專利名稱：一種植物葉枕特異表達啟動子ProCol1的鑒定和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種植物葉枕特異性表達啟動子，含有該啟動子的植物表達載體，以及該啟動子的轉(zhuǎn)化子，本發(fā)明還涉及上述啟動子在植物轉(zhuǎn)基因工程中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
啟動子是RNA聚合酶能夠識別并與之結(jié)合，從而起始基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，通常位于基因上游。一個典型的啟動子包括CAAT-box和TATA-box，它們分別是依賴DNA的RNA聚合酶的識別和結(jié)合位點，一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游幾十個堿基處，在核心啟動子上游通常會有一些特殊的DNA序列，即順式作用元件，轉(zhuǎn)錄因子與之結(jié)合從而激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄，一旦RNA聚合酶 定位并結(jié)合在啟動子上即可啟動基因轉(zhuǎn)錄，因此啟動子是基因表達調(diào)控的重要元件，它基本上決定一個基因是否表達、何時表達和何處表達。它與RNA聚合酶及其他蛋白輔助因子等反式作用因子的相互作用是啟動子調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的實質(zhì)。根據(jù)啟動子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為3類組成型啟動子、組織或器官特異性啟動子和誘導型啟動子。最早廣泛使用的生物轉(zhuǎn)基因啟動子是一些組成型啟動子，如來源于CaMV的35S啟動子、玉米Ubiqutin啟動子和水稻的Actinl啟動子。這類啟動子的特點是在所有的組織中都啟動基因表達。誘導型啟動子能使基因?qū)μ囟ㄐ盘柎碳?包括物理因素、化學因素和生物因素)做出響應(yīng)，在沒有誘導因子存在的條件下不表達或者只有非常低的表達，但一旦受到誘導因子的誘導，基因的表達量迅速并且大幅度增加。組織特異性啟動子調(diào)控基因只在某些特定器官、組織或細胞中表達，研究較多的有根特異啟動子、葉特異啟動子、花特異啟動子、種子特異性啟動子等。在植物轉(zhuǎn)基因工程中，大部分采用的是組成型啟動子，由于這類啟動子在所有的組織中都啟動基因表達，具有持續(xù)性，不表現(xiàn)時空特異性，所以難以達到定向改造植物性狀的目的，而且組成型啟動子在時空上是持續(xù)表達，也造成植物成長資源的浪費。在生物轉(zhuǎn)基因安全方面，組成型啟動子的高表達量、強啟動效應(yīng)、對生物種類和組織的不加選擇，以及其來源的不安全性，使采用該類啟動子的轉(zhuǎn)基因生物容易成為基因漂移、外源基因泛濫表達的源頭，使人們非常擔心轉(zhuǎn)基因植物的安全性問題。因此，在基因工程中，定向、安全地改良植物某些性狀的先決條件是提供基因特異性表達的啟動子，構(gòu)建高效表達的表達載體，使靶標基因精確地在目的組織內(nèi)按需表達。水稻是世界上最重要的糧食作物之一，如何提高水稻產(chǎn)量一直是一個難以攻關(guān)的重要難題。水稻葉張角是影響產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀，直立的葉片可顯著提高植株密植度，提高單位土地面積上的凈光合速率；同時增加光能吸收效率和氮營養(yǎng)儲存，有利于籽粒灌漿，進而增加產(chǎn)量，因此培育葉角較小的品種是水稻育種學的一個重要目標。葉枕位于葉鞘與葉片交界處，具有調(diào)節(jié)葉片開張角度的作用，俗稱葉關(guān)節(jié)，葉枕上著生一對爪狀的葉耳，粗糙的絨毛覆蓋在葉耳表面，緊挨著葉耳上面是一對直立薄片呈膜狀的葉舌。葉枕的結(jié)構(gòu)是維持水稻葉張角的重要因素之一，因此是水稻重要的功能組織。水稻葉枕發(fā)育是一個由多種激素(生長素，油菜素內(nèi)酯等)的合成和信號途徑協(xié)同調(diào)控的近軸面和遠軸面細胞分裂和延伸的平衡的過程葉枕發(fā)育的初期遠軸面早于近軸面,但隨著時間的推移,遠軸面發(fā)育加快,導致葉傾角的增大。Jing Ling et W研究發(fā)現(xiàn)基因/Ui (Increased Leaf Anglel, a Raf-Like MAPKKK)介導的信號途徑調(diào)控葉枕部位機械組織的形成，是尚未報道過的調(diào)控水稻葉片夾角的新機制(Cell Research (2010)20:935-947)?？刂扑救~角大小的另一個基因ZG(leaf inclination2)，編碼一個類VIN3蛋白，通過調(diào)節(jié)葉枕細胞分裂來控制葉片角度，Ζβ 基因在葉片發(fā)育過程中主要在葉片和葉鞘連接處表達，并且表達受到脫落酸、赤霉素、生長素和油菜素內(nèi)酯的誘導(Shu-Qing Zhaoet al. Cell Research, 2010, 20 (8) : 935-947)。為了得到直立的水稻株型，許永漢等(2010)在由早秈品種“廣陸矮4號”經(jīng)6ciCoy射線輻射誘變產(chǎn)生的水稻突變體庫中找到一種無葉枕突變體Oslgl-3，經(jīng)過遺傳改良的Oslgl-3品系在合理密植的條件下能夠顯著提高水稻的產(chǎn)量，顯示出該突變體材料在水稻育種實踐中具有重要的應(yīng)用價值。由于水稻葉張角由葉枕的發(fā)育狀況決定，如果能獲得調(diào)控基因在植物葉枕中特異性表達的啟動子，使外源抗病基因或株型基因都只在葉枕部位表達，這對于改變水稻株型，提高水稻產(chǎn)量，防治葉枕瘟有著十分重要的作用。葉枕特異性啟動子能指導外源葉片張角控制基因在葉枕處特異表達，在改變水稻葉片張角、改良植物株型的同時，提高張角控制基因的利用效率，避免該類基因(多為油菜素內(nèi)酯信號傳遞響應(yīng)基因)在水稻其他部分無效表達帶來的能 量浪費和對其他形態(tài)結(jié)構(gòu)不必要的影響。因此分離克隆這樣的啟動子，對于植物轉(zhuǎn)基因工程獲得抗性品種具有十分重要和深遠的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種驅(qū)動外源基因在植物葉枕組織中特異性表達的啟動子以及獲得含有該啟動子序列的轉(zhuǎn)化子。一種植物葉枕特異性表達啟動子其核苷酸序列如下所示
權(quán)利要求
1.一種植物葉枕特異性表達啟動子ProColl，其特征在于，其核苷酸序列如下所示
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物葉枕特異性表達啟動子ProColI，其特征在于，所述植物葉枕特異性表達啟動子ProColl包含于植物表達載體pCAMBIA1381- ProColl中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植物葉枕特異性表達啟動子ProColl，其特征在于，所述的植物表達載體PCAMBIA1381- ProColl及其宿主包含于轉(zhuǎn)化子中。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物葉枕特異性表達啟動子ProColl,其特征在于,所述的轉(zhuǎn)化子為細胞系，愈傷組織或轉(zhuǎn)基因植株。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物葉枕特異性表達啟動子ProColl，其特征在于，所述的宿主為根癌農(nóng)桿菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物葉枕特異性表達啟動子ProColl，其特征在于，所述的植物葉枕特異性表達啟動子ProColl應(yīng)用于培育轉(zhuǎn)基因植物中，具體如下將植物葉枕特異性表達啟動子ProColl插入靶標基因前轉(zhuǎn)化植物，使靶標基因在植物葉枕中特異性表達，從而達到株型改良或抗病育種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的植物葉枕特異性表達啟動子ProColl，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)基因植物為水稻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物葉枕特異表達啟動子ProCol1的鑒定和應(yīng)用，涉及植物基因工程領(lǐng)域，特別是涉及一種水稻葉枕特異性表達的啟動子，含有該啟動子的植物表達載體和轉(zhuǎn)化子，本發(fā)明還涉及上述啟動子在植物轉(zhuǎn)基因工程中的應(yīng)用。發(fā)明人將含有該啟動子DNA序列和GUS基因的植物表達載體經(jīng)農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法，獲得轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)染色鑒定，GUS基因僅僅在水稻葉枕處特異表達，因此推測本發(fā)明提供的啟動子能夠驅(qū)動外源基因在植物葉枕中特異表達，可應(yīng)用于定向改良作物農(nóng)業(yè)性狀，提高作物產(chǎn)量，培育高效高安全性的轉(zhuǎn)基因植物新品種，使用方便，環(huán)境友好。
文檔編號C12N15/113GK103031303SQ20121042820
公開日2013年4月10日 申請日期2012年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月31日
發(fā)明者楊劍波, 魏鵬程, 李娟 , 張銀萍, 李 浩, 宋豐順, 倪大虎, 李莉, 楊亞春 申請人:安徽省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所