專利名稱：尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的表達(dá)及酶活測定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及通過采用基因工程方法克隆并表達(dá)尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶(Uridine Diphosphate Glucose Dehydrogenase,UDP-GlcDH)。
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸(Hyaluronic Acid,HA)是由N-乙酰氨基葡萄糖與葡萄糖醛酸為雙糖單位等摩爾聚合而成的酸性黏多糖，Mr多在IO4 IO7Da之間，不同的Mr具有不同的應(yīng)用領(lǐng)域。由于HA獨(dú)特的黏彈性和生理功能，HA已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品和食品領(lǐng)域。C組的獸疫鏈球菌和馬疫鏈球菌都可以合成HA，鑒于HA在發(fā)酵液中以游離狀態(tài)存在，具有易于分離純化和工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，因此目前工業(yè)上主要采取發(fā)酵法獲取HA。然而鏈球菌具有一定的致病性并含有外毒素，而且對于培養(yǎng)基營養(yǎng)條件要求苛刻，利用它發(fā)酵生產(chǎn)難于通過代謝調(diào)控獲得不同分子量的HA等劣勢已展現(xiàn)出來，以傳統(tǒng)的工藝優(yōu)化難以克服上述弊端，而采用基因工程手段構(gòu)建工程菌表達(dá)HA則克服了上述缺點(diǎn)，具有成本低，便于代謝調(diào)控以及下游純化工藝便捷等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸成為未來工業(yè)化生產(chǎn)HA的優(yōu)選方法。研究表明，鏈球菌中的has操縱子是其表達(dá)合成HA所必需的，has操縱子是由hasA、hasB和hasC三個(gè)基因組成,分別編碼著HA合成酶、尿苷二磷酸_葡萄糖脫氫酶和尿苷二磷酸-葡萄糖焦磷酸化酶，但是對于HA合成代謝具有顯著影響的主要是hasA和hasB基因，只要將hasA與hasB基因?qū)氡磉_(dá)菌株并在適宜的培養(yǎng)條件下就有可能獲得HA。UDP-GlcDH存在于動(dòng)物、植物與細(xì)菌中，可以將尿苷二磷酸-葡萄糖轉(zhuǎn)化成尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸，后者是形成結(jié)構(gòu)多糖和細(xì)胞生長代謝必不缺少的前體物質(zhì)。Sheng等研究結(jié)果表明高表達(dá)UDP-GlcDH更有利于HA的生成，因此只有提供豐富的HA前體物質(zhì)——尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸才能高表達(dá)HA，而高表達(dá)的UDP-GlcDH則是產(chǎn)生大量尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸的必需條件。因此，本領(lǐng)域非常有必要研究高表達(dá)尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的方法，以大量生產(chǎn)透明質(zhì)酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供大腸桿菌尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的表達(dá)及酶活測定。在本發(fā)明的第一方面，提供一種重組表達(dá)尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的方法，包括(I)提供表達(dá)構(gòu)建物，其從5’至3’端依次包括以下操作性連接的元件噬菌體匕啟動(dòng)子，編碼尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的基因ugd ；(2)將(I)的表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行升溫誘導(dǎo)表達(dá)，迅速升溫到38_42°C，振蕩培養(yǎng)8-15小時(shí)；較佳地為9-12小時(shí)。在一個(gè)優(yōu)選例中，步驟(2)中，升溫誘導(dǎo)表達(dá)方法選自
迅速升溫到40-42 °C進(jìn)行恒定溫度誘導(dǎo)；迅速升溫到40_42°C誘導(dǎo)1±0. 5小時(shí)后迅速降溫至38±0. 5°C進(jìn)行恒定溫度誘導(dǎo)；或添加終濃度為O. 5-2g/L酵母抽提物后迅速升溫到42 ±O. 5°C誘導(dǎo)1±0. 5小時(shí)后迅速降溫至38±0. 5°C進(jìn)行恒定溫度誘導(dǎo)。在另一優(yōu)選例中，經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，在升溫誘導(dǎo)表達(dá)前，還包括先將經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌接種到LB培養(yǎng)基中，在37±0. 5°C，200r/min培養(yǎng)12±2小時(shí)；之后轉(zhuǎn)接到M9CAA培養(yǎng)基中，在30±O. 5°C,200r/min培養(yǎng)12±2小時(shí)；再次轉(zhuǎn)接到M9CAA培養(yǎng)基中，在35±O. 5°C,200r/min 培養(yǎng) 2±O. 5 小時(shí)。在另一優(yōu)選例中，尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的基因ugd的核苷酸序列如SEQ IDNO: I所示。在另一優(yōu)選例中，在步驟(2)之后，還包括步驟(3):在pH7. 5±0. I條件下測定誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的酶活。在另一優(yōu)選例中，測定酶活的方法包括將大腸桿菌培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行菌體破碎(較佳地，采用超聲破碎)，之后在30°C下進(jìn)行酶活反應(yīng)，相對于Iml酶反應(yīng)體系包括5mmol .!/1UDP-葡萄糖,5mmol · L4NAD+, IOOmmol · L^1Tris-HCl 及 5 μ I 酶液；酶活反應(yīng)后，測定340nm吸光度，根據(jù)朗波爾定律Λ A= ε CL和酶活定義獲得酶活值。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于重組表達(dá)尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶(UDP-GlcDH)的構(gòu)建物，其從5’至3’端依次包括以下操作性連接的元件噬菌體啟動(dòng)子，編碼尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的基因ugd。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的編碼尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的基因ugd的序列如SEQID NO: I 所示。 在另一優(yōu)選例中，編碼尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的基因Ugd來源于Escherichiacoli YK537 的基因組 DNA。在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物是表達(dá)載體。在本發(fā)明的另一方面，提供一種基因工程菌，其包含所述的構(gòu)建物。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖I、表達(dá)質(zhì)粒pBLBugd和pBLYugd的構(gòu)建示意圖。圖2、不同誘導(dǎo)溫度及培養(yǎng)條件下UDP-GlcDH的活性測定圖。附圖中的宿主菌均為YK537，+線為質(zhì)粒pBLBugd轉(zhuǎn)化YK537后所得的工程菌測定的酶活曲線，+線為pBLYugd轉(zhuǎn)化YK537后所得工程菌測定的酶活曲線。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及一種大腸桿菌尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶(簡稱UDP-GlcDH)的基因克隆、表達(dá)以及酶活性測定的方法。本發(fā)明將啟動(dòng)子、大腸桿菌UDP-GlcDH的基因(ugd)串聯(lián)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，將所述表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核菌株，利用該菌株溫度誘導(dǎo)表達(dá)m)P-GlcDH，并對其酶活性進(jìn)行測定。采用該表達(dá)方法得到的m)P-GlcDH，表達(dá)效率高，酶活性高，酶活性保持的持續(xù)時(shí)間長。術(shù)語如本文所用，所述的“表達(dá)構(gòu)建物(或稱DNA構(gòu)建物)”或“表達(dá)構(gòu)建體(或稱DNA構(gòu)建體)”指一種已經(jīng)通過人為干預(yù)修飾，使其含有按照自然界中不存在的序列所組合和排列的DNA片段的單鏈或者雙鏈DNA分子。如本文所用，所述的“操作性連接”或“可操作性相連”是指兩個(gè)或多個(gè)核酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列。例如啟動(dòng)子區(qū)被置于相對于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動(dòng)子區(qū)域的引導(dǎo)，從而，啟動(dòng)子區(qū)域被“可操作地連接”到該核酸序列上。如本文所用，所述的“啟動(dòng)子”或“啟動(dòng)子區(qū)域”，代表本領(lǐng)域所共知的含義，表示一個(gè)基因的一部分，其含有可供RNA聚合酶結(jié)合的DNA序列和轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn)?！と绫疚乃?，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”、和“由……構(gòu)成”;“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”和“由……構(gòu)成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。表達(dá)構(gòu)建物本發(fā)明提供了一種用于重組表達(dá)大腸桿菌UDP-GlcDH構(gòu)建物，其從5’至3’端依次包括以下操作性連接的元件噬菌體Pl啟動(dòng)子，編碼UDP-GlcDH的基因ugd。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的編碼大腸桿菌UDP-GlcDH的基因Ugd序列如SEQID NO: I所示，并且來源于Escherichia coli YK537的基因組DNA。構(gòu)建物中各元件之間還可包括限制性的酶切位點(diǎn)，這樣有利于各元件的有機(jī)連接。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的ugd基因的下游具有限制性內(nèi)切酶HindIII酶切位點(diǎn)。通常，所述的構(gòu)建物位于表達(dá)載體上。因此，本發(fā)明還包括一種載體，它含有所述的構(gòu)建物。所述的表達(dá)載體通常還含有復(fù)制起點(diǎn)和/或標(biāo)記基因等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建本發(fā)明所需的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀。作為本發(fā)明的一種具體實(shí)施例，構(gòu)建了兩種表達(dá)質(zhì)粒pBLBugd和pBLYugd,這兩種質(zhì)粒被用于直接表達(dá)UDP-GlcDH。包含上述的適當(dāng)多核苷酸序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗?。在本發(fā)明的方法中，所述的宿主是大腸桿菌。本發(fā)明還提供了包含上述構(gòu)建物的基因工程菌。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行，例如磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。作為一種優(yōu)選的方式，可用預(yù)冷氯化鈣處理宿主細(xì)胞再升溫至42°C作短時(shí)處理的方法進(jìn)行。本發(fā)明還提供了包含上述構(gòu)建物的基因工程菌。包含上述的適當(dāng)多核苷酸序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗?。較佳地，所述的宿主是大腸桿菌YK537。表達(dá)方法本發(fā)明還提供了表達(dá)UDP-GlcDH的方法，包括(I)提供表達(dá)構(gòu)建物，其從5’至3’端依次包括以下操作性連接的元件噬菌體啟動(dòng)子，編碼尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的基因ugd; (2)將(I)的表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行升溫誘導(dǎo)表達(dá)，迅速升溫到38-42°C，振蕩培養(yǎng)8-15小時(shí)。UDP-GlcDH被應(yīng)用于重組表達(dá)生產(chǎn)透明質(zhì)酸(HA)。高表達(dá)UDP-GlcDH有利于HA的生成，因此只有提供豐富的HA前體物質(zhì)——尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸才能高表達(dá)HA，而高表達(dá)的UDP-GlcDH則是產(chǎn)生大量尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸的必需條件。所述的噬菌體啟動(dòng)子為一種溫敏強(qiáng)啟動(dòng)子，其可在一定的誘導(dǎo)溫度下啟動(dòng)下游基因的表達(dá)。然而，很多蛋白不適合在高于40°C的情況下表達(dá)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，UDP-GlcDH蛋白可以在42°C表達(dá)，但是經(jīng)常會(huì)在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量包涵體，導(dǎo)致實(shí)際酶活很低或幾乎測不到；針對包涵體，無法在活體細(xì)胞內(nèi)通過復(fù)性手段將包涵體轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄缘鞍?。因此，針對UDP-GlcDH的特點(diǎn)，本發(fā)明人經(jīng)過深入研究以及反復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終確定采取先升溫至較高溫度，再適當(dāng)降溫的表達(dá)方法。較佳地，采取的溫度誘導(dǎo)方法為迅速升溫到40-42°C誘導(dǎo)1±0. 5小時(shí)后迅速降溫至38±0. 5°C進(jìn)行恒定溫度誘導(dǎo)；或添加終濃度為O. 5-2g/L酵母抽提物后迅速升溫到42±0. 5°C誘導(dǎo)1±0. 5小時(shí)后迅速降溫至38±0. 5°C進(jìn)行恒定溫度誘導(dǎo)。作為最優(yōu)選的方式，添加終濃度為O. 5-2g/L酵母抽提物后迅速升溫到42±0. 50C誘導(dǎo)1±0. 5小時(shí)后迅速降溫至38±0. 5°C進(jìn)行恒定溫度誘導(dǎo)，這一條件下，可以大大提高UDP-GlcDH的表達(dá)量。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，在升溫誘導(dǎo)表達(dá)前，還包括先將經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌接種到LB培養(yǎng)基中，在37±0. 5°C，200r/min培養(yǎng)12±2小時(shí)；之后轉(zhuǎn)接到M9CAA培養(yǎng)基中，在30±O. 5°C,200r/min培養(yǎng)12±2小時(shí)；再次轉(zhuǎn)接到M9CAA培養(yǎng)基中，在35±O. 5°C,200r/min培養(yǎng)2±0. 5小時(shí)。上述步驟的應(yīng)用，為菌體的生長提供了合適的條件，使得在誘導(dǎo)表達(dá)前達(dá)到合適的菌體量以及菌體狀態(tài)，有利于后續(xù)的誘導(dǎo)表達(dá)和高表達(dá)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的基因Ugd的核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。較佳地，其來源于Escherichia coli YK537的基因組DNA。本發(fā)明將PL啟動(dòng)子、大腸桿菌UDP-GlcDH的基因(ugd)串聯(lián)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，將所述表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核菌株，利用該菌株溫度誘導(dǎo)表達(dá)UDP-GlcDH，并對其酶活性進(jìn)行了測定。采用該表達(dá)方法得到的m)P-GlcDH，表達(dá)效率高，酶活性高，酶活性保持的持續(xù)時(shí)間長。酶活測定作為合成透明質(zhì)酸的重要參與中間物質(zhì)，有必要實(shí)時(shí)了解細(xì)胞內(nèi)尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的酶活。因此，本發(fā)明人還優(yōu)化了尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的酶活測定方法。經(jīng)過反復(fù)研究，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在酶活測定的反應(yīng)體系中，調(diào)節(jié)pH值7. 5，可以測得最高的酶活性；而當(dāng)PH值大于或等于8. O時(shí)，則基本上測不到酶活性，因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在重組表達(dá)后，在PH7. 5±0. I條件下測定誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的酶活。更優(yōu)選的，測定酶活的方法包括將大腸桿菌培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行菌體破碎(較佳地，采用超聲破碎)，之后在30°C下進(jìn)行酶活反應(yīng),相對于Iml酶反應(yīng)體系包括5mmol . PUDP-葡萄糖，5mmol · T1NAD+，IOOmmol · PTris-HCl及5 μ I酶液；酶活反應(yīng)后，測定340nm吸光度，根據(jù)朗波爾定律ΛΑ= ε CL和酶活定義獲得酶活值。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆 布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。以下實(shí)施例中所用到的基因、引物的合成，DNA的抽提及回收，DNA測序等，均是上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的產(chǎn)品或提供的服務(wù)；酶、dNTPs和DNA Marker則采用了 TaKaRa公司的產(chǎn)品；各種生化試劑均采購自上海國藥和SIGMA公司。實(shí)施例中，LB培養(yǎng)基及M9CAA培養(yǎng)基均加入氨芐青霉素，終濃度為100 μ g · Iiir10實(shí)施例I、大腸桿菌UDP-葡萄糖脫氫酶表達(dá)載體的構(gòu)建I、大腸桿菌基因組DNA提取取大腸桿菌BL21(DE3)與大腸桿菌YK537甘油菌轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，次日參照DNA抽提試劑盒方法提取基因組總DNA，并用紫外分光光度計(jì)測定其純度。2、引物的設(shè)計(jì)與合成通過對NCBI中已公布的大腸桿菌CFT073(NC_004311)，大腸桿菌BL21(DE3)(NC_012971. 2，NC_012892. 2)，大腸桿菌K_12 (NC_000913)的ugd基因的保守序列對比，設(shè)計(jì)出ugd基因的上游引物和下游引物。上游引物(ugd-F):5’ GGATCCATGAAAATCACCATTTCCGGTA 3’ (內(nèi)含 BamHI 位點(diǎn))(SEQ ID NO:2)ο下游引物(ugd-R):5’ CCCAAGCTTATTAGTCGCTGCCAAAGAGATCG3，(內(nèi)含 Hind III位點(diǎn))(SEQ ID NO:3)ο3、PCR 反應(yīng)分別以大腸桿菌BL21 (DE3)與YK537的基因組DNA為模板，以ugd_F和ugd-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得ugd基因。PCR條件95°C預(yù)變性lOmin，然后每個(gè)循環(huán)94°C變性lmin，57°C退火lmin，72°C延伸I. 5min，共32個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin0來自大腸桿菌BL21(DE3)與YK537的ugd基因，兩者的DNA序列同源性為98. 37%。大腸桿菌BL21 (DE3)所含ugd基因的DNA序列在GenBank已公布(BL21 (DE3)來源的為NC_012971. 2, NC_012892. 2)，YK537來源的與BL21 (DE3)來源的基因的氨基酸同源性為99. 74%，僅在184位氨基酸出現(xiàn)差異。4、表達(dá)載體的構(gòu)建將質(zhì)粒pBLMVL2 (參見《生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)》，2003, 35 (2) : 167-171 ;或《生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)》，clts857基因的克隆、修飾及溫敏誘導(dǎo)表達(dá)載體，1994年26卷4期)進(jìn)行EcoRI酶切處理,將處理后的開環(huán)質(zhì)粒再采用Mung Bean Nuclease進(jìn)行黏性末端的平滑化，平滑化后放入65°C水浴15min熱處理，再采用Hind III酶切，最后采用低熔點(diǎn)膠電泳分離并使用膠回收試劑盒回收處理后載體JtPCR回收后的ugd基因采用HindIII單酶切，將以上處理完的載體和ugd基因擴(kuò)增產(chǎn)物采用T4DNA連接酶進(jìn)行16°C過夜連接，次日轉(zhuǎn)化到E. coli TOPlO中涂布于氨芐平板(含氨芐IOOyg . πιΓ1)并挑選單克隆，對抽提質(zhì)粒采用BamHI、HindIII雙酶切和PCR鑒定，將篩選得到的陽性克隆接種于LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)12 16h，抽提質(zhì)粒分別獲得pBLBugd與pBLYugd，構(gòu)建示意圖如圖I。pBLBugd中Bugd,代表大腸桿菌BL21 (DE3)的ugd基因，pBLYugd中Yugd代表大腸桿菌YK537的ugd基因。感受態(tài)細(xì)胞的制備將10μ1 ΥΚ537甘油菌接種至3ml LB培養(yǎng)基中，37°C 200rpm培養(yǎng)過夜，取100 μ I菌液再接入3ml LB培養(yǎng)基中，37°C 200rpm培養(yǎng)至A6qq O. 3 O. 4，然后4，OOOrpm離心10分鐘，棄上清，菌體以預(yù)冷的鈣溶液(O. lmol/1 CaCl2)洗滌，4，OOOrpm離心10分鐘，菌體重懸于200 μ I的鈣溶液中備用。轉(zhuǎn)化取重組質(zhì)粒適量加入上述制備的感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30分鐘，然后于42°C熱休克90秒，隨后加入800 μ I 1^培養(yǎng)基，于371，100印111，振搖30分鐘，取10(^1涂布含10(^8/ml氨芐青霉素的LB平板(瓊脂含量為I. 5%)，37°C倒置培養(yǎng)過夜。實(shí)施例2、大腸桿菌UDP-葡萄糖脫氫酶的表達(dá)及酶活性測定I.菌種培養(yǎng)取重組大腸桿菌的甘油菌先接種到LB培養(yǎng)基中37°C，200r/min培養(yǎng)12小時(shí)，緊接著按照2%的接種量分別轉(zhuǎn)接到M9CAA培養(yǎng)基(含1%酸水解酪蛋白和1%葡萄糖的M9培養(yǎng)基)中30°C，200r/min培養(yǎng)12小時(shí)，次日按照10%接種量分別再次轉(zhuǎn)接到M9CAA搖瓶培養(yǎng)基(含1%酸水解酪蛋白和1%葡萄糖的M9培養(yǎng)基)中，35°C，200r/min繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)后進(jìn)入溫度誘導(dǎo)階段。2.溫度誘導(dǎo)采取選自以下的一種方式進(jìn)行溫度誘導(dǎo)A.迅速升溫到38°C進(jìn)行恒定溫度誘導(dǎo)，振蕩培養(yǎng)10h。B.迅速升溫到40°C進(jìn)行恒定溫度誘導(dǎo)，振蕩培養(yǎng)10h。C.迅速升溫到42°C進(jìn)行恒定溫度誘導(dǎo)，振蕩培養(yǎng)10h。D.迅速升溫到40°C誘導(dǎo)Ih后迅速降溫至38°C進(jìn)行恒定溫度誘導(dǎo)9h(兩階段誘導(dǎo))。E.迅速升溫到42°C誘導(dǎo)Ih后迅速降溫至38°C進(jìn)行恒定溫度誘導(dǎo)9h(兩階段誘導(dǎo))。F.添加酵母抽提物(終濃度為lg/L)后迅速升溫到42°C誘導(dǎo)Ih后迅速降溫至38°C進(jìn)行恒定溫度誘導(dǎo)9h (兩階段誘導(dǎo))。3.大腸桿菌UDP-GlcDH的測定UDP-GlcDH的酶活定義為30°C條件下該反應(yīng)體系中每分鐘生成2 μ molNADH為1U。 分別于誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后每隔2h取一次樣，首先菌液3ml在12000r/min離心，棄上清后在4°C條件下重懸浮于Iml PBS(pH 7. 5，IOmM)溶液中，在冰浴條件下選取300V電壓，超聲3s間歇5s對菌體進(jìn)行超聲破碎20min，離心取上清作為粗提液。以Iml反應(yīng)體系為酶活測定體系，其中包括5mmol · I^1UDP-葡萄糖,5mmoI · L4NAD+, IOOmmol ·L^1Tris-HCKpH 7. 5)及5 μ I粗酶液。酶活反應(yīng)在30°C下進(jìn)行，用紫外分光光度計(jì)(UV-2100Spectrophotometer)檢測340nm處吸光度的增加來確定反應(yīng)體系中NADH的生成，蛋白的濃度采用Bradford方法測定。此外，利用同樣的樣品，本發(fā)明人還進(jìn)行了酶活測定體系pH8. O (其它條件不變)情況下的酶活測定，結(jié)果測定獲得的酶活非常弱，接近于無酶活性。UDP-GlcDH酶活的計(jì)算根據(jù)朗波爾定律Λ A= ε CL和酶活定義，其中Λ A為酶促反應(yīng)初期I分鐘吸光度的增加值，ε為NADH在340nm處的摩爾吸光系數(shù)，C為NADH濃度，L為比色皿厚度，本實(shí)驗(yàn)計(jì)算中ε取NADH微摩爾消光系數(shù)為O. 0062 4 ^ · cnT1。本實(shí)驗(yàn)測定酶活體系為Iml (Vt)，加入超聲后粗酶液是為5 μ I (Ve)，比色皿厚度為1cm，其中參照Bradford方法測定粗蛋白濃度為Cp(mg/ml),貝U有酶活(U/mg) = AA . Vt/(2 ε L . Ve .Cp)，將本實(shí)驗(yàn)體系代入數(shù)值即為MF-GlcDH酶活的計(jì)算公式U/mg=AA/(0. 062 X Cp)。由圖2可以看出在不同誘導(dǎo)條件下和培養(yǎng)條件下均出現(xiàn)UDP-GlcDH的超表達(dá)(含有空載體的YK537 (pBLMVL2)具有宿主菌自身的ugd基因，但是由于其微量表達(dá)和測定體系靈敏度等原因，在本酶活測定中未檢測到UDP-GlcDH酶活)，尤其是采取前述“2.溫度誘導(dǎo)”中F條件所得YK537 (pBLYugd)的UDP-GlcDH的酶活性最高。綜上可見，大腸桿菌UDP-GlcDH的克隆和表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建成功，結(jié)合兩階段升溫誘導(dǎo)方式可以顯著提高M(jìn))P-G1 cDH活性，延長UDP-GlcDH在胞內(nèi)保持高活性的持續(xù)時(shí)間，從而為后續(xù)hasA基因參與在大腸桿菌中高表達(dá)HA提供了保證，為HA的鏈延伸提供了充足的時(shí)間。并且，MF-GlcDH在pH7. 5的體系中酶活性最高，大腸桿菌在此pH值下的生長情況也較好。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種重組表達(dá)尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的方法，包括 (1)提供表達(dá)構(gòu)建物，其從5’至3’端依次包括以下操作性連接的元件噬菌體啟動(dòng)子，編碼尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的基因ugd ； (2)將(I)的表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行升溫誘導(dǎo)表達(dá)，迅速升溫到38-42°C，振蕩培養(yǎng)8-15小時(shí)。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，升溫誘導(dǎo)表達(dá)方法選自 迅速升溫到40-42°C進(jìn)行恒定溫度誘導(dǎo)； 迅速升溫到40-42°C誘導(dǎo)1±0. 5小時(shí)后迅速降溫至38±0. 5°C進(jìn)行恒定溫度誘導(dǎo)；或 添加終濃度為O. 5-2g/L酵母抽提物后迅速升溫到42±0. 5°C誘導(dǎo)1±0. 5小時(shí)后迅速降溫至38±0. 5°C進(jìn)行恒定溫度誘導(dǎo)。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，在升溫誘導(dǎo)表達(dá)前，還包括先將經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌接種到LB培養(yǎng)基中，在37±0. 5°C,200r/min培養(yǎng)12±2小時(shí)；之后轉(zhuǎn)接到M9CAA培養(yǎng)基中，在30±0. 5°C，200r/min培養(yǎng)12±2小時(shí)；再次轉(zhuǎn)接到M9CAA 培養(yǎng)基中，在 35±O. 5°C,200r/min 培養(yǎng) 2±O. 5 小時(shí)。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的基因ugd的核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，在步驟(2)之后，還包括步驟(3):在pH7. 5±0. I條件下測定誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的酶活。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，測定酶活的方法包括 將大腸桿菌培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行菌體破碎，之后在30°C下進(jìn)行酶活反應(yīng)，相對于Iml酶反應(yīng)體系包括 5mmol · L 1UDP-葡萄糖，5mmol · I. 1NAD + , 10Ommol · L 1Tris-HCl 及 5 μ I 酶液；酶活反應(yīng)后，測定340nm吸光度，根據(jù)朗波爾定律ΛΑ= ε CL和酶活定義獲得酶活值。
7.一種用于重組表達(dá)尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的構(gòu)建物，其從5’至3’端依次包括以下操作性連接的元件 噬菌體匕啟動(dòng)子，編碼尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的基因ugd。
8.如權(quán)利要求7所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述的編碼尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的基因ugd的序列如SEQ ID NO: I所示。
9.如權(quán)利要求8所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述的構(gòu)建物是表達(dá)載體。
10.一種基因工程菌，其特征在于，其包含權(quán)利要求7-9任一所述的構(gòu)建物。
全文摘要
本發(fā)明涉及尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶的表達(dá)及酶活測定。本發(fā)明人將PL啟動(dòng)子、大腸桿菌UDP-GlcDH的基因(ugd)串聯(lián)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，將所述表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核菌株，利用該菌株溫度誘導(dǎo)表達(dá)UDP-GlcDH，并對其酶活性進(jìn)行測定。采用該表達(dá)方法得到的UDP-GlcDH，表達(dá)效率高，酶活性高，酶活性保持的持續(xù)時(shí)間長。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102936603SQ20121042780
公開日2013年2月20日 申請日期2012年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月31日
發(fā)明者錢悅, 侯永泰, 吳劍英, 陳奕涵, 甘人寶, 周慶瑋, 榮紹豐 申請人:上海昊海生物科技股份有限公司