專利名稱：具有改良生長特性的植物及其制備方法
具有改良生長特性的植物及其制備方法
本申請是申請日為2006年11月7日的、發(fā)明名稱為“具有改良生長特性的植物及其制備方法”的中國專利申請200680049144. X(PCT/EP2006/068190)的分案申請。發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明一般地涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，并涉及相對于相應(yīng)的野生型植物或其他對照植物改良植物生長特性的方法。更具體地，本發(fā)明涉及改良植物生長特性的方法，包括調(diào)節(jié)植物中I類同源域亮氨酸拉鏈(Homeodomainleucine ^ipper,HDZip)hox5多肽或其同源物編碼核酸的表達(dá)；或包括調(diào)節(jié)植物中硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NRT)或其同源物編碼核酸的表達(dá); 或包括調(diào)節(jié)植物中命名為增產(chǎn)蛋白質(zhì)16 (Iield Enhancing Protein 16，下文稱為YEP16) 的多肽或其同源物編碼核酸的表達(dá)；或包括調(diào)節(jié)植物中I型糖原合酶激酶(I型shaggy樣激酶)或其同源物編碼核酸的表達(dá)。本發(fā)明還涉及具有調(diào)節(jié)的I類HDZip hox5多肽或其同源物編碼核酸表達(dá)的植物；或具有調(diào)節(jié)的NRT多肽或其同源物編碼核酸表達(dá)的植物；或具有調(diào)節(jié)的YEP16編碼核酸表達(dá)的植物；或具有調(diào)節(jié)的I型shaggy樣激酶或其同源物編碼核酸表達(dá)的植物；所述植物相對于相應(yīng)的野生型或其他對照植物具有改良的植物生長特性。本發(fā)明還提供在發(fā)明方法中有用的構(gòu)建體。
發(fā)明背景
鑒于世界人口不斷增長而農(nóng)業(yè)可耕種土地面積逐漸縮小，激起提高農(nóng)業(yè)效率方面的研究。作物和園藝改良的常規(guī)方法是利用選育技術(shù)來鑒定具有期望特性的植物。然而， 這樣的選育技術(shù)有若干缺點，即這些技術(shù)通常是勞動密集型的，并且產(chǎn)生通常含有異源遺傳組分的植物，這些遺傳組分并非總是產(chǎn)生從親本植物遺傳的期望性狀。分子生物學(xué)的進(jìn)展已經(jīng)允許人類改造動物和植物的種質(zhì)(germplasm)。植物遺傳工程需要分離和操作遺傳物質(zhì)(通常為DNA或RNA的形式)及隨后將所述遺傳物質(zhì)引入植物。這樣的技術(shù)能夠提供具有多種改良的經(jīng)濟(jì)、農(nóng)業(yè)或園藝性狀的作物或植物。
特別具有經(jīng)濟(jì)利益的性狀是產(chǎn)率。產(chǎn)率通常定義為來自作物經(jīng)濟(jì)價值的可測量產(chǎn)出。其可以根據(jù)數(shù)量和/或質(zhì)量來定義。產(chǎn)率直接取決于幾種因素，例如器官的數(shù)量和大小，植物構(gòu)造(例如分枝數(shù))，種子產(chǎn)量，葉衰老等等。根的發(fā)育，營養(yǎng)吸收和脅迫耐受性也是決定產(chǎn)率的重要因素。因此優(yōu)化上述因素之一可以有助于增加作物的產(chǎn)率。
種子產(chǎn)率是尤其重要的性狀，原因在于許多植物的種子對于人類和動物營養(yǎng)至關(guān)重要。諸如谷物、稻類、小麥、蕓苔和大豆的作物占人類總卡路里攝取量的一半以上，不論是通過種子本身的直接消耗，還是通過由加工的種子所飼養(yǎng)的肉類產(chǎn)品的消耗。它們也是工業(yè)加工所用的糖類、油類和多類代謝物的來源。種子含有胚(新的芽和根的來源)和胚乳 (在萌發(fā)和幼苗早期生長過程中胚生長的營養(yǎng)源)。種子的發(fā)育涉及許多基因，并且需要代謝物自根、葉和莖轉(zhuǎn)移至正在生長的種子。特別是胚乳，吸收糖類、油類和蛋白質(zhì)的代謝前體，將其合成為貯存高分子，以使谷粒長大。
特別具有經(jīng)濟(jì)利益的另一性狀在于具有提高的非生物脅迫耐受性。非生物脅迫是導(dǎo)致全世界作物損失的首要原因，使大多數(shù)主要作物植物的平均產(chǎn)率下降超過50%(Wang等，Planta (2003) 218:1-14)。非生物脅迫可以因干旱、鹽度、極端溫度、化學(xué)毒性和氧化脅迫而引起。提高植物非生物脅迫耐受性的能力將對全世界的農(nóng)場主帶來重大的經(jīng)濟(jì)利益， 并將使我們能夠在不利條件下以及在否則將不可能栽培作物的地域來栽培作物。
增加植物種子產(chǎn)率的能力將在諸如農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中具有許多應(yīng)用，包括觀賞植物的生產(chǎn)、樹木栽培、園藝和森林業(yè)。增加產(chǎn)率也可以用于在生物反應(yīng)器中使用的藻類生產(chǎn)(用于諸如藥物、抗體或疫苗等物質(zhì)的生物技術(shù)生產(chǎn)，或用于有機(jī)廢物的生物轉(zhuǎn)化)及其它這類領(lǐng)域。技術(shù)背景
同源域亮氨酸拉鏈(HDZip)蛋白
同源域亮氨酸拉鏈(HDZip)蛋白構(gòu)成轉(zhuǎn)錄因子家族，其特征在于存在DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HD)和鄰近的亮氨酸拉鏈(Zip)基序。同源域通常包括60個保守的氨基酸殘基，形成與DNA結(jié)合的螺旋I-環(huán)-螺旋2-轉(zhuǎn)角-螺旋3。此DNA結(jié)合位點通常為假回文結(jié)構(gòu)。 亮氨酸拉鏈鄰近于同源域的C-末端，包括幾個七肽重復(fù)單位(至少4個)，其中通常每隔6 個氨基酸就出現(xiàn)亮氨酸(偶爾為纈氨酸或異亮氨酸)。亮氨酸拉鏈對于蛋白質(zhì)二聚化非常重要。二聚化是DNA結(jié)合的前提條件(Sessa等(1993)EMBO J 12 (9) : 3507-3517)，并且可以發(fā)生在兩個相同的HDZip蛋白之間(同源二聚體)，或者兩個不同的HDZip蛋白之間(異源二聚體)。
同源域基因存在于所有真核細(xì)胞中，并構(gòu)成擬南芥(Arabidopsisthaliana)中至少89個成員的基因家族。亮氨酸拉鏈本身也見于除植物外的真核細(xì)胞中。不過，同源域和亮氨酸拉鏈兩者同時存在卻是植物所特有的(在擬南芥89個蛋白質(zhì)中的至少47個中發(fā)現(xiàn))，并且除了維管·束植物之外，還已經(jīng)在蘚類植物(moss)中遇到(Sakakibara等(2001) Mol Biol Evol 18(4) :491-502)。亮氨酸拉鏈則位于同源域的C-末端，這兩個要素特征彼此重疊3個氨基酸。
基于序列相似性標(biāo)準(zhǔn)，已將擬南芥HDZip基因分為四個不同的類別=HDZip I至 IV(Sessa 等(1994) In Plant Molec Biol, 412-426 頁)。同其他三類 HDZip 蛋白一樣，I 類 HDZip蛋白在同源域和亮氨酸拉鏈以外的一級氨基酸結(jié)構(gòu)方面差異相當(dāng)大。I類HDZip蛋白的特征還在于同源域和亮氨酸拉鏈內(nèi)的兩個特定特征
I)在同源域中，除了不變的氨基酸Leu16Trp48Phe49Asn51Arg53之外，第46位為 Ala(A)，而第 56 位為 Try(W)(或者偶爾為 Phe(F)) (Sessa 等(1997) J Mol Biol 274(3) :303-309;見圖I)，這稱為I類同源域，且
2)亮氨酸拉鏈包括6個七肽，除了呈現(xiàn)7個七肽的蕨類植物Ceratopteris richardii之外(每個七肽內(nèi)的位置命名為a、b、C、d、e、f和g位,保守的亮氨酸在d位； Sakakibara 等(2001)Mol Biol Evol 18(4) :491-502;見圖 2)。HDZip II、III 和 IV 呈現(xiàn)僅具5個七肽的亮氨酸拉鏈。
至于其DNA結(jié)合特性，I類HDZip蛋白優(yōu)先結(jié)合在中心位置處重疊的5bp半位點， 即 CAA (A/T)ATTG(Sessa 等(1993)EMBO J 12 (9):3507-3517)。
已證明不同的HDZip蛋白要么激活要么阻遏轉(zhuǎn)錄。已利用報告基因(熒光素酶； Henriksson等(2005)Plant Phys 139:509-518)在擬南芥中證明1 類HDZip ATHB1、_5、_6和-16在擬南芥葉子的瞬時表達(dá)測定中作為轉(zhuǎn)錄激活因子起作用。利用另一報告基因(葡萄糖醛酸酶；Meijer等(2000)MolGen Genet 263:12-21)，證明兩種稻I類HDZip蛋白即 0shox4和0shox5在稻細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的瞬時表達(dá)測定中作為激活因子起作用。相反,兩種稻II類HDZip蛋白即Oshoxl和0shox3在相同的試驗中作為轉(zhuǎn)錄阻遏物起作用(Meijer 等(1997)Plant J 11:263-276;Meijer 等(2000)，同前)。
已證明多種I類HDZip蛋白參與光應(yīng)答并且參與脫落酸(ABA)/水缺乏相關(guān)的應(yīng)答 (Hjdlstriim等(2003)Plant Cell Environ 26:1127-1136)。過表達(dá) I 類 HDZip ATHBU -3、-13、-20和-23的轉(zhuǎn)基因擬南芥表明這些基因參與調(diào)控子葉以及葉子發(fā)育 (Aoyama 等(1995)Plant Cell 7:1773-1785;Hanson(2000)In Comprehensive summaries of Uppsala Dissertationsfrom the Faculty of Science and Technology, Uppsala)。 ATHB3、-13、-20和-23基因彼此相似，并構(gòu)成I類HDZip —個獨(dú)特的亞類。由于當(dāng)這些基因組成型表達(dá)的時候引起相似的子葉形狀變化，它們被稱為尖子葉(nointedcotyledon,P0C) HDZip基因。Hanson推斷在系統(tǒng)發(fā)生方面密切相關(guān)的I類HDZip蛋白大多數(shù)情況下在功能方面也是相關(guān)的。
硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NRT)
植物營固著生活，不得不依賴于土壤中的資源提供養(yǎng)分。土壤中的氮主要作為胺鹽或硝酸鹽存在。植物的氮吸收可以借助于三種N03_吸收系統(tǒng)進(jìn)行N03_濃度大于ImM時激活的低親和力轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，針對I μ M至ImMNCV濃度的組成型及誘導(dǎo)型高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。 這三種吸收系統(tǒng)以復(fù)雜的方式調(diào)控。硝酸鹽一經(jīng)吸收，便被轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡或被還原成亞硝酸鹽，后者依次又在葉綠體中被進(jìn)一步代謝。硝酸鹽也可以在質(zhì)外體(apoplasm)中再次分泌，或分泌至木質(zhì)部轉(zhuǎn)運(yùn)至枝條(shoot)。根細(xì)胞中負(fù)責(zé)硝酸鹽吸收的蛋白質(zhì)(NRT，硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)屬于所謂的主要易化子超家族(MajorFacilitator Superfamily),包括參與小分子溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)，且長度通常為450至600個氨基酸，具有12個跨膜結(jié)構(gòu)域。NRT蛋白被歸為兩個家族NRT1 和 NRT2 (Crawford&Glass, Trends Plant Sci. 3，389-395，1998)， 且由多基因家族編碼。NRT蛋白序列高度保守，例如來自蘚類植物的NRT2蛋白與來自雙子葉植物的NRT2蛋白享有60%的序列同一性，在雙子葉植物群中，NRT2蛋白之間的序列同一性約為81%，而單子葉NRT2蛋白的序列同一性可高達(dá)89%。Orsel等深入研究了擬南芥的 NRT2家族蛋白(Plant Physiol. 129，886-896，2002)。該家族包括7個成員，分布在三條染色體上。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)保守，且7個NRT2蛋白中的5個在初生植物的根中偏好表達(dá)。就結(jié)構(gòu)而言，NRT2蛋白包括跨越蛋白質(zhì)約90%的MFS_1結(jié)構(gòu)域，以及C-末端跨膜結(jié)構(gòu)域。MFS_1 結(jié)構(gòu)域本身據(jù)推測包括10或11個跨膜結(jié)構(gòu)域。
認(rèn)為NRT2蛋白主要與聞未和力轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有關(guān)。在聞等植物中，這種聞未和力吸收系統(tǒng)據(jù)認(rèn)為受由NRT2和NAR組成的雙蛋白復(fù)合物控制，所述NAR蛋白功能尚不清楚(Zhou 等 FEBS Letters 466，225-227; Tong 等 Plant J. 41，442-450，2005)。過表達(dá) NRT2 提高這種高親和力吸收系統(tǒng)的能力(Fraisier等Plant J. 23，489-496)。NRT2可能也發(fā)揮硝酸鹽感受器的功能(Little 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102，13693-13698，2005)。
Mori等研究了過表達(dá)稻NRT2基因的轉(zhuǎn)基因稻類植物，并表明硝酸鹽饑餓的幼苗與野生型植物相比具有更好的N03_吸收。Good等(US20050044585)公開了氮利用蛋白質(zhì)特別是轉(zhuǎn)氨酶水平升高的轉(zhuǎn)基因植物，處于可能是也可能不是脅迫誘導(dǎo)型根特異性啟動子的控制之下。這些植物表現(xiàn)出氮吸收效率提高，但是未報道對于種子產(chǎn)率的影響。另外，這篇文獻(xiàn)還公開在植物中過表達(dá)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并不為這些植物帶來有利的生長特性。此外， 尚未在正常生長條件下或就完整的植物生命周期研究過NRT蛋白。
增產(chǎn)蛋白質(zhì)16(YEP16)
YEP16多肽與Fli7O-ATP合酶中ATPase δ結(jié)構(gòu)域δ亞基的N-末端結(jié)構(gòu)域享有一定的相似性(有關(guān)δ亞基的的細(xì)節(jié)，參閱InterPro IPR000711)。
Shaggv 樣激酶
植物shaggy樣激酶由多基因家族編碼。已發(fā)現(xiàn)擬南芥基因組含有10個shaggy樣激酶編碼基因，它們被歸為四個不同的亞家族。不同家族成員的蛋白質(zhì)序列在全部激酶結(jié)構(gòu)域中高度保守，不過N-和C-末端區(qū)域差異相當(dāng)大，表明多種植物shaggy樣激酶參與多種多樣的生物過程，例如激素信號傳導(dǎo)、發(fā)育和脅迫應(yīng)答?；诘鞍踪|(zhì)序列的同源性，可將植物shaggy樣激酶歸為四型(I-IV)，其中四型中的每一型都參與不同的過程(見

圖13)。 除了可以獲得擬南芥shaggy樣激酶的全長cDNA序列以外，還可以在公共數(shù)據(jù)庫中獲得來自歐洲油菜(Brassica napus)、紫花苜猜(Medicagosativa)、煙草(Nicotiana tabacum)、 稻(oryza sativa)、矮牽牛(Petunia hybrida)和玉蜀黍(Zea mays)等物種的 shaggy 樣激酶的全長 cDNA序列。AtGSKl為II型擬南芥shaggy樣激酶的編碼基因，已經(jīng)報道其補(bǔ)償酵母鈣調(diào)磷酸酶突變體的鹽敏感表型。已經(jīng)表明幼苗中同一 shaggy樣激酶的產(chǎn)生被NaCl 和脫落酸誘導(dǎo)。已經(jīng)報道AtGSKl基因的過量產(chǎn)生誘導(dǎo)脅迫應(yīng)答基因和花青素累積，并改變胞內(nèi)陽離子水平，從而導(dǎo)致鹽和干旱耐受性增強(qiáng)。
考慮到不同型的shaggy樣激酶公知參與多種多樣的生物過程，我們令人驚訝地發(fā)現(xiàn)兩種不同型的shaggy樣激酶參與同一生物過程即脅迫應(yīng)答。我們出乎意料地發(fā)現(xiàn)不同于II型的其他型shaggy樣激酶能夠賦予植物對非生物脅迫增加的耐受性。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)植物中I類HDZip hox5多肽或其同源物編碼核酸的表達(dá)；或調(diào)節(jié)植物中硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NRT)或其同源物編碼核酸的表達(dá)；或調(diào)節(jié)植物中YEP16多肽編碼核酸的表達(dá)；或調(diào)節(jié)植物中I型shaggy樣激酶或其同源物的表達(dá),使植物相對于相應(yīng)的野生型植物或其他對照植物具有改良的植物生長特性。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明因此提供了改良植物生長特性的方法，包括調(diào)節(jié)植物中I類HDZip hox5多肽或其同源物編碼核酸的表達(dá)；或包括調(diào)節(jié)植物中NRT或其同源物編碼核酸的表達(dá)；或包括調(diào)節(jié)植物中YEP16多肽編碼核酸的表達(dá)；或包括調(diào)節(jié)植物中I型shaggy樣激酶或其同源物的表達(dá)。
選擇合適的對照植物是實驗設(shè)置的常規(guī)部分，并且可以包括相應(yīng)的野生型植物或不含目的基因的相應(yīng)植物。對照植物通常為同一植物物種，或者甚至與待評估植物為同一品種。對照植物還可以是待評估植物的無效合子(nullizygote)。如本文所用的“對照植物”不僅指完整植物，而且指植物部分，包括種子和種子部分。
有利地，實施根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生相對于相應(yīng)的野生型植物或其他對照植物生長特性改良的植物，特別是產(chǎn)率增加、生長改良、生物量改良、構(gòu)造改良、細(xì)胞分裂改良和非生物脅迫耐受性提高中的一個或多個方面。
文中所定義的術(shù)語“增加的產(chǎn)率”是指以下任意一個或多個方面的增加，每種都相對于相應(yīng)的野生型或其他對照植物而言(i)植物一個或多個部分，特別是地上(可收獲) 部分增加的生物量(重量)，或增加的根生物量，增加的根體積，增加的根數(shù)量，增加的根直徑或增加的根長度(粗根或細(xì)根)，或任何其它可收獲部分增加的生物量；(ii)增加的種子總產(chǎn)率，這包括種子生物量(種子重量)的增加，并且其可以是每棵植株或單粒種子基礎(chǔ)上的種子重量增加和/或每公頃或每英畝種子重量的增加；(iii)增加的每個圓錐花序的花 (小花floret)的數(shù)量，其表達(dá)為飽滿種子數(shù)占初期(primary)圓錐花序數(shù)的比率；(iv)增加的種子飽滿率(以百分比表示，為飽滿種子數(shù)占小花數(shù)的比例)；(v)增加的(飽滿)種子數(shù)量；(vi)增加的種子大小，這也可以影響種子的組成；(vii)增加的種子體積，這也可以影響種子的組成(包括油、蛋白質(zhì)和糖的總含量和組成)；(viii)增加的(單個或平均) 種子面積；(ix)增加的(單個或平均)種子長度；(X)增加的(單個或平均)種子寬度；(X) 增加的(單個或平均)種子周長；(xi)增加的收獲指數(shù)(HI)，其表達(dá)為可收獲部分如種子的產(chǎn)率占總生物量的比率；和(xii)增加的千粒重(TKW)，這通過計數(shù)飽滿種子數(shù)量及其總重量外推得到。增加的TKW可來自于種子大小和/或種子重量的增加。增加的TKW還可以來自胚大小和/或胚乳大小的增加。
以谷物為例，產(chǎn)率增加可以表現(xiàn)為以下一個或多個方面每公頃或每英畝建立的植物數(shù)量的增加，每棵植株谷穗數(shù)量的增加，行數(shù)、行粒數(shù)、粒重量、千粒重、谷穗長度/直徑的增加，種子飽滿率(其為飽滿種子數(shù)除以種子總數(shù)乘以100)的增加，等等。 以稻為例， 產(chǎn)率增加可以表現(xiàn)為以下一個或多個方面每公頃或每英畝的植物數(shù)量、每棵植株的圓錐花序數(shù)量、每個圓錐花序的小穗數(shù)量、每個圓錐花序的花朵(小花)數(shù)量(其表達(dá)為飽滿種子數(shù)占初期圓錐花序的比率)、種子飽滿率(其為飽滿種子數(shù)除以種子總數(shù)乘以100)的增加、千粒重的增加，等等。
由于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物具有增加的產(chǎn)率，相對于對照植物在其生命周期相應(yīng)階段的生長速率而言，這些植物可能呈現(xiàn)增加的生長速率(至少在其部分生命周期中)。增加的生長速率可以是植物的一個或多個部分(包括種子)特有的，或者可以基本上遍及整株植物。具有增加生長速率的植物可以具有更短的生命周期。植物的生命周期可以理解為表示從成熟干種子生長至植物產(chǎn)生類似于起始材料的成熟干種子階段所需的時間。此生命周期可以受到諸如早期活力、生長速率、綠度指數(shù)、開花時間和種子成熟速度等因素的影響。生長速率的增加可以出現(xiàn)在植物生命周期的一個或多個階段，或者出現(xiàn)在基本上整個植物生命周期的過程中。在植物生命周期的早期階段，生長速率的增加可以反映出增強(qiáng)的活力。生長速率的增加可以改變植物的收獲周期，使植物能夠比其他可能的情況更晚播種和/或更快收獲(類似的效果可以通過較早的開花時間獲得)。如果生長速率充分增加，可以允許播種同一植物物種更多的種子(例如完全在一個常規(guī)的生長期內(nèi)，播種和收獲稻類植物、接著播種和收獲更多的稻類植物)。與之類似，如果生長速率充分地增加，可以允許進(jìn)一步播種不同植物物種的種子(例如播種和收獲稻類植物，隨后，例如，播種和任選的收獲大豆、馬鈴薯或任何其他適宜的植物)。在一些作物植物的情況下，也有可能從同一根莖收獲增加的次數(shù)。改變植物的收獲周期可以導(dǎo)致每英畝年生物量產(chǎn)量的增加(這是由于(比方說在一年中)任何特定植物可以生長和收獲次數(shù)的增加)。與野生型對應(yīng)物相比，生長速率的增加還能夠在更廣闊的地域栽培轉(zhuǎn)基因植物，因為種植作物的地域限制通常由種植時(早季)或收獲時(晚季)不利的環(huán)境條件所決定。如果縮短收獲周期，可以避免這類不利條件?？梢杂缮L曲線獲取多種參數(shù)，來確定生長速率，這類參數(shù)可以是=T-Mid(植物達(dá)到其最大大小50%所需的時間)和T-90 (植物達(dá)到其最大大小90%所需的時間)，等等。
實施本發(fā)明的方法產(chǎn)生與具有增加的生長速率的植物。因此，本發(fā)明提供了增加植物生長速率的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)植物中I類HDZiphox5多肽或其同源物編碼核酸的表達(dá)；或包括調(diào)節(jié)植物中NRT或其同源物編碼核酸的表達(dá)；或包括調(diào)節(jié)植物中YEP16多肽編碼核酸的表達(dá)；或包括調(diào)節(jié)植物中I型shaggy樣激酶或其同源物的表達(dá)。
無論植物處于非脅迫條件下，還是植物相對于對照植物接觸多種脅迫，都發(fā)生產(chǎn)率和/或生長速率的增加。通常植物通過更加緩慢的生長來應(yīng)答脅迫接觸。在重度脅迫條件下，植物甚至可以完全停止生長。另一方面，輕度脅迫在文中定義為當(dāng)植物接觸時不導(dǎo)致植物完全停止生長喪失重新開始生長能力的任何脅迫。本發(fā)明意義上的輕度脅迫導(dǎo)致脅迫植物的生長與非脅迫條件下的對照植物相比，下降低于40%、35%或30%，優(yōu)選低于25%、20% 或15%，更優(yōu)選低于14%、13%、12%、11%或10%或更低。由于耕作方法(灌溉、施肥、殺蟲劑處理)的發(fā)展，栽培的作物植物常常不會遇到重度脅迫。因此，由輕度脅迫誘導(dǎo)的受損的生長通常成為農(nóng)業(yè)中不期望的因素。輕度脅迫可以是植物接觸的日常的生物和/或非生物(環(huán)境)脅迫。非生物脅迫可以因干旱或過量的水、無氧脅迫、鹽脅迫、化學(xué)毒性、氧化脅迫以及熱、冷或冰凍溫度而引起。非生物脅迫可以是由于水脅迫(特別是由于干旱)、鹽脅迫、氧化脅迫或離子脅迫引起的滲透脅迫。生物脅迫一般是由病原體如細(xì)菌、病毒、真菌和昆蟲引起的那些脅迫。
實施根據(jù)本發(fā)明的方法導(dǎo)致植物對非生物脅迫具有增加的耐受性。如Wang等 (Planta(2003) 218:1-14)所報道的那樣，非生物脅迫引起一系列的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)和分子變化，對植物生長和生產(chǎn)力造成不利影響。已知干旱、鹽度、極端溫度和氧化脅迫相互聯(lián)系，并可以通過相似的機(jī)制誘導(dǎo)生長和細(xì)胞損害。例如，干旱和/或鹽度主要表現(xiàn)為滲透脅迫，導(dǎo)致破壞細(xì)胞中的穩(wěn)態(tài)和離子分布。氧化脅迫通常與高溫或低溫、鹽度或干旱脅迫相伴，可以引起功能及結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的變性。所以，這些多種多樣的環(huán)境脅迫通常激活相似的細(xì)胞信號傳導(dǎo)路徑和細(xì)胞應(yīng)答，例如應(yīng)激蛋白的產(chǎn)生，抗氧化劑的上調(diào)、相容溶質(zhì)的累積以及生長阻抑。
既然多種多樣的環(huán)境脅迫激活相似的路徑，本發(fā)明關(guān)于干旱脅迫的舉例說明(在本發(fā)明涉及I類HDZip hox5多肽及其編碼核酸的用途的情況下)不應(yīng)視為局限于干旱脅迫，而更應(yīng)視為表明I類HDZip hox5多肽或其同源物總體而言參與非生物脅迫的屏顯信息 (screen)。此外，本發(fā)明的方法可以在非脅迫條件下或者輕度干旱條件下實施，以提供相對于相應(yīng)的野生型或其他對照植物具有改良的生長特性(特別是增加的產(chǎn)率)的植物。本文所用的術(shù)語“非脅迫”條件優(yōu)選為植物最可能遇到的那些不顯著背離平常氣候的條件及其他非生物條件，優(yōu)選為允許植物最佳生長的那些條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉給定地點的正常土壤條件和氣候條件。
在干旱脅迫和高鹽度脅迫之間報道存在特別高程度的“對話”(Rabbani等(2003) Plant Physiol 133:1755-1767)。因此，顯然I類HDZiphox5多肽或其同源物連同其賦予植物干旱耐受性的用途一起，也將會在保護(hù)植物抵御多種其他非生物脅迫方面找到用武之地。與之相似，顯然I型shaggy樣激酶(如本文所定義的)連同其賦予植物鹽耐受性的用途一起，也將會在保護(hù)植物抵御多種其他非生物脅迫方面找到用武之地。此外，Rabbani等 (2003, Plant Physiol 133:1755-1767)報道，在雙子葉和單子葉植物之間存在脅迫耐受性和應(yīng)答的相似的分子機(jī)制。因此本發(fā)明的方法可以有利地應(yīng)用于任何植物。
如本文所定義的術(shù)語“非生物脅迫”應(yīng)理解為表示如下一個或多個方面水脅迫 (由于干旱或過量的水)、無氧脅迫、鹽脅迫、溫度脅迫(由于熱、冷或冰凍溫度)、化學(xué)毒性脅迫和氧化脅迫。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，非生物脅迫是滲透脅迫，選自水脅迫、鹽脅迫、氧化脅迫和離子脅迫。優(yōu)選水脅迫是干旱脅迫。術(shù)語鹽脅迫不局限于常見鹽，而可以是如下任何一種或多種NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2 等等。
增加的非生物脅迫耐受性表現(xiàn)為非生物脅迫條件下增減的植物產(chǎn)率。特別是在本發(fā)明涉及I類HDZip hox5多肽及其編碼核酸的用途的情況下，此類增加的產(chǎn)率可以包括如下一個或多個方面增加的飽滿種子數(shù)、增加的種子總產(chǎn)率、增加的每個圓錐花序的花數(shù)、 增加的種子飽滿率、增加的HI、增加的TKW、增加的根長度或增加的根直徑，其中每一方面都相對于相應(yīng)的野生型植物而言。
實施本發(fā)明的方法提供具有增加的非生物脅迫耐受性的植物。實施本發(fā)明的方法提供相對于在相當(dāng)條件下生長的相應(yīng)野生型植物或其他對照植物而言在非脅迫條件下或輕度干旱條件下生長的具有改良生長特性(特別是增加的產(chǎn)率)的植物。
根據(jù)本發(fā)明，提供了增加植物非生物脅迫耐受性的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)植物中I類HDZip hox5多肽或其同源物編碼核酸的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，非生物脅迫是滲透脅迫，選自如下一個或多個方面水脅迫、鹽脅迫、氧化脅迫和離子脅迫。優(yōu)選水脅迫是干旱脅迫。
本發(fā)明還提供了提高植物非生物脅迫耐受性的方法，包括增加植物中I型shaggy 樣激酶或其同源物的活性，所述I型shaggy樣激酶具有(i)與SEQ ID NO: 147所示的氨基酸序列至少77%的序列同一性；以及(ii)基序I R/H/V/N/Q E/G LK G/N和基序II K Q/ N CXXX G/A/S，其中X可以是任意氨基酸。
本發(fā)明還提供了改良在非脅迫條件下或輕度干旱條件下生長的植物的生長特性 (特別是增加產(chǎn)率)的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)植物中NRT多肽或其同源物編碼核酸的表達(dá) (特別是增加其表達(dá))。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法在非脅迫條件下發(fā)生產(chǎn)率和/或生長速率的增加。
特別是在本發(fā)明涉及I類HDZip hox5多肽及其編碼核酸的用途的情況下，實施本發(fā)明的方法導(dǎo)致綠度指數(shù)相對于相應(yīng)的野生型植物增加。如本文所定義的綠度指數(shù)是數(shù)碼相機(jī)記錄的植物圖像中黃色象素的比例(表達(dá)為％)。增加的綠度指數(shù)可以表明降低或延遲的衰老，這依次能夠延長植物的光合作用活性，進(jìn)而帶來本領(lǐng)域眾所周知的多種有益效果。
本發(fā)明因此提供了增加植物綠度指數(shù)的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)植物中I類 HDZip hox5多肽或其同源物編碼核酸的表達(dá)。優(yōu)選綠度指數(shù)在非生物脅迫條件下增加，更優(yōu)選在水脅迫條件下，還優(yōu)選在干旱脅迫條件下。
在本發(fā)明的方法包括調(diào)節(jié)植物中I類HDZip hox5多肽或其同源物編碼核酸表達(dá)的情況下，優(yōu)選增加的產(chǎn)率包括如下一個或多個方面增加的飽滿種子數(shù)、增加的種子總產(chǎn)率、增加的每個圓錐花序的花數(shù)、增加的種子飽滿率、增加的HI、增加的TKW、增加的根長度或增加的根直徑，其中每一方面都相對于相應(yīng)的野生型或其他對照植物而言。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方面，提供了相對于相應(yīng)的野生型或其他對照植物增加植物產(chǎn)率的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)植物中I類HDZip hox5多肽或其同源物編碼核酸的表達(dá)。
在本發(fā)明的方法包括調(diào)節(jié)植物中NRT或其同源物編碼核酸表達(dá)的情況下，優(yōu)選所產(chǎn)生的植物具有增加的產(chǎn)率，且更特別地具有增加的生物量和/或增加的種子產(chǎn)率。優(yōu)選增加的種子產(chǎn)率包括如下一個或多個方面的增加(飽滿)種子數(shù)量、種子總重量、種子大小、千粒重和收獲指數(shù)，其中每一方面都相對于相應(yīng)的野生型或其他對照植物而言。
根據(jù)本發(fā)明另一優(yōu)選的方面，提供了增加植物產(chǎn)率的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)植物中NRT多肽或其同源物編碼核酸的表達(dá)(優(yōu)選增加其活性和/或表達(dá))。
在本發(fā)明的方法包括調(diào)節(jié)植物中YEP16多肽編碼核酸表達(dá)的情況下，優(yōu)選增加或提高的產(chǎn)率是相對于相應(yīng)野生型植物種子產(chǎn)率而言提高的種子產(chǎn)率。
因此根據(jù)本發(fā)明另一優(yōu)選的方面，提供了相對于相應(yīng)的野生型或其他對照植物增加種子產(chǎn)率的方法，包括調(diào)節(jié)植物中YEP16多肽或其同源物編碼核酸的表達(dá)。
在本發(fā)明的方法包括調(diào)節(jié)植物中I型shaggy樣激酶或其同源物編碼核酸表達(dá)的情況下，優(yōu)選改良的生長特性是提高的非生物脅迫耐受性。
根據(jù)本發(fā)明另一優(yōu)選的方面，提供了提高植物非生物脅迫耐受性的方法，包括調(diào)節(jié)植物中I型shaggy樣激酶或其同源物編碼核酸的表達(dá)(優(yōu)選增加其活性和/或表達(dá))， 所述I型shaggy樣激酶具有⑴與SEQ ID NO: 147所示的氨基酸序列至少77%的序列同一性；以及( )基序 I R/H/V/N/Q E/GLK G/N 和基序 II K Q/N CXXX G/A/S，其中 X 可以是任意氨基酸。
因此可以有利地對任何植物應(yīng)用本發(fā)明的方法。
本文所用術(shù)語“植物”包括整株植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括種子、 枝條、莖、葉、根(包括塊莖)、花以及組織和器官，其中上述每一種都包含目的基因/核酸。術(shù)語“植物”也涵蓋植物細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織、胚、分生組織區(qū)、配子體、孢子體、花粉和小孢子，同樣其中上述每一種都包含目的基因/核酸。
在本發(fā)明方法中尤其有用的植物包括所有屬于植物界(Viridiplantae)超家族的植物，特別是單子葉和雙子葉植物，包括選自以下的飼料或飼料豆科植物、觀賞植物、 糧食作物、喬木或灌木金合歡屬物種(Acacia spp.)、槭樹屬物種(Acer spp.)、稱猴桃屬物種(Actinidia spp·)、七葉樹屬物種(Aesculus spp·)、新西蘭貝殼杉(Agathis australis)、Albizia amara、三色極稷(Alsophila tricolor)、須芒草屬物種(Andropogon spp.)、落花生屬物種(Arachis spp)、模榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、黃苗(Astragalus cicer)、Baikiaea pluri juga、樣木屬物種(Betula spp.)、蕓苔屬物種(Brassica spp.)、木攬(Bruguiera gymnorrhiza)、Burkea africana、紫鉚(Butea frondosa)、Cadaba far inosa、朱綴花屬物種(Calliandra spp)、茶(Camellia sinensis)、 美人蕉(Canna indica)、辣椒屬物種(Capsicum spp·)、決明屬物種(Cassia spp.)、距瓣豆(Centroema pubescens)、木瓜屬物種(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、 小果咖啡(Coffea arabica)、Colophospermummopane、變異小冠花(Coronillia varia)、 枸子(Cotoneaster serotina)、山楂屬物種(Crataegus spp.)、香瓜屬物種(Cucumis spp.)、柏木屬物種(Cupressusspp. ) > Cyathea dealbata、木梨(Cydonia oblonga)、圓球柳杉(Cryptomeriajaponica)、香茅屬物種(Cymbopogon spp. )、Cynthea dealbata、木梨(Cydoniaoblonga)、Dalbergia monetaria、大葉骨碎補(bǔ)(Davallia divaricata)、山馬蟲皇屬物種(Desmodium spp·)、迪卡蘭(Dicksonia squarosa)、Diheteropogonamplectens、 Dioclea spp、德扁豆屬物種(Dolichos spp. )、Dorycnium rectum、錐穗稗(Echinochloa pyramidalis)、Ehrartia spp.、穆子(Eleusine coracana)、Eragrestis spp.、剌桐屬物種(Erythrina spp.)、按屬物種(Eucalyptus spp.)、Euclea schimperi、金茅 (Eulalia villosa)、養(yǎng)麥屬物種(Fagopyrum spp·)、費(fèi)約羅(Feijoa sellowiana)、草雷屬物種(Fragaria spp·)、千斤拔屬物種(Flemingia spp)、Freycinetia banksii、 Geranium thunbergii、 銀杏(Ginkgobiloba) Λ Glycine javanica、Gliricidia spp、陸地棉(Gossypium hirsutum)、銀禪屬物種(Grevillea spp. )、Guibourtia coleosperma、巖黃甚屬物種(Hedysarum spp.)、牛鞭草(Hemarthia altissima)、扭黃茅(Heteropogoncontortus)、大麥(Hordeum vulgare)、Hyparrhenia rufa、小連翅 (Hypericumerectum)、Hyperthelia dissoluta、白花庭藍(lán)(Indigo incarnata)、鸞尾屬物種(Iris spp. )、Leptarrhena pyrolifolia、胡枝子屬物種(Lespediza spp·)、萬苣屬物種 (Lettuca spp. )、Leucaena leucocephala、Loudetia simplex、Lotonusbainesii、百脈根屬物種(Lotus spp·)、硬皮豆(Macrotyloma axillare)、蘋果屬物種(Malus spp.)'Manihot esculenta、紫花苜猜(Medicago sativa)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、大蕉 (Musa sapientum)、煙草屬物種(Nicotianum spp·)、驢食草屬物種(Onobrychis spp·)、 Ornithopus spp.、稻屬物種(Oryza spp.)、非洲雙翼豆(Peltophorum africanum)、狼尾草屬物種(Pennisetum spp·)、鱷梨(Persea gratissima)、碧冬煎屬物種(Petunia spp·)、 菜豆屬物種(Phaseolus spp·)、模榔竹(Phoenix canariensis)、Phormiumcookianum、 石楠屬物種(Photinia spp.)、白云杉(Picea glauca)、松屬物種(Pinus spp.)、豌豆(Pisum sativum)、新西蘭羅漢松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、 Pogonarthria squarrosa、楊屬物種(Populus spp.)、牧豆樹(Prosopis cineraria)、花方萁松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobiumstellatum、西洋梨(Pyrus communis)、櫟屬物種(Quercus spp.)、Rhaphiolepsisumbellata、美味棒花掠(Rhopalostylis sapida)、 Rhus natalensis、歐洲醋粟(Ribes grossularia)、荼薦子屬物種(Ribes spp.)、洋槐 (Robinia pseudoacacia)、薔薇屬物種(Rosa spp·)、懸鉤子屬物種(Rubus spp·)、柳屬物種(Salix spp.) λ Schyzachyrium sanguineum、金松(Sciadopitys verticillata)、 北美紅杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、兩色蜀黍 (Sorghum bicolor)、菠菜屬物種(Spinacia spp. )、Sporobolus fimbriatus、Stiburus alopecuroidesλStylosanthos humilis、葫蘆荼屬物種(Tadehagi spp)、落羽杉(Taxodium distichum)、阿拉伯黃背草(Themeda triandra)、車軸草屬物種(Trifolium spp.)、小麥屬物種(Triticum spp.)、異葉鐵杉(Tsugaheterophylla)、越桔屬物種(Vaccinium spp.)、野豌豆屬物種(Vicia spp·)、葡萄(Vitis vinifera)、錐穗沃森花(Watsonia pyramidata)、 馬蹄蓮(Zantedeschiaaethiopica)、玉蜀黍(Zea mays)、覓屬植物(amaranth)、洋薊 (artichoke)、天門冬屬(asparagus)、椰菜(broccoli)、孢子甘藍(lán)(Brussels sprouts)、 甘藍(lán)、蕓苔(canola)、胡蘿卜、花椰菜、序菜、羽衣甘藍(lán)(collard greens)、亞麻、無頭甘藍(lán) (kale)、兵豆屬(lentil)、油菜籽油菜(oilseed rape)、秋葵(okra)、洋蔥、馬鈴薯、稻、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜(squash)、荼和藻類等等。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，植物為作物植物如大豆、向日葵、蕓苔、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、馬鈴薯或煙草。還優(yōu)選植物為單子葉植物如甘蔗。更優(yōu)選植物是谷類，例如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、高粱或燕麥。
可用于本發(fā)明方法的I類HDZip hox5多肽及其同源物和I類HDZip hox5核酸/ 基因
如本文所定義的術(shù)語“I類HDZip hox5多肽或其同源物”是指這樣的多肽，其從 N-末端到C-末端包含⑴酸性盒；和(ii) I類同源域；和(iii)具有5個以上七肽的亮氨酸拉鏈。
另外，I類HDZip hox5多肽或其同源物可以包含如下任一或兩者兼而有之(a) Trp尾巴；和(b) RPFF氨基酸基序，其中R為Arg，P為Pro，而F為Phe。在此基序中允許進(jìn)行任意位置上的一個或多個保守改變，和/或任意位置上的一個或兩個非保守改變。當(dāng)從 N-末端到C-末端研究蛋白質(zhì)時，(b)中的基序位于酸性盒之前。
如上文所定義的I類HDZip hox5多肽的一個實例從N-末端到C末端包含⑴ 酸性盒；和( ) I類同源域；和(iii)具有5個以上七肽的亮氨酸拉鏈；并且另外包含(a) Trp尾巴；和(b) RPFF氨基酸基序，其中R為Arg，P為Pro，而F為PhejBSEQ ID NO: 2所示。更多這樣的實例在本文實施例I表A中給出。
I類HDZip hox5多肽或其同源物由I類HDZip hox5核酸/基因編碼。因此如本文所定義的術(shù)語“I類HDZip hox5核酸/基因”是編碼如上文定義的I類HDZip hox5多肽或其同源物的任何核酸/基因。
利用本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)技術(shù)如通過序列比對，可以容易地鑒定I類HDZip hox5多肽或其同源物。用于比較的序列比對方法是本領(lǐng)域眾所周知的，此類方法包括 GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA 和 TFASTA GAP 利用 Needleman 和 Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48; 443-453)的算法尋找可以使匹配數(shù)最大化并使空位數(shù)最小化的兩完整序列的比對。BLAST 算法(Altschul 等(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10)計算序列同一性百分比，并統(tǒng)計分析兩序列間的相似性。實施BLAST分析的軟件可通過國家生物技術(shù)信息中心公開地獲得。例如，使用獲自 http://clustalw. genome. jp/sit-bin/nph-ClustalW 的 ClustalW 多重序列比對算法(I. 83版)，采用缺省的兩兩比對參數(shù)和百分比評分方法，可以容易地鑒定包含I類同源域和具5個以上七肽的亮氨酸拉鏈的I類HDZip hox5同源物?？梢赃M(jìn)行細(xì)微的手工編輯，以優(yōu)化保守基序間的比對，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。
可以利用專業(yè)數(shù)據(jù)庫來鑒定I類HDZip hox5蛋白的多種結(jié)構(gòu)域,如同源域和亮氨酸拉鏈，例如:SMART (Schultz 等(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95，5857-5864; Letunic 等(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244;http://smart. embl~heidelberR.de/)、 InterPro (Mulder 等，(2003)NucI.Acids.Res. 31, 315-318;http://www. ebi. ac. uk/ interpro/)、Prosite(Bucher 和 Bairoch (1994)，A generalized profile syntax for biomolecuIar sequencesmotifs and its function in automatic sequence interpretation. (In)ISMB-94;Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems forMolecular Biology. Altman R. , Brutlag D. ,Karp P. , Lathrop R. , Searls D 編著，53-61 頁，AAAIPress, Menlo Park; Hulo 等，Nucl. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004)，http://www. expasy. orR/prosite/)或 Pfam(Bateman等，Nucleic Acids Research 30(1) :276-280(2002),http://www. sanger. ac. uk/ Software/Pfam/)。可以利用專業(yè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行亮氨酸拉鏈預(yù)測和七肽鑒定，如2ZIP, 該數(shù)據(jù)庫將標(biāo)準(zhǔn)卷曲螺旋預(yù)測算法和特征性亮氨酸重復(fù)單位的模擬搜索結(jié)合在一起(Bornberg-Bauer 等(1998)Computational Approaches to Identify Leucine Zippers, Nucleic Acids Res. , 26(11):2740-2746, http://2zip. moIgen, mpg. de)。
此外，也可以容易地鑒定酸性盒的存在?？梢岳脕碜訣xPASy服務(wù)器的軟件程序計算一級氨基酸組成(以％表示)，以確定多肽結(jié)構(gòu)域是否富含特定的氨基酸，特別是 ProtParam 工具(Gasteiger E 等(2003) ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. NucleicAcids Res 31:3784-3788)。然后可以將目的蛋白質(zhì)的組成與Swiss-Prot蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫中的平均氨基酸組成(以％表示)進(jìn)行比較。在該Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫內(nèi)，平均Asp(D)和Glu(E)含量分別為5. 3%和6. 6%，組合平均值為11. 9%。作為實例，SEQ ID NO: 2的酸性盒含9. 1%的D和54. 5%的E，組合平均值為 63. 6%。如本文所定義的那樣，酸性富含盒具有高于Swiss-Prot蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)平均氨基酸組成(以％表示)的組合Asp (D)和Glu (E)含量(以％表示)。酸性盒可以是轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的一部分。已根據(jù)真核轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的氨基酸含量對其進(jìn)行了分類， 且主要的類別包括酸性、谷氨酰胺富含和脯氨酸富含激活結(jié)構(gòu)域(Rutherford等(2005) Plant J. 43(5) : 769-88,及其中的參考文獻(xiàn))。
I類HDZip hox5多肽或其同源物中的一部分蛋白質(zhì)還包含RPFF氨基酸基序，其中 R為Arg, P為Pro,而F為Phe。在此基序中允許進(jìn)行任意位置上的一個或多個保守改變， 和/或任意位置上的一個或兩個非保守改變。當(dāng)從N-末端到C-末端研究蛋白質(zhì)時，此基序位于酸性盒之前(見圖2)。可以利用上文所述的用于比較的序列比對方法來鑒定RPFF 的存在。在一些情況下，可以調(diào)整缺省參數(shù)，以更改搜索的嚴(yán)格度。例如利用BLAST，可以增加用于報告數(shù)據(jù)庫序列匹配事件的統(tǒng)計學(xué)意義閾值(稱為“預(yù)期”值，即E值)，以顯示低嚴(yán)格度的匹配事件。通過這種方式可以鑒定短的幾乎精確匹配的事件。
I類HDZip hox5多肽或其同源物中的一部分蛋白質(zhì)還包含Trp尾巴。如本文所定義的Trp尾巴是蛋白質(zhì)C-末端包含至少一個Trp殘基的最后10個氨基酸(見圖2)。
I類HDZip hox5多肽或其同源物的實例(由括號中的多核苷酸序列登錄號編碼) 在表A中給出。
應(yīng)該理解的是，落入“I類HDZip hox5多肽或其同源物”定義的序列不限于表A 中所給出的氨基酸序列，而是任何這樣的多肽，其從N-末端到C末端包含(i)酸性盒；和(ii)I類同源域；和(iii)具有5個以上七肽的亮氨酸拉鏈，均適用于實施本發(fā)明的方法。
I類HDZip hox5多肽或其同源物具有DNA結(jié)合活性，優(yōu)選結(jié)合在中心位置處重疊的5bp半位點，即CAA(A/T)ATTG，如在酵母單雜交試驗中檢測到的那樣(Meijer等(2000) Mol Gen Genet 263:12-21)。在稻細(xì)胞懸浮液的瞬時測定中，與⑶S報告基因共同轟擊I 類HDZip hox5多肽導(dǎo)致染色斑點數(shù)目增加，這些斑點顏色也更深(Meijer等，同前)。此測定可用于證明I類HDZip hox5多肽或其同源物的激活因子功能。
可用于本發(fā)明方法的NRT多肽及其同源物和編碼它們的核酸
如本文所定義的術(shù)語“NRT或其同源物”是指這樣的多肽，其包含(i)MFS_l結(jié)構(gòu)域(Pfam登錄號PF07690, InterPro登錄號IPR011701)，接著的(ii)跨膜結(jié)構(gòu)域。圖6給19出了一個實例。優(yōu)選NRT蛋白或其同源物具有NRT活性如高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)，并且不含 PTR2 結(jié)構(gòu)域(Pfam 登錄號 PF00854, InterPro 登錄號 IPR000109)。
優(yōu)選NRT蛋白或其同源物包含標(biāo)簽序列I (SEQ ID NO: 57):
(N/S) (Y/P)(T/G/S/A)ff(I/V/L)(F/L/T)(V/A/F/L)(L/V/M/I)(L/T/I/A/N)YG(Y/ F) (S/C/T) (M/F/Y)G(V/I)EL (T/S) (T/I/V) (D/G/N)N(V/I/N) (I/V) (A/S/H/V) (E/Q/G)Y。
還優(yōu)選NRT蛋白或其同源物包含如下一項或多項
標(biāo)簽序列2 (SEQ ID NO: 58):
LG (P/A) RYG (C/T) AF (L/S);
標(biāo)簽序列3 (SEQ ID NO: 59):
STFAA (A/R) PL (V/1) (P/V) (I/L/V) IR (D/E) NL (N/D) (L/P);
標(biāo)簽序列4(SEQ ID NO:60):
VRF (L/M) IGF (S/C) LA;
標(biāo)簽序列5(SEQ ID N0:61):
FVSC (Q/R) Yff (M/T) S (T/V) (M/S) (F/M)。
更優(yōu)選NRT蛋白或其同源物包含如下一項或多項
標(biāo)簽序列6 (SEQ ID NO: 62):
K(A/Q/S/M/H/T)D(I/V)GNAGVASV(S/T)G(S/A)I(F/L)SR(L/G);
標(biāo)簽序列7 (SEQ ID NO: 63):
NG(L/T/C)A(A/G)GWG;
標(biāo)簽序列8 (SE ID NO: 64):
G (A/S) G (L/V/Q) TQ (L/P) (L/V/I) (F/E) F (T/S/D) (S/T) (S/A/T)。
最優(yōu)選NRT蛋白如SEQ ID NO: 53所示。
跨膜結(jié)構(gòu)域長約15至30個氨基酸，并且通常由形成α螺旋的疏水殘基構(gòu)成。它們通常是基于疏水性預(yù)測的(例如Klein等，Biochim. Biophys. Acta 815, 468, 1985;或 Sonnhammer等，In J. Glasgow,T. Littlejohn, F. Major,R. Lathrop, D. Sankoff和 C. Sensen 編著，Proceedings of the SixthInternational Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology,第 175-182 頁，Menlo Park, CA, 1998. AAAI Press)。
可選地，NRT蛋白的同源物按照遞增的優(yōu)選順序與SEQ ID N0:53所示的氨基酸具有 50%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、 72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的總體序列同一性。總體序列同一性利用全局比對算法進(jìn)行確定，例如GAP程序(GCG Wisconsin軟件包，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法,優(yōu)選采用缺省參數(shù)。
可以利用專業(yè)數(shù)據(jù)庫來鑒定NRT蛋白的多種結(jié)構(gòu)域，例如SMART(Schultz等 (1998)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 95，5857-5864;Letunic 等(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244;http://smart. embl~heidelberR. de/)、InterPro(Mulder 等,(2003) NucI. Acids. Res. 31，315-318;http://www. ebi. ac. uk/interpro/)、Prosite (Bucher 和 Bairoch(1994), Ageneralized profile syntax for biomolecular sequences motifs and itsfunction in automatic sequence interpretation. (In)ISMB-94;Proceedings2ndInternational Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R·，Brutlag D. , Karp P. , Lathrop R. , Searls D 編著，53-61 頁，AAAIPress，Menlo Park;Hulo 等，NucI. Acids. Res. 32:D134-D137，(2004)，http://www. expasy. org/ prosite/)或 Pfam (Bateman 等，Nucleic AcidsResearch 30 (I) : 276-280 (2002)，http: // www. sanger. ac. uk/Software/Pfam/)0
搜索和鑒定NRT同源物的方法完全落入本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之類。這類方法包括將計算機(jī)可讀形式SEQ ID N0:1或2所代表的序列與公共數(shù)據(jù)庫中可用的序列進(jìn)行 t匕較，如 MIPS (http://mips, gsf. de/)、GenBank (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Genbank/index, html)或 EMBL 核苷酸數(shù)據(jù)庫(http://www. ebi. ac. uk/embl/index, html)，使用本領(lǐng)域公知的序列比對或比較算法，如GAP(Needleman和Wunschj J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970))、BESTFIT (使用 Smith 和 Waterman 的局部同源性算法(Advances in Applied Mathematics 2; 482-489 (1981)))、BLAST (Altschul，S. F.，Gish, W.，Miller, W. ,Myers, E. W. &Lipman, D. J.，J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))、FASTA 和 TFASTA (W. R. Pearson 和 D. J. LipmanProc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448 (1988))。執(zhí)行 BLAST 分析的軟件可從國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)公開地獲得。
落入“NRT多肽或其同源物”定義的蛋白質(zhì)的實例包括稻類蛋白質(zhì)以及來自其他物種的蛋白質(zhì)，如玉蜀黍、蘆華(Phragmites australis)、大麥(Hordeum vulgare)、小麥 (Triticum aestivum)、歐洲油菜、蕃煎(Lycopersiconesculentum)、煙草、胡蘿卜(Daucus carota)、歐洲山楊(Populus tremulus)、Lotus japonica、桃(Prunus persica)、大豆 (Glycine max)和擬南芥，等等。NRT蛋白實例的非限制性列表在本文實施例14的表I中全A屮 口 ED ο
不過，考慮來自其他植物分類如蘚類植物或蕨類植物的NRT蛋白可以等同地用于本發(fā)明的方法。例如，蘚類植物小立碗蘚(Physcomitrellapatens)擁有至少5種NRT蛋白 (GenBank 登錄號 BAD00097、BAD00098、BAD00099、BADOO100、BADOO101)。
應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語“NRT多肽或其同源物”不局限于SEQ ID NO:53所示的或表I中所給出的序列，而是任何滿足如下標(biāo)準(zhǔn)的多肽包含功能性MFS_1結(jié)構(gòu)域，和一個或多個SEQ ID NO: 57至64的保守標(biāo)簽序列，以及位于上文定義的MFS_1結(jié)構(gòu)域C-末端的跨膜結(jié)構(gòu)域； 或者與SEQ IDNO:53的序列具有至少50%的序列同一性，均適用于實施本發(fā)明的方法。
為確定NRT的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，采用Tong等(Plant J. 41，442-450，2005)所述的硝酸鹽吸收測定。簡言之，在爪蟾(Xenopus)卵母細(xì)胞中表達(dá)目的NRT蛋白，并測量15N富集硝酸鹽的吸收。如果需要，可以共表達(dá)nar2基因，以增加硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)。
可選地，NRT蛋白或其同源物的活性可以通過在稻栽培種日本晴(Oryza sativa cultivar Nipponbare)中表達(dá)處于G0S2啟動子控制之下的NRT多肽或其同源物來進(jìn)行測定，這將產(chǎn)生與相應(yīng)的野生型植物相比具有增加的地上生物量和/或增加的種子產(chǎn)率的植物。這種種子產(chǎn)率的增加可以通過多種方式衡量，例如種子總重量、飽滿種子數(shù)量或種子總數(shù)的增加，收獲指數(shù)的增加或每個圓錐花序花朵的增加。
NRT蛋白或其同源物由NRT核酸/基因編碼。因此如本文所定義的術(shù)語“NRT核酸 /基因”是編碼如上文定義的NRT蛋白或其同源物的任何核酸/基因。
可用于本發(fā)明方法的YEP16多肽及其同源物和編碼它們的核酸
術(shù)語“YEP16多肽”是指SEQ ID NO: 128的序列。YEP16多肽的同源物是指按照遞增的優(yōu)選順序與SEQ ID NO: 128的氨基酸序列享有至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%序列同一性的任何氨基酸序列。因此本文述及的“YEP16多肽或其同源物編碼核酸”是指編碼如上文定義的YEP16多肽的任何核酸序列，或編碼如上文定義的YEP16多肽同源物的任何核酸。
可用于本發(fā)明方法的I型ShaRRy樣激酶及其同源物和編碼它們的核酸
如本文所定義的術(shù)語“I型shaggy樣激酶或其同源物”是指這樣的多肽，其具有 ⑴與SEQ ID NO: 147所示的氨基酸序列至少77%的序列同一性；以及(ii)基序I :R/H/V/ N/Q E/G LK G/N和基序II K Q/N CXXXG/A/S，其中X可以是任意氨基酸。滿足前述要求的多肽能夠使I型shaggy樣激酶區(qū)別于其他型shaggy樣激酶。
可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)容易地鑒定落入上文定義的“I型 shaggy樣激酶或其同源物”。例如,通過序列比對可以容易地確定與SEQ ID NO: 147所示的氨基酸具有至少77%同一性的多肽。用于比較的序列比對方法是本領(lǐng)域眾所周知的，此類方法包括 GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA 和 TFASTA。GAP 利用 Needleman 和 Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453，1970)的算法尋找可以使匹配數(shù)最大化并使空位數(shù)最小化的兩完整序列的比對。BLAST算法計算序列同一性百分比，并統(tǒng)計分析兩序列間的相似性。實施BLAST分析的軟件可通過國家生物技術(shù)信息中心公開地獲得。例如，利用VNTI AlignX多重比對程序,基于改進(jìn)的 clustal W 算法(InforMax, Bethesda, MD, http: //www. informaxinc. com), 采用缺省設(shè)置，空位開放罰分為10且空位延伸為O. 05，通過將查詢氨基酸序列與已知的I 型shaggy樣激酶序列進(jìn)行比對(例如參見圖14所示的比對)，可以容易地鑒定與SEQ ID NO: 147所示的氨基酸具有至少77%同一性的shaggy樣激酶或其同源物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員也能夠容易地鑒定這樣的序列，其具有基序I :R/H/V/N/Q E/G LK G/N和基序II K Q/N CXXX G/A/S，其中X可以是任意氨基酸。這可以通過進(jìn)行比對以及搜索同源區(qū)域來實現(xiàn)。
下表I顯示了 SEQ ID NO: 147的序列中發(fā)現(xiàn)的基序I :R/H/V/N/Q E/GLK G/N和基序II:K Q/N CXXX G/A/S(其中X可以是任意氨基酸)，以及同源序列中相應(yīng)的基序。表I 所示的總體同一性百分比系將SEQ ID NO: 147與表中所示的登錄號進(jìn)行比較(全長序列對全長序列)。
表I :1型shaggy樣激酶及其同源物中發(fā)現(xiàn)的保守基序
權(quán)利要求
1.相對于相應(yīng)的野生型植物增加植物產(chǎn)率的方法，包括調(diào)節(jié)植物中I類同源域亮氨酸拉鏈(HDZip)hox5多肽或其同源物編碼核酸的表達(dá)，和任選地選擇具有增加的產(chǎn)率的植物，其中所述I類HDZip hox5多肽或其同源物從N-末端到C-末端包含⑴酸性盒；和(ii)I類同源域；和(iii)具有5個以上七肽的亮氨酸拉鏈。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中所述I類HDZiphox5多肽或其同源物還包含如下之一或兩者兼而有之(a) Trp尾巴；和(b)RPFF氨基酸基序,其中R為Arg, P為Pro,而F為Phe，且在此基序中允許進(jìn)行任意位置上的一個或多個保守改變，和/或任意位置上的一個或兩個非保守改變。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的方法，其中通過引入遺傳修飾來實現(xiàn)所述調(diào)節(jié)的表達(dá)，優(yōu)選在編碼I類HDZip hox5多肽或其同源物的基因座引入遺傳修飾。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中通過T-DNA激活、TILLING、定點誘變或定向進(jìn)化之一實現(xiàn)所述遺傳修飾。
5.相對于相應(yīng)的野生型植物增加植物產(chǎn)率的方法，包括在植物中引入和表達(dá)I類HDZip hox5核酸或其變體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述變體為I類HDZiphox5核酸的部分，所述部分編碼的多肽從N-末端到C-末端包含(i)酸性盒；和(ii) I類同源域；和(iii)具有5個以上七肽的亮氨酸拉鏈。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述變體為能夠與I類HDZiphox5核酸雜交的序列，所述雜交序列編碼的多肽從N-末端到C-末端包含(i)酸性盒；和(ii) I類同源域；和(iii)具有5個以上七肽的亮氨酸拉鏈。
8.根據(jù)權(quán)利要求5至7的方法，其中所述I類HDZiphox5核酸或其變體在植物中過表達(dá)。
9.根據(jù)權(quán)利要求5至8中任一項的方法，其中所述I類HDZiphox5核酸或其變體是植物來源的，優(yōu)選來自單子葉植物，還優(yōu)選來自禾本科，更優(yōu)選核酸來自稻屬，最優(yōu)選來自稻。
10.根據(jù)權(quán)利要求5至9中任一項的方法，其中所述變體編碼I類HDZiphox5蛋白SEQID N0:2的直系同源物或旁系同源物。
11.根據(jù)權(quán)利要求5至10中任一項的方法，其中所述I類HDZiphox5核酸或其變體有效連接于組成型啟動子。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中組成型啟動子為G0S2啟動子，更優(yōu)選組成型啟動子為稻G0S2啟動子，還優(yōu)選組成型啟動子如基本上類似于SEQ ID N0:33或SEQ ID NO: 178的核酸序列所示，最優(yōu)選組成型啟動子如SEQ ID N0:33或SEQ ID NO: 178所示。
13.根據(jù)權(quán)利要求I至12中任一項的方法，其中所述增加的產(chǎn)率選自如下一個或多個方面增加的飽滿種子數(shù)、增加的種子總產(chǎn)率、增加的每個圓錐花序的花數(shù)、增加的種子飽滿率、增加的收獲指數(shù)(HI)、增加的千粒重(TKW)、增加的根長度或增加的根直徑，其中每一方面都相對于相應(yīng)的野生型植物而言。
14.根據(jù)權(quán)利要求I至13中任一項的方法，其中所述增加的產(chǎn)率在非生物脅迫條件下發(fā)生。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述非生物脅迫為滲透脅迫，選自如下一種或多種水脅迫、鹽脅迫、氧化脅迫和離子脅迫，優(yōu)選其中所述水脅迫是干旱脅迫。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15的方法,其中對所述非生物脅迫的耐受性表現(xiàn)為選自如下一個或多個方面的增加的產(chǎn)率增加的飽滿種子數(shù)、增加的種子總產(chǎn)率、增加的每個圓錐花序的花數(shù)、增加的種子飽滿率、增加的HI、增加的TKW、增加的根長度或增加的根直徑，其中每一方面都相對于相應(yīng)的野生型植物而言。
17.根據(jù)權(quán)利要求13至16的方法，其中所述增加的產(chǎn)率包括增加的綠度指數(shù)。
18.可根據(jù)權(quán)利要求I至17中任一項的方法獲得的植物、植物部分或植物細(xì)胞。
19.如下構(gòu)建體在根據(jù)權(quán)利要求5至17中任一項的方法中的用途，所述構(gòu)建體包含 (i) I類HDZip hox5核酸或其變體； ( )能夠驅(qū)動(i)中核酸序列表達(dá)的一個或多個控制序列；和任選的 (iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的構(gòu)建體，其中所述控制序列為組成型啟動子。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的構(gòu)建體，其中所述組成型啟動子為GOS2啟動子，優(yōu)選為稻GOS2啟動子，還優(yōu)選組成型啟動子如基本上類似于SEQ IDNO:33或SEQ ID NO: 178的核酸序列所示，最優(yōu)選組成型啟動子如SEQID NO:33或SEQ ID NO: 178所示。
22.用構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細(xì)胞，所述構(gòu)建體包含處于GOS2啟動子控制之下的I類HDZip hox5核酸或其變體。
23.產(chǎn)生相對于相應(yīng)的野生型植物具有增加的產(chǎn)率的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括 (i)在植物或植物細(xì)胞中引入和表達(dá)I類HDZip hox5核酸或其變體； ( )在促進(jìn)植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述增加的產(chǎn)率在增加的非生物脅迫條件下發(fā)生。
25.相對于相應(yīng)的野生型植物具有增加的產(chǎn)率的轉(zhuǎn)基因植物，所述增加的產(chǎn)率通過向所述植物中引入I類HDZip hox5核酸或其變體而產(chǎn)生。
26.根據(jù)權(quán)利要求18、22或25的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是單子葉植物如甘蔗，或者其中所述植物是谷類，如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、燕麥或高粱。
27.根據(jù)權(quán)利要求18、22、25或26中任一項的植物的可收獲部分。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的植物可收獲部分，其中所述可收獲部分是種子。
29.從根據(jù)權(quán)利要求26的植物、和/或從根據(jù)權(quán)利要求27或28的植物可收獲部分直接衍生的產(chǎn)品。
30.I類HDZip hox5核酸/基因或其變體、或I類HDZip hox5多肽或其同源物在相對于相應(yīng)的野生型植物增加植物產(chǎn)率中的用途。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的用途，其中所述增加的產(chǎn)率選自如下一個或多個方面增加的飽滿種子數(shù)、增加的種子總產(chǎn)率、增加的每個圓錐花序的花數(shù)、增加的種子飽滿率、增加的HI、增加的TKW、增加的根長度或增加的根直徑，其中每一方面都相對于相應(yīng)的野生型植物而H。
32.根據(jù)權(quán)利要求30或31的用途，其中所述增加的產(chǎn)率在增加的非生物脅迫條件下發(fā)生。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的用途，其中所述增加的產(chǎn)率包括增加的綠度指數(shù)。
34.I類HDZip hox5核酸/基因或其變體、或I類HDZip hox5多肽或其同源物作為分子標(biāo)記的用途。
35.相對于相應(yīng)的野生型植物改良植物生長特性的方法，包括調(diào)節(jié)植物中NRT多肽或其同源物編碼核酸的表達(dá)，和任選地選擇具有改良的生長特性的植物。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中通過引入遺傳修飾來實現(xiàn)所述調(diào)節(jié)的表達(dá)，優(yōu)選在編碼NRT多肽或其同源物的基因座引入遺傳修飾。
37.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中通過T-DNA激活、TILLING、定點誘變、同源重組或定向進(jìn)化之一實現(xiàn)所述遺傳修飾。
38.相對于相應(yīng)的野生型植物改良植物生長特性的方法，包括在植物中引入和表達(dá)NRT核酸或其變體。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述核酸編碼NRT蛋白SEQIDNO: 53的同源物，優(yōu)選所述核酸編碼NRT蛋白SEQ ID NO:53的直系同源物或旁系同源物。
40.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述變體為NRT核酸的部分或能夠與NRT核酸雜交的序列，所述部分或雜交序列編碼的多肽包含⑴MFS_1結(jié)構(gòu)域，(ii)位于所述MFS_1結(jié)構(gòu)域C-末端的跨膜結(jié)構(gòu)域，且優(yōu)選也具有NRT活性。
41.根據(jù)權(quán)利要求38至40中任一項的方法，其中所述NRT核酸或其變體在植物中過表達(dá)。
42.根據(jù)權(quán)利要求38至41中任一項的方法，其中所述NRT核酸或其變體是植物來源的，優(yōu)選來自單子葉植物，更優(yōu)選來自禾本科，最優(yōu)選核酸來自稻。
43.根據(jù)權(quán)利要求38至42中任一項的方法，其中所述NRT核酸或其變體有效連接于組成型啟動子。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述組成型啟動子為GOS2啟動子。
45.根據(jù)權(quán)利要求35至44中任一項的方法，其中所述改良的生長特性是增加的產(chǎn)率。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述增加的產(chǎn)率是增加的種子產(chǎn)率。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中所述增加的種子產(chǎn)率選自增加的種子總重量、增加的種子總數(shù)、增加的飽滿種子數(shù)、增加的每個圓錐花序的花數(shù)或增加的收獲指數(shù)。
48.可根據(jù)權(quán)利要求35至47中任一項的方法獲得的植物或植物細(xì)胞。
49.構(gòu)建體，其包含 (i)NRT核酸或其變體； (ii)能夠驅(qū)動(i)中核酸序列表達(dá)的一個或多個控制序列；和任選的 (iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的構(gòu)建體，其中所述控制序列為組成型啟動子。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的構(gòu)建體，其中所述組成型啟動子為GOS2啟動子。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的構(gòu)建體，其中所述GOS2啟動子如SEQID NO: 56第I至2193位核苷酸所示。
53.用根據(jù)權(quán)利要求49至52中任一項的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞。
54.產(chǎn)生與相應(yīng)的野生型植物相比具有增加的產(chǎn)率的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括 (i)在植物或植物細(xì)胞中引入和表達(dá)NRT核酸或其變體； (ii)在促進(jìn)植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞。
55.具有改良的生長特性的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，其通過向所述植物中引入NRT核酸或其變體產(chǎn)生。
56.根據(jù)權(quán)利要求48、53或55的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，其中所述植物是單子葉植物如甘蔗，或者其中所述植物是谷類，如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、燕麥或高粱；或者其中所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞來源于單子葉植物如甘蔗，或者其中所述植物是谷類，如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、燕麥或高粱。
57.根據(jù)權(quán)利要求48、53、55或56中任一項的植物的可收獲部分。
58.根據(jù)權(quán)利要求57的植物可收獲部分，其中所述可收獲部分是種子。
59.從根據(jù)權(quán)利要求56的植物、和/或從根據(jù)權(quán)利要求57或58的植物可收獲部分直接衍生的產(chǎn)品。
60.NRT核酸/基因或其變體、或NRT多肽或其同源物在相對于相應(yīng)的野生型植物改良植物生長特性、優(yōu)選增加產(chǎn)率、尤其是種子產(chǎn)率中的用途。
61.根據(jù)權(quán)利要求60的用途，其中所述種子產(chǎn)率為如下一個或多個方面增加的種子總重量、增加的種子總數(shù)、增加的飽滿種子數(shù)、增加的每個圓錐花序的花數(shù)或增加的收獲指數(shù)。
62.NRT核酸/基因或其變體、或NRT多肽或其同源物作為分子標(biāo)記的用途。
63.相對于相應(yīng)的野生型植物增加植物產(chǎn)率的方法，包括調(diào)節(jié)植物中YEP16多肽或其同源物編碼核酸的表達(dá)，其中所述YEP16多肽或其同源物按照遞增的優(yōu)選順序與SEQ IDNO: 128 的氨基酸序列具有至少 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%的序列同一性。
64.根據(jù)權(quán)利要求63的方法，其中所述調(diào)節(jié)的表達(dá)為增加的表達(dá)。
65.根據(jù)權(quán)利要求63或64的方法，其中通過引入遺傳修飾來實現(xiàn)所述調(diào)節(jié)的表達(dá)，優(yōu)選在編碼YEP16多肽或其同源物的基因座引入遺傳修飾。
66.根據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中通過T-DNA激活、TILLING、定點誘變或定向進(jìn)化之一實現(xiàn)所述遺傳修飾。
67.相對于相應(yīng)的野生型植物增加植物產(chǎn)率的方法，包括在植物中引入和表達(dá)編碼YEP16多肽或其同源物的核酸，其中所述YEP16多肽或其同源物按照遞增的優(yōu)選順序與SEQID NO: 128 的氨基酸序列具有至少 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%的序列同一性。
68.根據(jù)權(quán)利要求63至67中任一項的方法，其中所述YEP16多肽或其同源物靶向質(zhì)體。
69.根據(jù)權(quán)利要求68的方法，其中所述質(zhì)體是葉綠體。
70.根據(jù)權(quán)利要求67至69中任一項的方法，其中所述編碼YEP16多肽或其同源物的核酸能夠在能夠在降低的嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO: 127或SEQ ID NO: 129所示的核酸雜交。
71.根據(jù)權(quán)利要求67至70中任一項的方法，其中所述編碼YEP16多肽或其同源物的核酸按照遞增的優(yōu)選順序具有SEQ ID NO: 127或SEQ IDNO: 129所示核酸的至少100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575 個連續(xù)核苷酸。
72.根據(jù)權(quán)利要求67至71中任一項的方法，其中所述編碼YEP16多肽或其同源物的核酸編碼YEP16多肽SEQ ID NO: 128或SEQ ID NO: 130的直系同源物或旁系同源物。
73.根據(jù)權(quán)利要求67至72的方法，其中所述編碼YEP16多肽或其同源物的核酸在植物中過表達(dá)。
74.根據(jù)權(quán)利要求67至73中任一項的方法，其中所述編碼YEP16多肽或其同源物的核酸是植物來源的，優(yōu)選來自雙子葉植物物種，還優(yōu)選來自十字花科，更優(yōu)選來自擬南芥。
75.根據(jù)權(quán)利要求67至74中任一項的方法，其中所述編碼YEP16多肽或其同源物的核酸有效連接于種子特異性啟動子。
76.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，其中所述種子特異性啟動子為油質(zhì)蛋白啟動子，優(yōu)選來自稻的油質(zhì)蛋白啟動子，還優(yōu)選如SEQ ID NO:143所示。
77.根據(jù)權(quán)利要求63至76中任一項的方法，其中所述增加的產(chǎn)率是相對于相應(yīng)的野生型植物增加的種子產(chǎn)率。
78.根據(jù)權(quán)利要求77的方法，其中所述增加的種子產(chǎn)率選自如下任何一個或多個方面增加的種子重量、增加的飽滿種子數(shù)、增加的種子飽滿率和增加的收獲指數(shù)。
79.可根據(jù)權(quán)利要求63至78中任一項的方法獲得的植物或植物細(xì)胞。
80.構(gòu)建體，其包含 (i)編碼YEP16多肽或其同源物的核酸，其中所述YEP16多肽或其同源物按照遞增的優(yōu)選順序與 SEQ ID NO: 128 的氨基酸序列具有至少 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 的序列同一性； ( )能夠驅(qū)動(i)中核酸序列表達(dá)的一個或多個控制序列；和任選的 (iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。
81.根據(jù)權(quán)利要求80的構(gòu)建體，其中所述控制序列為種子特異性啟動子。
82.根據(jù)權(quán)利要求81的構(gòu)建體，其中所述所述種子特異性啟動子為油質(zhì)蛋白啟動子，優(yōu)選來自稻的油質(zhì)蛋白啟動子。
83.用根據(jù)權(quán)利要求80至82中任一項的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細(xì)胞。
84.產(chǎn)生相對于相應(yīng)的野生型植物具有增加的產(chǎn)率的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括 (i)在植物或植物細(xì)胞中引入和表達(dá)編碼YEP16多肽或其同源物的核酸，其中所述YEP16多肽或其同源物按照遞增的優(yōu)選順序與SEQ ID NO: 128的氨基酸序列具有至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 的序列同一性； ( )在促進(jìn)植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞。
85.由于編碼YEP16多肽或其同源物的核酸而相對于相應(yīng)的野生型植物具有增加的產(chǎn)率的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述YEP16多肽或其同源物按照遞增的優(yōu)選順序與SEQ ID NO: 128的氨基酸序列具有至少 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%的序列同一'I"生。
86.根據(jù)權(quán)利要求79、83或85的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是單子葉植物如甘蔗，或者其中所述植物是谷類，如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、燕麥或高粱。
87.根據(jù)權(quán)利要求79、83、85或86中任一項的植物的可收獲部分。
88.根據(jù)權(quán)利要求87的植物可收獲部分，其中所述可收獲部分是種子。
89.從根據(jù)權(quán)利要求86的植物、和/或從根據(jù)權(quán)利要求87或88的植物可收獲部分直接衍生的產(chǎn)品。
90.編碼YEP16多肽或其同源物的核酸在相對于相應(yīng)的野生型植物增加植物產(chǎn)率中的用途，其中所述YEP16多肽或其同源物按照遞增的優(yōu)選順序與SEQ ID NO: 128的氨基酸序列具有至少 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 的序列同一性。
91.根據(jù)權(quán)利要求90的用途，其中所述增加的產(chǎn)率選自如下一個或多個或所有方面增加的種子總重量、增加的飽滿種子數(shù)、增加的飽滿率和增加的收獲指數(shù)。
92.編碼YEP16多肽或其同源物的核酸作為分子標(biāo)記的用途，其中所述YEP16多肽或其同源物按照遞增的優(yōu)選順序與SEQ ID NO: 128的氨基酸序列具有至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 的序列同一性。
93.增加植物非生物脅迫耐受性的方法，包括增加植物中I型shaggy樣激酶或其同源物的活性，所述I型shaggy樣激酶具有(i)與SEQ ID NO: 147所示的氨基酸序列至少77%的序列同一性；以及(ii)基序 I R/H/V/N/QE/G LK G/N 和基序 II K Q/N CXXX G/A/S，其中X可以是任意氨基酸。
94.根據(jù)權(quán)利要求93的方法，其中通過引入遺傳修飾來實現(xiàn)所述增加的活性，優(yōu)選在編碼I型shaggy樣激酶的基因座引入遺傳修飾，所述基因座為包括目的基因以及編碼區(qū)上游或下游IOKB的基因組區(qū)。
95.根據(jù)權(quán)利要求94的方法，其中通過如下任一方法實現(xiàn)所述遺傳修飾定點誘變、同源重組、TILLING、T-DNA激活以及通過在植物中引入和表達(dá)編碼I型shaggy樣激酶或其同源物的核酸。
96.增加植物非生物脅迫耐受性的方法，包括在植物中引入和表達(dá)I型shaggy樣激酶編碼核酸/基因或其變體。
97.根據(jù)權(quán)利要求96的方法，其中所述變體為I型shaggy樣激酶編碼核酸/基因的部分，和/或為能夠與I型shaggy樣激酶編碼核酸/基因雜交的核酸，所述部分或雜交序列的長度至少為1，200個核苷酸，且所述部分或雜交序列編碼的多肽具有(i)與SEQ IDNO: 147所示的氨基酸序列至少77%的序列同一性；以及(ii)基序I :R/H/V/N/Q E/G LK G/N和基序II K Q/N CXXX G/A/S，其中X可以是任意氨基酸。。
98.根據(jù)權(quán)利要求96或97的方法，其中所述I型shaggy樣激酶編碼核酸/基因或其變體在植物中過表達(dá)。
99.根據(jù)權(quán)利要求96至98中任一項的方法，其中所述I型shaggy樣激酶編碼核酸/基因或其變體是植物來源的，優(yōu)選來自單子葉植物，還優(yōu)選來自禾本科，更優(yōu)選核酸來自稻屬，最優(yōu)選來自稻。
100.根據(jù)權(quán)利要求96至99中任一項的方法，其中所述I型shaggy樣激酶編碼核酸/基因或其變體有效連接于組成型啟動子，優(yōu)選GOS2啟動子，如來自稻的GOS2啟動子。
101.根據(jù)權(quán)利要求93至100中任一項的方法，其中所述非生物脅迫為如下任意一種或多種水脅迫、無氧脅迫、鹽脅迫、溫度脅迫、化學(xué)毒性脅迫和氧化脅迫。
102.根據(jù)權(quán)利要求93至101中任一項的方法，其中所述非生物脅迫為滲透脅迫，選自鹽脅迫、水脅迫、氧化脅迫、離子脅迫。
103.可根據(jù)權(quán)利要求93至102中任一項的方法獲得的植物或植物細(xì)胞，其中所述植物或植物細(xì)胞具有增加的I型shaggy樣激酶活性,和/或增加的I型shaggy樣激酶編碼核酸的表達(dá)。
104.構(gòu)建體，其包含 (i) I型shaggy樣激酶編碼核酸或其變體； ( )能夠驅(qū)動(i)中核酸序列表達(dá)的一個或多個控制序列；和任選的 (iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。
105.根據(jù)權(quán)利要求104的構(gòu)建體，其中所述控制序列包括組成型啟動子，優(yōu)選GOS2啟動子，如來自稻的GOS2啟動子。
106.用根據(jù)權(quán)利要求104或105的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞。
107.產(chǎn)生具有增加的非生物脅迫耐受性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括 (i)在植物或植物細(xì)胞中引入和表達(dá)I型shaggy樣激酶編碼核酸或其變體；和 ( )在促進(jìn)植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞。
108.根據(jù)權(quán)利要求107的方法，其中所述非生物脅迫為滲透脅迫，選自鹽脅迫、水脅迫、氧化脅迫、離子脅迫。
109.相對于相應(yīng)的野生型植物具有增加的非生物脅迫耐受性的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物具有增加的I型shaggy樣激酶活性,和/或增加的I型shaggy樣激酶編碼核酸的表達(dá)。
110.根據(jù)權(quán)利要求103、106和109中任一項的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物為作物植物如大豆、向日葵、蕓苔、苜猜、油菜籽、棉花、番爺、馬鈴薯或煙草，還優(yōu)選為單子葉植物如甘蔗，更優(yōu)選為谷類，如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、高粱或燕麥。
111.根據(jù)權(quán)利要求103、106、109至110中任一項的轉(zhuǎn)基因植物的可收獲部分，包括種子。
112.I型shaggy樣激酶編碼核酸或其變體、或I型shaggy樣激酶或其同源物在增加植物非生物脅迫耐受性中的用途。
113.根據(jù)權(quán)利要求112的用途，其中所述非生物脅迫為滲透脅迫，選自鹽脅迫、水脅迫、氧化脅迫、離子脅迫。
114.I型shaggy樣激酶編碼核酸或其變體、或I型shaggy樣激酶或其同源物作為分子標(biāo)記的用途。
全文摘要
本發(fā)明一般地涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，并涉及相對于相應(yīng)的野生型植物改良植物生長特性的方法。更具體地，本發(fā)明涉及改良植物生長特性的方法，包括調(diào)節(jié)植物中I類同源域亮氨酸拉鏈(HDZip)hox5多肽或其同源物編碼核酸的表達(dá)；或包括調(diào)節(jié)植物中硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NRT)或其同源物編碼核酸的表達(dá)；或包括調(diào)節(jié)植物中命名為增產(chǎn)蛋白質(zhì)16(稱為YEP16)的多肽或其同源物編碼核酸的表達(dá)；或包括調(diào)節(jié)植物中I型糖原合酶激酶(I型shaggy樣激酶)或其同源物編碼核酸的表達(dá)。本發(fā)明還涉及具有調(diào)節(jié)的I類同源域亮氨酸拉鏈(HDZip)hox5多肽或其同源物編碼核酸表達(dá)的植物；或具有調(diào)節(jié)的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NRT)或其同源物編碼核酸表達(dá)的植物；或具有調(diào)節(jié)的命名為增產(chǎn)蛋白質(zhì)16(下文稱為YEP16)的多肽編碼核酸表達(dá)的植物；或具有調(diào)節(jié)的I型糖原合酶激酶(I型shaggy樣激酶)或其同源物表達(dá)的植物；所述植物相對于相應(yīng)的野生型植物具有改良的植物生長特性。本發(fā)明還提供在發(fā)明方法中有用的構(gòu)建體。
文檔編號C12N5/10GK102925455SQ20121042794
公開日2013年2月13日 申請日期2006年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月7日
發(fā)明者A·I·桑茲莫林納羅, C·勒佐, Y·海茨費(fèi)爾德, V·布多夫, L·德維爾德, D·因澤, V·米隆諾弗 申請人:克羅普迪塞恩股份有限公司