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一株產紫杉醇的菌株的制作方法

文檔序號:414441閱讀:350來源:國知局
專利名稱:一株產紫杉醇的菌株的制作方法
技術領域
本發(fā)明涉及一株赤霉菌菌株。
背景技術
紫杉醇最初是從紅豆杉樹皮和木材中分離提純得到的天然抗腫瘤活性成分,屬于四環(huán)二帖類物質,它的系統(tǒng)名為5 β ,20-環(huán)氧-1,2 α,4,7 β ,10 β , 13 α六輕紫杉烷-II-烯-9酮-4,10- 二乙醇酯-2-苯甲酸酯-13-[ (2R,3S) N-苯甲酰-3'-苯基異絲氨酸酯,分子式為C-47H51N014。臨床實驗證明紫杉醇對卵巢癌、乳腺癌、小細胞肺癌和非小細胞肺癌、頭頸部腫瘤等有明顯療效。
目前臨床上使用的紫杉醇主要來源于紅豆杉屬植物,由于野生紅豆杉屬植物生長緩慢,天然更新能力弱,屬瀕危一級保護植物,資源十分有限,采摘多年生野生紅豆杉屬植物需國家林業(yè)局審批,手續(xù)繁瑣麻煩;而且在紅豆杉屬植物不同部位中紫杉醇含量又很低,造成紫杉醇緊缺、價格昂貴,藥源不足已成為紫杉醇的生產瓶頸。因此,國內外學者積極研究開發(fā)紫杉醇的新藥源。目前的方法主要有紅豆杉人工栽培、尋找紅豆杉的替代植物、化學全合成和半合成、組織與細胞培養(yǎng)、微生物發(fā)酵等途徑,其中利用微生物發(fā)酵法生產紫杉醇具有諸多優(yōu)點,如容易放大更利于工業(yè)化生產;可以通過改善培養(yǎng)環(huán)境和改進技術提高產量;易于利用如基因工程等較多手段篩選高產菌株;微生物相對于植物生長迅速、易于培養(yǎng)、應用的培養(yǎng)基也比較便宜,在紫杉醇化學全合成和半合成工藝復雜、成本較高的背景下,微生物發(fā)酵法生產紫杉醇成為當前紫杉醇藥源開發(fā)中的最新熱點;但是現(xiàn)有產紫杉醇的菌株,有些菌株產孢子時間較晚;有些菌株產孢子量低,或不產孢子,僅以菌絲體傳代;有些菌株需要使用成本非常高的促孢子生成培養(yǎng)基,加大了生產成本。但是,工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵生產時需要以孢子計數(shù)為基礎的某定量接種量作為前提,而采用菌絲體作為種子時,從目前技術來看接種是不能準確定量的,一定量的培養(yǎng)基需要與之適應的接種量,才能使菌體生長良好,從而使目標產物產量更高。一旦接種量掌握不好,輕則菌體生長不良,目標產物產量下降,利潤降低,重則在浪費生產原料的情況下目標產物產量不足,從而收不回成本,更不利于工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵生產接種。從保存時間和保存質量上來看,以孢子保存方式保存菌種,保存時間長,保存質量好,要優(yōu)于不產孢子的菌種以菌絲體保存的方式。另外,進行真菌物理化學誘變時,通常對象為其孢子,產孢子量大的菌更易獲得大數(shù)量的誘變基數(shù),從而保證高突變率,加快更適宜工業(yè)化生產、具優(yōu)良培養(yǎng)性狀、產物中雜質含量低、易于提取、最好兼具目標物高產的優(yōu)良菌株的篩選,相對于產孢子量低的菌株,產孢子量大的菌株經過誘變獲得優(yōu)良菌株的成本更低。野生山榛子從不被植物病蟲害侵犯,山榛子的枝葉和樹皮中含有紫杉醇等紫杉烷類、黃酮類、鞣質、多酚類等多種功能性成分;已有許多研究表明植物內生真菌可以產生與寄主植物相同或相似的功能性成分。針對產紫杉醇內生菌的分離篩選工作開展的較多,但未見有產紫杉醇赤霉菌的報道,另外產孢量大、產孢迅速、保證能夠以孢子接種方式進行工業(yè)化發(fā)酵生產從而使生產成本低的產紫杉醇菌未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是解決現(xiàn)有產紫杉醇的菌株,存在不產孢子或產孢量低,產孢慢,生產孢子或種子成本高,不利于工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵生產接種的問題,而提供一株產紫杉醇的菌株。本發(fā)明產紫杉醇的菌株,它為赤霉菌(Gibberella sp. ) JFHd-Ι,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC),保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號,保藏日期為2012年4月10日,保藏編號為CGMCC No. 5980。本發(fā)明中赤霉菌(Gibberella sp. ) JFHd-I在PDA固體培養(yǎng)基上生長良好,培養(yǎng)至三天,菌落直徑可達I. 5 I. 8cm,表面無滲出液,菌絲為白色絮狀,菌落中央微微凸起, 質地疏松,呈放射狀褶皺,菌落呈淡黃色,培養(yǎng)三天后,菌落表面有黑色孢子生長,培養(yǎng)至七天,菌落可長滿整個平板,且有大量黑色的孢子生成,無特殊氣味,邊緣較整齊,菌落背面中間呈白色邊緣為淡黃色。赤霉菌(Gibberella sp.) JFHd-I在PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3 15天后,培養(yǎng)液中長滿白色菌絲球,溶液表面液面層及搖瓶壁上有大量黑色的孢子存在。在光學顯微鏡下觀察,菌絲呈長絲狀,菌絲中間無隔。分生孢子呈圓形或橢圓形,大小為(2. O μ m 3. O μ m) X (2. O μ m 3. O μ m)。本發(fā)明中赤霉菌(Gibberella sp.) JFHd-I在PDA培養(yǎng)基生長,最適生長溫度為25 28°C,最適生長pH值為5 7。本發(fā)明中赤霉菌(Gibberella sp. ) JFHd-1,其ITS序列,PCR產物純化后,經NCBI數(shù)據(jù)庫序列比對,與赤霉菌屬(Gibberella sp.)內各個種之間有極高的同源性,同源性為98%以上,通過結合菌體形態(tài)特征、生長條件確定赤霉菌JFHd-I屬于赤霉菌屬(Gibberella sp.)。本發(fā)明中赤霉菌JFHd-I屬于赤霉菌屬(Gibberella sp.),保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC),保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號,保藏日期為2012年4月10日,保藏編號為CGMCC No. 5980。本發(fā)明中赤霉菌(Gibberella sp.) JFHd-I能夠產生紫杉醇,赤霉菌JFHd-I發(fā)酵產物經乙酸乙酯萃取后,應用超高效液相色譜儀和三重四極桿質譜儀聯(lián)用技術進行了紫杉醇檢測。本發(fā)明中赤霉菌(Gibberella sp. ) JFHd-I不僅產紫杉醇,而且在比較幾種常規(guī)培養(yǎng)基后,采用廉價易得的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)即可快速大量的生成孢子,因此更適宜進行生物工程育種(即對菌株進行物理化學誘變),從而加快具優(yōu)良培養(yǎng)性狀、更適宜工業(yè)化生產、產物中雜質含量低、易于提取、最好兼具目標物高產的優(yōu)良菌株的篩選,間接的降低了紫杉醇的生產成本。


圖I為具體實施方式
一中赤霉菌(Gibberella sp.)JFHd-I的菌落正面形態(tài)圖;圖2為具體實施方式
一中赤霉菌(Gibberella sp.)JFHd-I的菌絲形態(tài)圖;圖3為具體實施方式
一中紫杉醇對照品(A)的全離子掃描圖;圖4為具體實施方式
一中紫杉醇對照品(A)的多反應監(jiān)測色譜圖5為具體實施方式
一中供試品⑶的多反應監(jiān)測色譜圖。
具體實施例方式本發(fā)明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
,還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式產紫杉醇的菌株,它為赤霉菌(Gibberella sp.)JFHd-Ι,保藏在中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC),保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號,保藏日期為2012年4月10日,保藏編號為CGMCC No. 5980。本實施方式中具體的保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號,中國科學院微生物研究所,郵政編碼為100101。赤霉菌(Gibberella sp.)JFHd-I的分類命名為赤霉菌 Gibberella sp.。本實施方式中赤霉菌(Gibberella sp. ) JFHd-I在PDA固體培養(yǎng)基上生長良好,培養(yǎng)至三天,菌落直徑可達I. 5 I. 8cm,表面無滲出液,菌絲為白色絮狀,菌落中央微微凸起,質地疏松,呈放射狀褶皺,菌落呈淡黃色,培養(yǎng)三天后,菌落表面有黑色孢子生長,培養(yǎng)至七天,菌落可長滿整個平板,且有大量黑色的孢子生成,無特殊氣味,邊緣較整齊(見圖I),菌落背面中間呈白色邊緣為淡黃色。赤霉菌(Gibberella sp.) JFHd-I在PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3 15天后,培養(yǎng)液中長滿白色菌絲球,溶液表面液面層及搖瓶壁上有大量黑色的孢子存在。在光學顯微鏡下觀察,菌絲呈長絲狀,菌絲中間無隔(見圖2)。分生孢子呈圓形或捕圓形,大小為(2. O μ m 3. O μ m) X (2. O μ m 3. O μ m)。本實施方式中赤霉菌(Gibberella sp. ) JFHd-I在PDA培養(yǎng)基生長,最適生長溫度為25 28°C,最適生長pH值為5 7。本實施方式中產紫杉醇的菌株它為赤霉菌(Gibberella sp. ) JFHd-I,該菌株自榛屬植物根莖皮內分離純化得到,榛屬植物為野生平榛樹,它采自哈爾濱賓縣地區(qū),植株健壯,無病蟲害,其樣本現(xiàn)存于黑龍江大學生命科學學院108實驗室;它按以下步驟進行分離純化培養(yǎng)一、將帶部分木質部的平榛樹的樹皮用無菌水沖洗去掉雜質,然后用質量濃度為75%的酒精浸泡lmin,再用無菌水沖洗掉酒精,然后用無菌剪刀剪成面積為O. 5cmX0. 5cm的榛樹皮小塊;二、將榛樹皮小塊放置于PDA瓊脂固體培養(yǎng)基平板上,在28°C條件下恒溫培養(yǎng)至樹皮小塊周圍明顯長出菌絲;三、采用尖端菌絲挑取法將菌接種于PDA瓊脂固體培養(yǎng)基,在28°C恒溫條件下培養(yǎng)3 5天,挑取單菌落,用PDA瓊脂固體培養(yǎng)基平板劃線培養(yǎng)法,經多次分離、篩選、純化,得到可以產生紫杉醇的赤霉菌JFHd-1。對分離純化得到的赤霉菌JFHd-I進行分子生物學鑒定,按以下步驟進行提取菌株的總DNA,采用真菌通用引物ITS1、ITS4擴增赤霉菌JFHd-I rDNA ITS序列,PCR產物純化后,經NCBI數(shù)據(jù)庫序列比對,與赤霉菌屬(Gibberella sp.)內各個種之間有極高的同源性,同源性為98%以上,通過結合菌體形態(tài)特征、生長條件確定赤霉菌JFHd-I屬于赤霉菌屬(Gibberella sp.)。將本實施方式的赤霉菌JFHd-I接種于種子培養(yǎng)基(PDA瓊脂固體培養(yǎng)基),于28°C培養(yǎng)2天,然后轉接于裝有200mL發(fā)酵培養(yǎng)基(PDA液體培養(yǎng)基)的500mL三角瓶中,于28°C、180r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)10天,收集發(fā)酵產物。對上述赤霉菌JFHd-I的發(fā)酵產物進行紫杉醇檢測,具體如下采用均質機將赤霉菌JFHd-I發(fā)酵液均質后,取IL用等體積乙酸乙酯萃取三次,合并萃取液,濃縮至干,用乙腈溶解定容至lmL,0.22ym微孔濾膜過濾除去固形物,制得供試品(B)溶液。將供試品(B)溶液進行液質聯(lián)用分析,色譜條件為使用Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀,WaterszXTerra MS C18色譜柱(2. ImmX 150mm,5 μ m),流動相為乙腈和純水,進行梯度洗脫(程序見表I);流速O. 3mL/min,柱溫為30°C ;進樣量為3. O μ L。質譜條件為使用Waters QuattroPremier三重四極桿質譜儀,采用電噴霧電離正離子采集模式(ESI+),在多反應監(jiān)測(MRM)模式下檢測。毛細管電壓為3. OkV,離子源溫度120°C,脫溶劑溫度300°C,脫氣流量600L/h,錐孔氣流量50L/h,錐孔電壓為25V,碰撞能量為35eV,監(jiān)測離子對為854/286。在ESI+的電離方式下,紫杉醇對照品(A)可形成穩(wěn)定的[Μ+Na]+分子離子峰見 圖3,采用MRM模式測定紫杉醇對照品(A)和供試品(B)的MRM色譜圖見圖4和圖5。在多反應監(jiān)測(MRM)模式下,以286(m/z)作為定量離子,按前述液質聯(lián)用分析條件進行測定。以進樣質量濃 度(X)為橫坐標,離子峰面積(Y)為縱坐標,進行線性回歸得標準曲線Y = 32 051X+195 728,相關系數(shù)r為O. 998,取赤霉菌JFHd-I發(fā)酵液供試品溶液共6份,測得發(fā)酵液中紫杉醇平均濃度為 12. 5μ g/L。表I
權利要求
1.一株產紫杉醇的菌株,其特征在于它為赤霉菌(Gibberella sp.) JFHd-I,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC),保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號,保藏日期為2012年4月10日,保藏編號為CGMCC No. 5980。
全文摘要
一株產紫杉醇的菌株,它涉及一株赤霉菌菌株。它為了解決現(xiàn)有產紫杉醇的菌株,存在不產孢子或產孢量低,產孢慢,生產孢子或種子成本高,不利于工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵生產接種的問題。赤霉菌(Gibberella sp.)JFHd-1,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號,保藏日期為2012年4月10日,保藏編號為CGMCC No.5980。本發(fā)明中赤霉菌JFHd-1不僅產紫杉醇,且可快速大量的生成孢子,更適宜進行生物工程育種,加快具優(yōu)良培養(yǎng)性狀、更適宜工業(yè)化生產、產物中雜質含量低、易于提取、最好兼具目標物高產的優(yōu)良菌株的篩選,間接的降低了紫杉醇的生產成本。
文檔編號C12N1/14GK102876591SQ20121042817
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月31日 優(yōu)先權日2012年10月31日
發(fā)明者金濤, 李沖偉 申請人:黑龍江大學
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