖苷時(shí)使用的固定化β -葡萄糖苷酶填充柱裝置。圖2是本發(fā)明固定化β -葡萄糖苷酶連續(xù)水解甜菊苷的穩(wěn)定性試驗(yàn)。
具體實(shí)施方式通過下述實(shí)施例將能夠更好地理解本發(fā)明。實(shí)施例I :制備甜菊雙糖苷該實(shí)施例的實(shí)施步驟如下首先制備固定化葡萄糖苷酶。Α、配制透明凝膠按照以g計(jì)殼聚糖重量與以mL計(jì)乙酸水溶液體積的比O. 3 20，將殼聚糖溶于2重量％乙酸水溶液中，然后用超聲波除去氣泡，得到一種透明殼聚糖凝膠。B、制備殼聚糖微球?qū)⒉襟EA得到的透明殼聚糖凝膠加到一種凝結(jié)液中，然后在溫度4°C下進(jìn)行硬化14小時(shí)，接著用去離子水洗滌至中性，在溫度4°C下保存過夜，得到一種殼聚糖微球。所述的凝結(jié)液是由10重量％NaOH水溶液與95重量％乙醇水溶液按照體積比4
I組成的。C、β -葡萄糖苷酶固定化按照以g計(jì)殼聚糖微球重量與以mL計(jì)戊二醛水溶液體積的比I. O 25，將步驟B得到的殼聚糖微球加到3重量％戊二醛水溶液(pH 6. 5 )中，在溫度280C下振蕩交聯(lián)5小時(shí)，再用水洗滌除去過量的戊二醛；然后，按照每克殼聚糖微球配比1700U游離β-葡萄糖苷酶,加入諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司提供的來自畢赤酵母(Picha pastoris)的β-葡萄糖苷酶，在溫度20°C下振蕩固定8小時(shí)，用水洗滌除去未被固定的游離β_葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β_葡萄糖苷酶，其比活性為1500U/g。然后，制備甜菊雙糖苷。用水將湖北大仝生物化工科技有限公司銷售的甜菊苷溶解，得到濃度為8mg/mL的甜菊苷溶液，所述的甜菊苷溶液在溫度42°C下預(yù)熱O. 6小時(shí)，然后將預(yù)熱溶液以2mL/h的流速通過裝有前面制備的固定化β_葡萄糖苷酶的填充柱，填充柱夾套水溫維持在42°C，所述預(yù)熱溶液與所述填充床的體積比是4 ;用高效液相色譜檢測從所述填充柱底部流出的溶液，5小時(shí)后由色譜圖峰面積歸一化法計(jì)算得知甜菊苷轉(zhuǎn)化率已經(jīng)恒定，然后收集流出液在溫度90°C與真空度O. 004MPa下濃縮，得到粗甜菊雙糖苷。粗制甜菊雙糖苷再在無水甲醇中于室溫下進(jìn)行重結(jié)晶，得到的結(jié)晶產(chǎn)物中甜菊雙糖苷的純度(HPLC)為99. O重量％。高效液相色譜在下述條件下檢測甜菊雙糖苷高效液相色譜儀Waters 2965
測定條件Lichospher C18柱，它是美國Waters公司銷售的產(chǎn)品，250mm X 4. 6mm,填料粒徑 5 μ m,流動(dòng)相為乙臆:水=30:70 (Omin) -47. 5:52. 5 (IOmin) -30:70(20min) (v/v);流速 I. OmL/min;柱溫 40。。;檢測波長 210nm,進(jìn)樣量 10 μ L。實(shí)施例2 :制備甜菊雙糖苷該實(shí)施例的實(shí)施步驟如下首先制備固定化葡萄糖苷酶。Α、配制透明凝膠 按照以g計(jì)殼聚糖微球重量與以mL計(jì)戊二醛水溶液體積的比O. 2 24，將殼聚糖溶于5重量％乙酸水溶液中，然后采用超聲波方法除去氣泡，得到一種透明殼聚糖凝膠。B、制備殼聚糖微球?qū)⒉襟EA得到的透明殼聚糖凝膠加到一種凝結(jié)液中，然后在溫度2°C下進(jìn)行硬化16小時(shí)，接著用去離子水洗滌至中性，在溫度3°C下保存過夜，得到一種殼聚糖微球。所述的凝結(jié)液是由8重量％NaOH水溶液與98重量％乙醇水溶液按照體積比3
I組成的。C、β-葡萄糖苷酶固定化按照以g計(jì)殼聚糖微球重量與以mL計(jì)戊二醛水溶液體積的比O. 8 30，將步驟B得到的殼聚糖微球加到5重量％戊二醛水溶液(pH 6. 6)中，在溫度40°C下振蕩交聯(lián)O. 5小時(shí)，再用水洗滌除去過量的戊二醛；然后，按照每克殼聚糖微球配比2000U游離β -葡萄糖苷酶，加入諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司提供的來自畢赤酵母(Picha pastoris)的β_葡萄糖苷酶，在溫度15°C下振蕩固定12小時(shí)，用水洗滌除去未被固定的游離β-葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β_葡萄糖苷酶，其比活性為1750U/g。其次，制備甜菊雙糖苷用O. IM KH2PO4與O. IM K2HPO4組成的pH值為7. O的磷酸鹽緩沖液，將陜西康威生物工程有限公司銷售的含有甜菊苷的甜葉菊提取物溶解，得到濃度為20mg/mL的甜菊苷溶液，所述的甜菊苷溶液在溫度30°C下預(yù)熱I. O小時(shí)，然后將預(yù)熱溶液以lmL/h的流速通過裝有前面制備的固定化β_葡萄糖苷酶的填充柱，填充柱夾套水溫維持在30°C，所述預(yù)熱溶液與所述填充床的體積比是I ;用高效液相色譜在實(shí)施例I描述的條件下檢測從所述填充柱底部流出的溶液，10小時(shí)后由色譜圖峰面積歸一化法計(jì)算得知甜菊苷轉(zhuǎn)化率已經(jīng)恒定，然后收集流出液并在溫度88°C與真空O. 002MPa下濃縮，得到粗甜菊雙糖苷。粗制甜菊雙糖苷再在無水乙醇中于室溫下進(jìn)行重結(jié)晶，得到的結(jié)晶產(chǎn)物中甜菊雙糖苷的純度(HPLC)為99. 4重量％。實(shí)施例3 :制備甜菊雙糖苷該實(shí)施例的實(shí)施步驟如下首先制備固定化葡萄糖苷酶。Α、配制透明凝膠按照以g計(jì)殼聚糖微球重量與以mL計(jì)戊二醛水溶液體積的比O. 5 16，將殼聚糖溶于I重量％乙酸水溶液中，然后采用超聲波方法除去氣泡，得到一種透明殼聚糖凝膠。B、制備殼聚糖微球?qū)⒉襟EA得到的透明殼聚糖凝膠加到一種凝結(jié)液中，然后在溫度6°C下進(jìn)行硬化10小時(shí)，接著用去離子水洗滌至中性，在溫度3°c下保存過夜，得到一種殼聚糖微球。所述的凝結(jié)液是由12重量％NaOH水溶液與92重量％乙醇水溶液按照體積比5
I組成的。C、β-葡萄糖苷酶固定化按照以g計(jì)殼聚糖微球重量與以mL計(jì)戊二醛水溶液體積的比1.2 20，將步驟B得到的殼聚糖微球加到O. I重量％戊二醛水溶液(pH 6. 2)中，在溫度20°C下振蕩交聯(lián)8小時(shí)，再用水洗滌除去過量的戊二醛；然后，按照每克殼聚糖微球配比1000U游離β-葡萄糖苷酶，再加入諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司提供的來自畢赤酵母(Picha pastoris)的β -葡萄糖苷酶，在溫度25°C下振蕩固定2小時(shí)，用水洗滌除去未被固定的游離β -葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β_葡萄糖苷酶，其比活性為900U/g。然后，制備甜菊雙糖苷。 用由O. OlM KH2PO4與O. OlM K2HPO4組成的pH值為8. O的磷酸鹽緩沖液溶解，將上海西寶生物科技有限公司銷售的含有甜菊苷的甜葉菊提取物溶解，得到一種甜菊苷濃度為2mg/mL的甜菊苷溶液，所述的甜菊苷溶液在溫度50°C下預(yù)熱O. 5小時(shí)，然后將預(yù)熱溶液以6mL/h的流速通過裝有前面制備的固定化β -葡萄糖苷酶的填充柱，填充柱夾套水溫維持在50°C，所述預(yù)熱溶液與所述填充床的體積比是6 ;用高效液相色譜在實(shí)施例I描述的條件下檢測從所述填充柱底部流出的溶液，3小時(shí)后由色譜圖峰面積歸一化法計(jì)算得知甜菊苷轉(zhuǎn)化率已經(jīng)恒定，然后收集流出液并在溫度91°C與真空O. OlMPa下濃縮流出液，得到粗甜菊雙糖苷。這種粗甜菊雙糖苷再在無水甲醇中于室溫下進(jìn)行重結(jié)晶，得到的結(jié)晶產(chǎn)物中甜菊雙糖苷的純度(HPLC)為99. 2重量％。實(shí)施例4 :制備甜菊雙糖苷該實(shí)施例的實(shí)施步驟如下首先制備固定化葡萄糖苷酶。Α、配制透明凝膠按照以g計(jì)殼聚糖微球重量與以mL計(jì)戊二醛水溶液體積的比O. 4 18，將殼聚糖溶于4重量％乙酸水溶液中，然后采用超聲波方法除去氣泡，得到一種透明殼聚糖凝膠。B、制備殼聚糖微球?qū)⒉襟EA得到的透明殼聚糖凝膠加到一種凝結(jié)液中，然后在溫度5°C下進(jìn)行硬化12小時(shí)，接著用去離子水洗滌至中性，在溫度5°C下保存過夜，得到一種殼聚糖微球。所述的凝結(jié)液是由9重量％NaOH水溶液與96重量％乙醇水溶液按照體積比3
I組成的。C、β-葡萄糖苷酶固定化按照以g計(jì)殼聚糖微球重量與以mL計(jì)戊二醛水溶液體積的比I. O 28，將步驟B得到的殼聚糖微球加到I. O重量％戊二醛水溶液(pH 6.6)中，在溫度36°C下振蕩交聯(lián)2.0小時(shí)，再用水洗滌除去過量的戊二醛；然后，按照每克殼聚糖微球配比1200U游離β-葡萄糖苷酶，再加入諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司提供的來自畢赤酵母(Picha pastoris)的β-葡萄糖苷酶，在溫度18°C下振蕩固定5小時(shí)，用水洗滌除去未被固定的游離β-葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β_葡萄糖苷酶，其比活性為1080U/g。其次，制備甜菊雙糖苷
用O. 2M KH2PO4與O. 2M K2HPO4組成的pH值為5. 7的磷酸鹽緩沖液，將陜西康威生物工程有限公司銷售的含有甜菊苷的甜葉菊提取物溶解，得到一種甜菊苷濃度為16mg/mL的甜菊苷溶液，所述的甜菊苷溶液在溫度36°C下預(yù)熱O. 8小時(shí)，然后將預(yù)熱溶液以4mL/h的流速通過裝有前面制備的固定化β -葡萄糖苷酶的填充柱，所述預(yù)熱溶液與所述填充床的體積比是2 ;用高效液相色譜在實(shí)施例I描述的條件下檢測從所述填充柱底部流出的溶液，8小時(shí)后由色譜圖峰面積歸一化法計(jì)算得知甜菊苷轉(zhuǎn)化率已經(jīng)恒定，然后收集流出液并在溫度92°C與真空O. 006MPa下濃縮流出液50min，得到粗甜菊雙糖苷。這種粗甜菊雙糖苷再在無水乙醇中在室溫下進(jìn)行重結(jié)晶，得到的結(jié)晶產(chǎn)物中甜菊雙糖苷的純度(HPLC)為99. 8重量％。實(shí)施例5 :制備甜菊雙糖苷該實(shí)施例的實(shí)施步驟如下首先制備固定化葡萄糖苷酶。
Α、配制透明凝膠按照以g計(jì)殼聚糖微球重量與以mL計(jì)戊二醛水溶液體積的比O. 2 16，將殼聚糖溶于3. 5重量％乙酸水溶液中，然后用超聲波除去氣泡，得到一種透明殼聚糖凝膠。B、制備殼聚糖微球?qū)⒉襟EA得到的透明殼聚糖凝膠加到一種凝結(jié)液中，然后在溫度6°C下硬化11小時(shí)，接著用去離子水洗滌至中性，在溫度:TC下保存過夜，得到一種殼聚糖微球。所述的凝結(jié)液是由8重量％NaOH水溶液與98重量％乙醇水溶液按照體積比3
I組成的。C、β-葡萄糖苷酶固定化按照以g計(jì)殼聚糖微球重量與以mL計(jì)戊二醛水溶液體積的比O. 8 28，將步驟B得到的殼聚糖微球加到O. 3重量％戊二醛水溶液(pH 6. 5)中，在溫度25°C下振蕩交聯(lián)I小時(shí)，再用水洗滌除去過量的戊二醛；然后，按照每克殼聚糖微球配比1300U游離β -葡萄糖苷酶，加入諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司提供的來自畢赤酵母(Picha pastoris)的β -葡萄糖苷酶，在溫度35°C下振蕩固定6小時(shí)，用水洗滌除去未被固定的游離β -葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β_葡萄糖苷酶，其比活性為1150U/g。然后，制備甜菊雙糖苷。用O. 08M KH2PO4與O. 08M K2HPO4組成的pH值為6. O的磷酸鹽緩沖液，將陜西康威生物工程有限公司銷售的含有甜菊苷的甜葉菊提取物溶解，得到濃度為4mg/mL的甜菊苷溶液，所述的甜菊苷溶液在溫度45°C下預(yù)熱O. 7小時(shí)，然后將預(yù)熱溶液以3mL/h的流速通過裝有前面制備的固定化β_葡萄糖苷酶的填充柱，填充柱夾套水溫維持在45°C，所述預(yù)熱溶液與所述填充床的體積比是5 ;用高效液相色譜在實(shí)施例I描述的條件下檢測從所述填充柱底部流出的溶液，5小時(shí)后由色譜圖峰面積歸一化法計(jì)算得知甜菊苷轉(zhuǎn)化率已經(jīng)恒定，然后收集流出液并在溫度88°C與真空度O. 002MPa下濃縮流出液，得到粗甜菊雙糖苷。粗制甜菊雙糖苷再在無水甲醇中于室溫下進(jìn)行重結(jié)晶，得到的結(jié)晶產(chǎn)物中甜菊雙糖苷的純度(HPLC)為 99. 2 重量 ％。實(shí)施例6 :制備甜菊雙糖苷該實(shí)施例的實(shí)施步驟如下
首先制備固定化β_葡萄糖苷酶。Α、配制透明凝膠按照以g計(jì)殼聚糖微球重量與以mL計(jì)戊二醛水溶液體積的比O. 5 24，將殼聚糖溶于2. 5重量％乙酸水溶液中，然后用超聲波除去氣泡，得到一種透明殼聚糖凝膠。B、制備殼聚糖微球?qū)⒉襟EA得到的透明殼聚糖凝膠加到一種凝結(jié)液中，然后在溫度4°C下硬化15小時(shí)，接著用去離子水洗滌至中性，在溫度5°C下保存過夜，得到一種殼聚糖微球。所述的凝結(jié)液是由12重量％NaOH水溶液與92重量％乙醇水溶液按照體積比5
I組成的。 C、β-葡萄糖苷酶固定化按照以g計(jì)殼聚糖微球重量與以mL計(jì)戊二醛水溶液體積的比O. 8 20，將步驟B得到的殼聚糖微球加到4. 5重量％戊二醛水溶液(pH 6. 5)中，在溫度35°C下振蕩交聯(lián)7小時(shí)，再用水洗滌除去過量的戊二醛；然后，按照每克殼聚糖微球配比1500U游離β-葡萄糖苷酶，加入諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司提供的來自畢赤酵母(Picha pastoris)的β -葡萄糖苷酶，在溫度30°C下振蕩固定4小時(shí)，用水洗滌除去未被固定的游離β -葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β_葡萄糖苷酶，其比活性為1320U/g。然后，制備甜菊雙糖苷。用O. 17M KH2PO4與O. 17M K2HPO4組成的pH值為6. 5的磷酸鹽緩沖液，將上海西寶生物科技有限公司銷售的含有甜菊苷的甜葉菊提取物溶解，得到濃度為10mg/mL的甜菊苷溶液，所述的甜菊苷溶液在溫度35°C下預(yù)熱O. 9小時(shí)，然后將預(yù)熱溶液以5mL/h的流速通過裝有前面制備的固定化β_葡萄糖苷酶的填充柱，填充柱夾套水溫維持在35°C，所述預(yù)熱溶液與所述填充床的體積比是3 ;用高效液相色譜在實(shí)施例I描述的條件下檢測從所述填充柱底部流出的溶液，8小時(shí)后由色譜圖峰面積歸一化法計(jì)算得知甜菊苷轉(zhuǎn)化率已經(jīng)恒定，然后收集流出液并在溫度92°C與真空度O. 008MPa下濃縮流出液，得到粗甜菊雙糖苷。粗制甜菊雙糖苷再在無水乙醇中于室溫下進(jìn)行重結(jié)晶，得到的結(jié)晶產(chǎn)物中甜菊雙糖苷的純度(HPLC)為 99. 4 重量 ％。實(shí)施例7 :制備甜菊雙糖苷該實(shí)施例的實(shí)施步驟如下首先制備固定化葡萄糖苷酶。Α、配制透明凝膠按照以g計(jì)殼聚糖微球重量與以mL計(jì)戊二醛水溶液體積的比O. 3 18，將殼聚糖溶于4. 5重量％乙酸水溶液中，然后用超聲波除去氣泡，得到一種透明殼聚糖凝膠。B、制備殼聚糖微球?qū)⒉襟EA得到的透明殼聚糖凝膠加到一種凝結(jié)液中，然后在溫度3°C下硬化13小時(shí)，接著用去離子水洗滌至中性，在溫度4°C下保存過夜，得到一種殼聚糖微球。所述的凝結(jié)液是由10重量％NaOH水溶液與95重量％乙醇水溶液按照體積比4
I組成的。C、β-葡萄糖苷酶固定化按照以g計(jì)殼聚糖微球重量與以mL計(jì)戊二醛水溶液體積的比1.2 30，將步驟B得到的殼聚糖微球加到3. 5重量％戊二醛水溶液(pH 6. 5)中，在溫度30°C下振蕩交聯(lián)3小時(shí)，再用水洗滌除去過量的戊二醛；然后，按照每克殼聚糖微球配比1600U游離β-葡萄糖苷酶，加入諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司提供的來自畢赤酵母(Picha pastoris)的β_葡萄糖苷酶，在溫度28°C下振蕩固定10小時(shí)，用水洗滌除去未被固定的游離β-葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β_葡萄糖苷酶，其比活性為1400U/g。然后，制備甜菊雙糖苷。用O. 03M KH2PO4與O. 03M K2HPO4組成的pH值為7. 5的磷酸鹽緩沖液，將陜西康威生物工程有限公司銷售的含有甜菊苷的甜葉菊提取物溶解，得到濃度為14mg/mL的甜菊苷溶液，所述的甜菊苷溶液在溫度40°C下預(yù)熱O. 8小時(shí)，然后將預(yù)熱溶液以lmL/h的流速通過裝有前面制備的固定化β_葡萄糖苷酶的填充柱，填充柱夾套水溫維持在40°C，所述預(yù)熱溶液與所述填充床的體積比是3 ;用高效液相色譜在實(shí)施例I描述的條件下檢測從所述填充柱底部流出的溶液，6. 5小時(shí)后由色譜圖峰面積歸一化法計(jì)算得知甜菊苷轉(zhuǎn)化率已經(jīng)恒定，然后收集流出液并在溫度90°C與真空度O. 005MPa下濃縮流出液，得到粗甜菊雙糖苷。 粗制甜菊雙糖苷再在無水甲醇中于室溫下進(jìn)行重結(jié)晶，得到的結(jié)晶產(chǎn)物中甜菊雙糖苷的純度(HPLC)為99. I重量％。實(shí)施例8 :制備甜菊雙糖苷該實(shí)施例的實(shí)施步驟如下首先制備固定化葡萄糖苷酶。Α、配制透明凝膠按照以g計(jì)殼聚糖微球重量與以mL計(jì)戊二醛水溶液體積的比O. 4 20，將殼聚糖溶于I. 5重量％乙酸水溶液中，然后用超聲波除去氣泡，得到一種透明殼聚糖凝膠。B、制備殼聚糖微球?qū)⒉襟EA得到的透明殼聚糖凝膠加到一種凝結(jié)液中，然后在溫度5°C下硬化12小時(shí)，接著用去離子水洗滌至中性，在溫度5°C下保存過夜，得到一種殼聚糖微球。所述的凝結(jié)液是由9重量％NaOH水溶液與94重量％乙醇水溶液按照體積比3
I組成的。C、β-葡萄糖苷酶固定化按照以g計(jì)殼聚糖微球重量與以mL計(jì)戊二醛水溶液體積的比1.0 20，將步驟B得到的殼聚糖微球加到I. 5重量％戊二醛水溶液(pH 6. 5)中，在溫度20°C下振蕩交聯(lián)8小時(shí)，再用水洗滌除去過量的戊二醛；然后，按照每克殼聚糖微球配比1800U游離β-葡萄糖苷酶，加入諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司提供的來自畢赤酵母(Picha pastoris)的β -葡萄糖苷酶，在溫度33°C下振蕩固定2小時(shí)，用水洗滌除去未被固定的游離β -葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β_葡萄糖苷酶，其比活性為1530U/g。然后，制備甜菊雙糖苷。用O. 2M KH2PO4與O. 2M K2HPO4組成的pH值為7. 2的磷酸鹽緩沖液，將上海西寶生物科技有限公司銷售的含有甜菊苷的甜葉菊提取物溶解，得到濃度為6mg/mL的甜菊苷溶液，所述的甜菊苷溶液在溫度30°C下預(yù)熱I小時(shí)，然后將預(yù)熱溶液以3mL/h的流速通過裝有前面制備的固定化β -葡萄糖苷酶的填充柱，填充柱夾套水溫維持在30°C，所述預(yù)熱溶液與所述填充床的體積比是2 ;用高效液相色譜在實(shí)施例I描述的條件下檢測從所述填充柱底部流出的溶液，4小時(shí)后由色譜圖峰面積歸一化法計(jì)算得知甜菊苷轉(zhuǎn)化率已經(jīng)恒定，然后收集流出液并在溫度89°C與真空度O. 006MPa下濃縮流出液，得到粗甜菊雙糖苷。粗制甜菊雙糖苷再在無水甲醇中于室溫下進(jìn)行重結(jié)晶，得到的結(jié)晶產(chǎn)物中甜菊雙糖苷的純度(HPLC)為99. 5重量％。實(shí)施例9 :制備甜菊雙糖苷該實(shí)施例的實(shí)施步驟如下首先制備固定化葡萄糖苷酶。Α、配制透明凝膠按照以g計(jì)殼聚糖微球重量與以mL計(jì)戊二醛水溶液體積的比O. 5 22，將殼聚糖 溶于3重量％乙酸水溶液中，然后用超聲波除去氣泡，得到一種透明殼聚糖凝膠。B、制備殼聚糖微球?qū)⒉襟EA得到的透明殼聚糖凝膠加到一種凝結(jié)液中，然后在溫度2°C下硬化16小時(shí)，接著用去離子水洗滌至中性，在溫度:TC下保存過夜，得到一種殼聚糖微球。所述的凝結(jié)液是由11重量％NaOH水溶液與93重量％乙醇水溶液按照體積比5
I組成的。C、β-葡萄糖苷酶固定化按照以g計(jì)殼聚糖微球重量與以mL計(jì)戊二醛水溶液體積的比1.0 30，將步驟B得到的殼聚糖微球加到2. 5重量％戊二醛水溶液(pH 6. 5)中，在溫度40°C下振蕩交聯(lián)5小時(shí)，再用水洗滌除去過量的戊二醛；然后，按照每克殼聚糖微球配比Iioou游離β-葡萄糖苷酶，加入諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司提供的來自畢赤酵母(Picha pastoris)的β_葡萄糖苷酶，在溫度25°C下振蕩固定12小時(shí)，用水洗滌除去未被固定的游離β-葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β -葡萄糖苷酶，其比活性為990U/g。然后，制備甜菊雙糖苷。用O. IM KH2PO4與O. IM K2HPO4組成的pH值為7. 7的磷酸鹽緩沖液，將陜西康威生物工程有限公司銷售的含有甜菊苷的甜葉菊提取物溶解，得到濃度為10mg/mL的甜菊苷溶液，所述的甜菊苷溶液在溫度50°C下預(yù)熱O. 5小時(shí)，然后將預(yù)熱溶液以2mL/h的流速通過裝有前面制備的固定化β_葡萄糖苷酶的填充柱，填充柱夾套水溫維持在50°C，所述預(yù)熱溶液與所述填充床的體積比是6 ;用高效液相色譜在實(shí)施例I描述的條件下檢測從所述填充柱底部流出的溶液，4小時(shí)后由色譜圖峰面積歸一化法計(jì)算得知甜菊苷轉(zhuǎn)化率已經(jīng)恒定，然后收集流出液并在溫度89°C與真空度O. 006MPa下濃縮流出液，得到粗甜菊雙糖苷。粗制甜菊雙糖苷再在無水甲醇中于室溫下進(jìn)行重結(jié)晶，得到的結(jié)晶產(chǎn)物中甜菊雙糖苷的純度(HPLC)為 99. 2 重量 ％。實(shí)施例10 :固定化β -葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化穩(wěn)定性試驗(yàn)該實(shí)施例的實(shí)施步驟如下首先制備固定化葡萄糖苷酶。Α、配制透明凝膠按照以g計(jì)殼聚糖微球重量與以mL計(jì)戊二醛水溶液體積的比O. 3 20，將殼聚糖溶于4重量％乙酸水溶液中，然后采用超聲波方法除去氣泡，得到一種透明殼聚糖凝膠。B、制備殼聚糖微球
把步驟A得到的透明殼聚糖凝膠加到一種凝結(jié)液中，然后在溫度3°C下進(jìn)行硬化14小時(shí)，接著用去離子水洗滌至中性，在溫度4°C下保存過夜，得到一種殼聚糖微球。所述的凝結(jié)液是由10重量％NaOH水溶液與95重量％乙醇水溶液按照體積比4
I組成的。C、β-葡萄糖苷酶固定化按照以g計(jì)殼聚糖微球重量與以mL計(jì)戊二醛水溶液體積的比1.0 25，將步驟B得到的殼聚糖微球加到4重量％戊二醛水溶液(pH 6. 2)中，在溫度30°C下振蕩交聯(lián)4小時(shí)，再用水洗滌除去過量的戊二醛；然后，按照每克殼聚糖微球配比1400U游離β-葡萄糖苷酶，再加入諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司提供的來自畢赤酵母(Picha pastoris)的β -葡萄糖苷酶，在溫度20°C下振蕩固定8小時(shí)，用水洗滌除去未被固定的游離β -葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β_葡萄糖苷酶，其比活性為1250U/g。
然后，制備甜菊雙糖苷。使用O. 15M KH2PO4與O. 15M K2HPO4組成的pH值為6. 8的磷酸鹽緩沖液，將上海西寶生物科技有限公司銷售的甜菊苷溶解，得到一種甜菊苷濃度為8mg/mL的甜菊苷溶液，所述的甜菊苷溶液在溫度42°C下預(yù)熱O. 6小時(shí)，然后將預(yù)熱溶液以2mL/h的流速通過裝有前面制備的固定化β -葡萄糖苷酶的填充柱，所述預(yù)熱溶液與所述填充床的體積比是4 ;用高效液相色譜在實(shí)施例I描述的條件下檢測從所述填充柱底部流出的溶液，6小時(shí)后由色譜圖峰面積歸一化法計(jì)算得知甜菊苷轉(zhuǎn)化率已經(jīng)恒定。該試驗(yàn)持續(xù)進(jìn)行4天，每隔12h取樣進(jìn)行高效液相色譜法分析，96h時(shí)甜菊苷的轉(zhuǎn)化率仍達(dá)到70%。實(shí)施例11 :固定化β -葡萄糖苷酶水解甜菊苷選擇性試驗(yàn)該實(shí)施例的實(shí)施步驟如下首先制備固定化葡萄糖苷酶。Α、配制透明凝膠按照以g計(jì)殼聚糖微球重量與以mL計(jì)戊二醛水溶液體積的比O. 4 22，將殼聚糖溶于3重量％乙酸水溶液中，然后采用超聲波方法除去氣泡，得到一種透明殼聚糖凝膠。B、制備殼聚糖微球把步驟A得到的透明殼聚糖凝膠加到一種凝結(jié)液中，然后在溫度5°C下進(jìn)行硬化16小時(shí)，接著用去離子水洗滌至中性，在溫度4°C下保存過夜，得到一種殼聚糖微球。 所述的凝結(jié)液是由12重量％NaOH水溶液與95重量％乙醇水溶液按照體積比4
I組成的。C、β-葡萄糖苷酶固定化按照以g計(jì)殼聚糖微球重量與以mL計(jì)戊二醛水溶液體積的比I. I 23，將步驟B得到的殼聚糖微球加到O. 6重量％戊二醛水溶液(pH 6. 2)中，在溫度40°C下振蕩交聯(lián)6小時(shí)，再用水洗滌除去過量的戊二醛；然后，按照每克殼聚糖微球配比1900U游離β-葡萄糖苷酶，再加入諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司提供的來自畢赤酵母(Picha pastoris)的β -葡萄糖苷酶，在溫度22°C下振蕩固定10小時(shí)，用水洗滌除去未被固定的游離β -葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β_葡萄糖苷酶，其比活性為1520U/g。然后，制備甜菊雙糖苷。
使用O. 05M KH2PO4與O. 05M K2HPO4組成的pH值為7. O的磷酸鹽緩沖液，將湖北大仝生物化工科技有限公司銷售的甜菊苷(90重量％St，5重量％RA)溶解，得到一種甜菊苷濃度為18mg/mL的甜菊苷溶液，所述的甜菊苷溶液在溫度40°C下預(yù)熱O. 8小時(shí)，然后將預(yù)熱溶液以4mL/h的流速通過裝有前面制備的固定化β -葡萄糖苷酶的填充柱，所述預(yù)熱溶液與所述填充床的體積比是4 ;在轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行第3h時(shí)，用高效液相色譜在實(shí)施例I描述的條件下檢測從所述填充柱底部流出的溶液，甜菊苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)60%，萊鮑迪苷A的轉(zhuǎn)化率小于5% ο對比實(shí)施例I :現(xiàn)有技術(shù)的固定化β -葡萄糖苷酶穩(wěn)定性試驗(yàn)按照劉虎等人在《食品工業(yè)科技》，第4期(2011)中描述的方法進(jìn)行，IOOmL I重量％甜菊苷水溶液中加入20g用海藻酸鈉作包埋材料的固定化β-葡萄糖苷酶(來源于bacillus megaterium),在溫度 40°C與200r/min的條件下轉(zhuǎn)化5天后，采用HPLC法檢測原料液中甜菊苷的轉(zhuǎn)化率。上述固定化β -葡萄糖苷酶經(jīng)4次重復(fù)使用，甜菊苷的轉(zhuǎn)化率由96. 45%降到55. 72%。
權(quán)利要求
1.一種用甜菊苷制備甜菊雙糖苷的方法，其特征在于該方法的步驟如下 用水或磷酸鹽緩沖液溶解甜菊苷或含有甜菊苷的甜葉菊提取物，得到甜菊苷溶液，所述的甜菊苷溶液在溫度30-50°C下預(yù)熱O. 5-1. O小時(shí)；然后將此預(yù)熱溶液以恒定的流速通過裝有固定化β_葡萄糖苷酶的填充柱，讓外循環(huán)水通過填充柱夾套，以便將其反應(yīng)溫度控制在30-50°C，所述預(yù)熱溶液與所述填充柱的體積比是1-6 ;用高效液相色譜檢測從所述填充柱底部流出的溶液并用峰面積歸一化法計(jì)算各組分含量，待甜菊苷轉(zhuǎn)化率不再升高時(shí)，開始收集并合并流出液，然后蒸發(fā)濃縮，所得到的粗甜菊雙糖苷經(jīng)過重結(jié)晶后純度達(dá)到98%以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述磷酸鹽緩沖液是由KH2PO4與K2HPO4組成的pH值為5. 7-8. O的O. 01-0. 2M磷酸鹽緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述甜菊苷溶液的甜菊苷濃度是2-20mg/mLo
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的甜菊苷溶液以速度l-6mL/h通過所述的填充柱。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的粗甜菊雙糖苷在無水甲醇或乙醇中于室溫下進(jìn)行重結(jié)晶。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的固定化β_葡萄糖苷酶是采用下述步驟制備得到的 Α、配制透明凝膠 按照以g計(jì)殼聚糖重量與以mL計(jì)乙酸水溶液體積的比O. 2-0. 5 16-24，將殼聚糖溶于1-5重量％乙酸水溶液中，然后用超聲波除去該溶液中的氣泡，得到一種透明殼聚糖凝膠； B、制備殼聚糖微球 把在步驟A得到的透明殼聚糖凝膠滴加到一種凝結(jié)液中，然后在溫度2-6°C下進(jìn)行硬化10-16小時(shí)，得到一種殼聚糖微球，接著用去離子水將所述微球洗滌至中性，在溫度3-5 °C下保存過夜； 所述的凝結(jié)液是由8-12重量％NaOH水溶液與92-98重量％乙醇水溶液按照體積比3-5 I組成的； C、β-葡萄糖苷酶固定化 按照以克計(jì)殼聚糖微球與以毫升計(jì)戊二醛水溶液的比O. 8-1. 2 20-30，將步驟B得到的殼聚糖微球加到戊二醛水溶液中，在溫度20-40°C下振蕩交聯(lián)O. 5-8. O小時(shí)，再用水洗滌除去過量的戊二醛；然后，按照每克殼聚糖微球?yàn)?000-2000U游離β-葡萄糖苷酶的比例，再加入游離葡萄糖苷酶，在溫度15-35°C下振蕩固定2-12小時(shí)，用水洗滌除去未被固定的游離β_葡萄糖苷酶，得到所述的固定化β_葡萄糖苷酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的戊二醛水溶液的濃度是O.1-5. O重量％。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的殼聚糖微球與戊二醛的交聯(lián)時(shí)間是2.0-5. O 小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的游離β-葡萄糖苷酶的固定時(shí)間是.5.0-9.0小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用填充床酶促水解甜菊苷制備甜菊雙糖苷的方法。該方法包括用水或磷酸鹽緩沖液溶解甜菊苷或甜葉菊提取物，其溶液通過固定化β-葡萄糖苷酶填充柱，含有甜菊雙糖苷的部分合并，再濃縮與重結(jié)晶，得到甜菊雙糖苷?，F(xiàn)有技術(shù)制備甜菊雙糖苷需要5天，其β-葡萄糖苷酶重復(fù)使用4次后其轉(zhuǎn)化活性只是其原活性的57.72%。本發(fā)明使用固定化β-葡萄糖苷酶制備甜菊雙糖苷只需要12h，并且使用5次后其甜菊苷的轉(zhuǎn)化率仍達(dá)到84%以上。因此，本發(fā)明方法的生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)效率高，易于實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)，具有非常廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號C12P19/56GK102925518SQ201210427408
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月31日 公開號201210427408.8
發(fā)明者夏詠梅, 丁力, 方云 申請人:江南大學(xué)