專利名稱：復(fù)合誘變篩選獲得高效轉(zhuǎn)化DHEA為3β,7α,15α-三羥基雄甾-5-烯-17-酮菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過復(fù)合誘變亞麻刺盤孢得到高轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化DHEA為3β，7α，15α -三羥基雄留-5-烯-17-酮突變菌株的方法，屬于生物工程中發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
去氫表雄酮(DHEA)是自然界生物體內(nèi)重要的活性物質(zhì)，對(duì)生命的代謝活動(dòng)具有重要的調(diào)節(jié)作用，其衍生物3 β，7 α，15 α -三羥基雄甾_5_烯_17_酮是第四代口服避孕藥屈羅酮的前體化合物，具有高效、低毒、無副作用等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)還具備非避孕臨床益處，如控制體重、改善膚質(zhì)等。目前，屈螺酮為全球銷量第一的女用口服避孕藥，全球年銷售額達(dá)14. 5億歐元，故3β，7α，15 α -三羥基雄甾_5_烯_17_酮作為其醫(yī)藥中間體，應(yīng)用前景十分看好。傳統(tǒng)合成屈羅酮的方法是以醋酸去氫表雄酮為底物，通過18步的化學(xué)反應(yīng)合成，其特點(diǎn)是需要高溫高壓、設(shè)備投資大、產(chǎn)品收率低成本高，且后期產(chǎn)品回收純化工藝復(fù)雜繁瑣、對(duì)環(huán)境不友好等。近些年來，隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，生物轉(zhuǎn)化法由于具備反應(yīng)條件溫和，安全低耗易操作、轉(zhuǎn)化率相對(duì)較高且環(huán)境友好等特點(diǎn)而吸引了眾多國內(nèi)外研究者。但是也存在著微生物轉(zhuǎn)化效率不高、底物投料濃度低、轉(zhuǎn)化反應(yīng)專一性差，副產(chǎn)物較多和提取過程中有機(jī)溶劑使用量大造成環(huán)境污染等缺點(diǎn)。這些不足之處直接成為3 β，7 α，15 α -三羥基雄留-5-烯-17-酮工業(yè)生產(chǎn)中的瓶頸，因此解決這些問題，是留體工業(yè)大規(guī)模工業(yè)化的關(guān)鍵。復(fù)合誘變包括兩種或多種誘變劑的先后使用、同一種誘變劑的重復(fù)使用、兩種或多種誘變劑的同時(shí)使用。由于復(fù)合誘變與單因素誘變相比具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，因此在誘變育種中較多使用。紫外誘變是目前普遍采用的傳統(tǒng)誘變方法，它的誘變機(jī)理主要是它引起DNA的變化引起的。由于DNA強(qiáng)烈吸收紫外線，尤其是它鏈上的堿基，紫外線引起DNA結(jié)構(gòu)變化的形式很多，如DNA鏈的斷裂、DNA分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)、核酸與蛋白質(zhì)的交聯(lián)及嘧啶產(chǎn)生兩類化合物，即水合物和二聚體。二聚體大多數(shù)為胸腺嘧啶二聚體Τ=Τ，但也有T=C和C=C 二聚體，其中T=T的形成是改變DNA生物活性的重要原因。氮離子注入是指用能量為10 1000 keV量級(jí)的氮離子束入射到真菌中去，入射離子逐漸損失能量，最后停留在材料中，與生物的相互作用不僅有物理的和化學(xué)的，而且還會(huì)引起強(qiáng)烈的生物效應(yīng)，從而促使生物產(chǎn)生各種變異。N-離子注入過程中與生物體產(chǎn)生復(fù)雜的物理、化學(xué)和生物學(xué)效應(yīng)。注入的離子通過動(dòng)量傳遞、質(zhì)量沉積、動(dòng)能沉積和電荷交換效應(yīng)聯(lián)合作用而 對(duì)遺傳物質(zhì)產(chǎn)生直接或間接的損傷，同時(shí)生物體內(nèi)各種修復(fù)機(jī)制被激活，對(duì)損傷進(jìn)行修復(fù)，在修復(fù)過程中可能出錯(cuò)或者損傷超過了生物體的修復(fù)能力，就會(huì)引起突變和致死，突變就可能被穩(wěn)定遺傳下來。由于其在微生物誘變中的高效性，它正在得到越來越廣泛的使用。
本發(fā)明通過紫外線和氮離子注入復(fù)合誘變，獲得底物投料濃度高、轉(zhuǎn)化率高、副產(chǎn)物較少的菌株，為微生物轉(zhuǎn)化留體藥物工業(yè)化提供了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人通過對(duì)實(shí)驗(yàn)室原有菌株Iini進(jìn)行復(fù)合誘變,獲得一株轉(zhuǎn)化效率高、副產(chǎn)物少的突變株，并且測(cè)定了突變株18S rDNA、ITS基因序列。并將該氣取命名為{Colletotrichum linf) ST-1 ,于2012年4月24號(hào)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 6051。本發(fā)明提供的亞麻刺盤孢突變株7i/ i) ST-1, CGMCC No. 6051的生理形態(tài)及18S rDNA、ITS基因序列如下菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上采用打孔器接種法接種，孔徑0.5 cm，在30 °C培養(yǎng)4 d后菌落直徑為5. 2 cm，平均生長直徑為13.0 mm/d;培養(yǎng)7 d后，菌落邊緣呈橙紅色，中間呈灰黑色、褶皺隆起，可產(chǎn)生橙紅色色素；菌絲與培養(yǎng)基連接緊密，不易挑?。环稚咦庸木z層或子座生出，常不分枝也不分隔，密集成柵欄狀，分生孢子常埋于膠質(zhì)中，群集時(shí)使孢子成橙色等。分生孢子盤有剛毛，剛毛一般生于分生孢子盤的周圍，分生孢子橢圓形或新月形，直或微彎。18SrDNA基因序列如下
I GTTCGACTTT ACTTCTCTAA TGACCGAGTT TGGATAACTT TCCGGCCCTG AGTGGTAGTT 61 GCCCACCTCT CTGGGCCAGT CCGAAAGCCT CACTGAGCCA TTCAATCGGT AGTAGCGACG 121 GGCGGTGTGT ACAAAGGGCA GGGACGTAAT CAACGCAAGC TGATGACTTG CGCTTACTAG 181 GGATTCCTCG TTGAAGAGCA ATAATTGCAA TGCTCTATCC CCAGCACGAC GGAGTTTAAC 241 AAGATTACCC GGGCCTTCCG GCCAAGGGAG TACTCGCTGG CTCCGTCAGT GTAACGCGCG
301TGCGGCCCAG AACATCTAAG GGCATCACAG ACCTGTTATT GCCTCAAACT TCCATCGGCT361 TGAGCCGATA GTCCCTCTAA GAAGCCGGCG TACTGCCAAA GCAATACGGG CTATTTAGCA421 GGTTAAGGTC TCGTTCGTTA TCGCAATTAA GCAGACAAAT CACTCCACCA ACTAAGAACG481 GCCATGCACC ACCACCCACA AAATCAAGAA AGAGCTCTCA ATCTGTCAAT CCTCATTGTG541 TCTGGACCTG GTGAGTTTCC CCGTGTTGAG TCAAATTAAG CCGCAGGCTC CACCCCTGGT601 GGTGCCCTTC CGTCAATTTC TTTAAGTTTC AGCCTTGCGA CCATACTCCC CCTGGAGCCC661 AAGCACTTTG ATTTCTCGTA AGGTGTCGAA CGAGTCAAAA AATAACATCG TCCGATCCCT721 AGTCGGCATA GTTTATGGTT AAGACTACGA CGGTATCTGA TCGTCTTCGA TCCCCTAACT781 TTCGTTCCTG ATAAATGAAA ACATCCTTGG CAAATGCTTT CGCAGTAGTT AGTCTTCAAT841 AAATCCAAGA ATTTCACCTC TGACAATTGA ATACTGATGC CCCCGACTGT CCCTATTAAT901 CATTACGGCG GTCCTAGAAA CCAACAAAAT AGAACCACAC GTCCTATTCT ATTATTCCAT961 GCTAATGTAT TCGAGCATAG GCCTGCCTGG AGCACTCTAA TTTTTTCAAA GTAAAAGTCC1021 TGTTTCCCCG GCACACCCAG TGAAGGGCAT GCGGTTCCAC AGAGGGAAAG GCCCGGCCGG1081 ACCAGTGCAC GCGGTGAGGC GGACCGGCCA GCCAGGCCCA AGGTTCTACT ACGAGCTTTT1141 TAACCACAAC AACTTTAATA TACGCTATTG GAGCTGGAAT TACCGCGGCT GCTGGCACCA1201 GACTTGCCCT CCAATTGTTC CTCGTTAAGG GATTTAAATT GTACTCATTC CAATTACAAG1261 ACCCAAAAGA GCCCTGTATC AGTATTTATC GTCACTACCT CCCCGTGTCG GGATTGGGTA1321 ATTTGCGCGC CT GCTGCCTT CCTTGGATGT AGTAGCCGTT TCTCAGGCTC CTTCTCCGGG1381 GTCGAGCCCT AACCCTCCGT TACCCGTTGT AACCATGCTA GAACACTACT CTAGCATCGA1441 AAGTTGATAG GGAAGAAATT TGAATGAACC ATCGCCGGCG CAAGGCCATG CGATTCGAGA1501 AGTTATTATG AATCACCAGT GAGCCCCGAA GGGCATTGGT TTTTAATCTA ATAAATACAT1561 CCCTTCCGAA GTCGGGATTT TTAGCATGTA TTAGCTCTAG AATTACCACG GTTATCCAAG1621 TAGTAAGGTA CTATCAAATA AACGATAACT TATATAATGA GCCATTCGCA GTTTCGCTGT1681 ATAATGCTTA TACTTAGACA TGCATGGGCT TAATCTTTTT AGACAGCCTA TGACTACCAT1741 CGTTCGAAAG GCAGGCGGTG CAAAACATGG GCGITS基因序列如下
I TTAAGTTCAG CGGGTATTCC TACCTGATCC GAGGTCAACC TGTAAAAGTT TTGGGGGTTT 61 TACGGCAAGA GTCCCTCCGG ATCCCAGTGC GAGACGTTAA GTTACTACGC AAAGGAGGCT 121 CCGGGAGGGT CCGCCACTAC CTTTAAGGGC CTACGTCGAC CGTAGGGCCC CAACACCAAG 181 CCGGGCTTGA GGGTTGAAAT GACGCTCGAA CAGGCATGCC CGCCAGAATG CTGGCGGGCG 241 CAATGTGCGT TCAAAGATTC GATGATTCAC TGAATTCTGC AATTCACATT ACTTATCGCA 301 TTTCGCTGCG TTCTTCATCG ATGCCAGAAC CAAGAGATCC GTTGTTAAAA GTTTTAATTA 361 TTTGCTTGTG CCACTCAGAA GAAACGTCGT TAAAATAGAG TTTGGTATCC TCCGGCGGGC 421 GCCACGCCCG TGAGGGCGCG GCCGGGAGGG GGACCGCCCC CCCGAGGGGG GGTTGTCCTC 481 CTGCCCGCCG AAGCAACAGT TAAGGTATGT TCACAAAGGG TTGTAGAGCG GTAACTCAGT 541 AATGATCCCT CCGCAGGTTC ACCTACGGA
本發(fā)明運(yùn)用全波長掃描和比濁法確定孢子數(shù)量首先過濾培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期末期的培養(yǎng)液得到孢子懸液，離心后棄上清，無菌水重新懸浮，全波長掃描確定在455 nm下有最大最大吸收峰，然后將孢子懸液濃度稀釋為IX 106、2X 106、3X 106、4X 106、5X 106、7X 106、8X 106，然后測(cè)定不同濃度的孢子懸液在450 nm下的吸光值，建立亞麻刺盤孢對(duì)數(shù)期末期孢子數(shù)目與OD值的回歸方程Y=5. 637Χ 10_2 + 7. 216X IO^8X (P < O. 01)。使用比濁法計(jì)數(shù)真菌孢子時(shí)將測(cè)得的OD值代入方程便可快速、準(zhǔn)確得出孢子數(shù)目。此方法大大減少了工作步驟，提高了工作效率。 本發(fā)明運(yùn)用一種酮康唑抗性篩選法對(duì)誘變后的菌株進(jìn)行初篩
酮康唑?yàn)檫溥蝾惪拐婢?，其作用機(jī)制為抑制真菌細(xì)胞膜麥角留醇的生物合成，影響細(xì)胞膜的通透性，抑制其生長。它的作用機(jī)制主要為高度選擇性干擾真菌的細(xì)胞色素Ρ-450的活性，從而抑制真菌細(xì)胞膜上麥角固醇的生物合成。酮康唑最低抑菌濃度的確定
首先制作孢子懸液，然后將孢子懸液稀釋到合適的倍數(shù)涂布于酮康唑梯度平板上，30°C培養(yǎng)3天，平板菌落計(jì)數(shù)。未生長菌落的最低酮康唑濃度為最低抑菌濃度。本發(fā)明首次對(duì)亞麻刺盤孢進(jìn)行復(fù)合誘變
對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行紫外誘變和氮離子注入誘變，結(jié)合酮康唑抗性進(jìn)行初篩，挑取含有酮康唑最低抑菌濃度平板上生長良好的菌落接種于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)3 4天，待種子液生長為肉眼可見的均勻小球時(shí)以10 %的接種量轉(zhuǎn)接種子培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，然后以10 %的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)至24 h時(shí)10 g/L DHEA投料，轉(zhuǎn)化至72 h停止發(fā)酵，取樣乙酸乙酯萃取，TLC、HPLC檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物。所述培養(yǎng)基組成種子培養(yǎng)基(g/U :花生餅粉 I %，葡萄糖1. 5 %，KCl 0.1 %，(NH4) SO4 0. 2 %，MgSO4
0.15 %
K2H2PO4 0.1 % ;去離子水定容；PH 7. 0 ；
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):淀粉2 %，酵母膏1. 5 %，葡萄糖2 %，麥芽膏I %，泡敵0. 15 % ;去離子水定容；PH 7. 0 ；
本發(fā)明首次通過復(fù)合誘變亞麻刺盤孢，得到高底物投料量、高底物轉(zhuǎn)化率、高產(chǎn)物得率的菌株隨機(jī)挑取酮康唑平板上生長良好的單菌落接種種子培養(yǎng)基，兩次活化后，以10 %的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，72 h終止發(fā)酵，TLC、HPLC定性定量檢測(cè)產(chǎn)物。通過復(fù)合誘變，投料10 g/L時(shí)，底物轉(zhuǎn)化率由原來的49. 6 %提高到83. 2%，產(chǎn)物得率由原來的38. 3 %提高到62. 3%，產(chǎn)物得率和底物轉(zhuǎn)化率都有較大幅度的提高。


圖1 菌株{Colletotrichum Iini ST-1, CGMCC No. 6051)的 PDA 平板菌落形態(tài)。圖2 菌株(PoIletotrichum Iini ST-1, CGMCC No. 6051)的菌絲和抱子形態(tài)。圖3 菌株{Colletotrichum Iini ST-1, CGMCC No. 6051)底物 10g/L 的發(fā)酵過程曲線。圖4 MHCoIletotrichum Iini ST-1, CGMCC No. 6051)發(fā)酵產(chǎn)物的 HPLC 圖譜。
具體實(shí)施例方式實(shí)施實(shí)例1:出發(fā)菌株的選擇、生長曲線、轉(zhuǎn)化曲線和轉(zhuǎn)化能力的測(cè)定 出發(fā)菌株的選擇
將已有斜面菌株劃線分離單菌落，挑取平板上100株生長良好的單菌落，接種于種子培養(yǎng)基，30 0C >200 r/min培養(yǎng)4 5天后以10 %的接種量二次轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)20 30 h后以10 %的接種量接種于250 mL搖瓶，30 °C >200 r/min培養(yǎng)24 h后以10 g/L DHEA投料，28 °C >200 r/min發(fā)酵72 h后終止發(fā)酵，取樣乙酸乙酯萃取3 4次，TLC初步檢測(cè)底物轉(zhuǎn)化和產(chǎn)物生成狀況，HPLC定性、定量檢測(cè)底物轉(zhuǎn)化和產(chǎn)物生成。選擇一株底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物得率相對(duì)較高的菌株做為出發(fā)菌株。出發(fā)菌株生長曲線的測(cè)定
以10 %的接種量接種于500mL搖瓶(裝液量100 mL)，30 °C>200 r/min培養(yǎng)，每隔4h取樣I mL，烘干稱干重(連續(xù)稱重三次，重量差別不超過0.5 %)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)(0 90
h)，以菌體干重為縱坐標(biāo)做菌體生長曲線。出發(fā)菌株轉(zhuǎn)化曲線和轉(zhuǎn)化能力的測(cè)定
以10%的接種量接種于500mL搖瓶(裝液量100 mL)，28 °C >200 r/min培養(yǎng)至24 h分
別以4 g/L,8 g/L、10 g/L、12 g/L、16 g/L投料，投料后每間隔4 8 h取樣，乙酸乙酯萃
取3 4次，HPLC檢測(cè)底物轉(zhuǎn)化和產(chǎn)物生成狀況，以時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)，產(chǎn)物生成量和底物
剩余量(g/L)為縱坐標(biāo)做菌株轉(zhuǎn)化曲線。
權(quán)利要求
1.一株通過復(fù)合誘變篩選得到的高效轉(zhuǎn)化去氫表雄酮為30，7a，15a-三羥基雄甾-5-烯-17-酮的突變菌株,該菌株為亞麻刺盤孢Iini ) ST-1,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 6051，保藏日期為2012年4月24日。
2.亞麻刺盤孢(Cb77e(otricA7i/ i)ST_l保藏號(hào)CGMCCNo. 6051的誘變選育方法，其特征在于 (1)出發(fā)菌株的確定將已有斜面菌種平板劃線分離單菌落，隨機(jī)挑選生長良好的100株單菌落搖瓶發(fā)酵，TLC、HPLC檢測(cè)底物轉(zhuǎn)化和產(chǎn)物生成能力，最終選擇C I為出發(fā)菌株； (2)孢子懸液的制備菌液培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期2 4層無菌擦鏡紙過濾得到孢子懸液，10000r/min離心10 min,棄上清后0. 9 %無菌生理鹽水洗劑2 3次后，振蕩打散； (3)孢子計(jì)數(shù)方法的確定孢子懸液全波長掃描確定最大吸收波長為455nm，然后將孢子懸液濃度分別調(diào)整為IX 106、2X 106、3X 106、4X 106、5X 106、7X 106、8X 106，然后測(cè)定不同濃度的孢子懸液在450 nm下的吸光值，建立亞麻刺盤孢對(duì)數(shù)期末期孢子數(shù)目與OD值的回歸方程Y=5. 637X 10_2 + 7. 216X 10_8 X (P < 0.01);使用比濁法計(jì)數(shù)真菌孢子時(shí)將測(cè)得的OD值代入方程便可快速、準(zhǔn)確得出孢子數(shù)目； (4)出發(fā)菌株生長曲線、紫外致死率曲線和N-離子注入致死率曲線的制定接種后每隔4 h取樣測(cè)干重，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌體干重為縱坐標(biāo)做菌體生長曲線；誘變孢子懸液至于 25 w、30 cm 紫夕卜燈下分別照身寸 I min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min、8 min,稀釋涂布PDA平板，選擇80 % 90 %的致死率照射時(shí)間進(jìn)行誘變；取誘變孢子懸液0.1 ml均勻涂布于直徑為90 _的無菌空白平皿中央，至于超凈臺(tái)下由無菌風(fēng)吹干制成菌膜，注入前靶室用紫外燈滅菌30 min，將孢子懸液放于靶室，分別用2. 6X1014 ions/cm2的0、20、40、60、80、100、120和140倍的不同劑量注入離子；將誘變孢子適當(dāng)稀釋，涂布PDA平板，以置于小靶室真空中不經(jīng)離子注入的孢子懸液為對(duì)照，計(jì)算存活率，做致死率曲線；選擇70% 80 %的致死率注入劑量作為最佳注入劑量； (5)使用酮康唑抗性對(duì)誘變菌株初篩首先確定酮康唑最低抑菌濃度，孢子懸液涂布于酮康唑梯度平板，未生長菌落的酮康唑平板濃度即為最低抑菌濃度；誘變后涂布菌懸液與含有酮康唑最低抑菌濃度的PDA平板，30 °C培養(yǎng)3 4天，挑取生長良好的單菌落搖瓶復(fù)篩。
3.利用突變株亞麻刺盤孢Iini)ST-1保藏號(hào)CGMCC No. 6051轉(zhuǎn)化去氫表雄酮為30，7a，15a-三羥基雄甾_5_烯_17_酮的方法，其特征為250 mL三角瓶裝30 mL的種子培養(yǎng)基，接種量按體積比為10 %，培養(yǎng)溫度30 °C，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)24 h后投入底物去氫表雄酮，繼續(xù)轉(zhuǎn)化60 72 h，乙酸乙酯萃取，TLC、HPLC檢測(cè)底物轉(zhuǎn)化和產(chǎn)物生成；所述培養(yǎng)基組成種子培養(yǎng)基(g/L):花生餅粉I %，葡萄糖1. 5 %，KCl 0.1%，(NH4) SO4 0. 2 %，MgSO4 0. 15 %，K2H2PO4 0.1 % ;去離子水定容；PH 7. 0 ;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)淀粉2 %，酵母膏1. 5 %，葡 萄糖2 %，麥芽膏I %，泡敵0. 15 % ;去離子水定容；PH 7. 0 ；.121 "€高壓蒸汽下滅菌20 min。
全文摘要
本發(fā)明屬生物工程中發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及通過紫外和氮離子注入復(fù)合誘變篩選得到高效轉(zhuǎn)化去氫表雄酮為3β,7α,15α-三羥基雄甾-5-烯-17-酮的高產(chǎn)突變株(Colletotrichumlini)ST-1。本發(fā)明通過紫外線和氮離子注入復(fù)合誘變，獲得底物投料濃度高、轉(zhuǎn)化率高、副產(chǎn)物較少的菌株，為微生物轉(zhuǎn)化甾體藥物工業(yè)化提供了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12P33/06GK103060201SQ20121042772
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月1日
發(fā)明者許正宏, 李傳鵬, 李會(huì), 史勁松, 竇文芳 申請(qǐng)人:江南大學(xué)