專利名稱：靶向沉默MyoⅩ的序列制備及其載體的構(gòu)建的制作方法
靶向沉默Myo X的序列制備及其載體的構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物工程中的DNA重組技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及特異性沉默靶標(biāo)蛋Myo X 的序列設(shè)計合成及其表達(dá)載體構(gòu)建。
技術(shù)背景肌球蛋白X (Myosin X，Myo X)是1994年于牛蛙的內(nèi)耳中首次發(fā)現(xiàn)的，屬于非傳統(tǒng)型肌球蛋白家族，是細(xì)胞內(nèi)重要的分子馬達(dá)，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中調(diào)節(jié)神經(jīng)突起的生長。Myo X分子由頭部、頸部和尾部三部分組成。頭部區(qū)是馬達(dá)結(jié)構(gòu)域，具有磷酸水解酶活性；頸部區(qū)具有三個IQ結(jié)構(gòu)域，是Myo X與類鈣調(diào)蛋白(CLP)相互作用的部位；尾部區(qū)包括一個能使兩分子Myo X形成二聚體的鉸鏈結(jié)構(gòu)域、三個能切割鈣蛋白酶的PEST結(jié)構(gòu)域、三個能與 PIP3結(jié)合的PH結(jié)構(gòu)域、一個能與微管結(jié)合的MyTH4和一個能結(jié)合β整合素(β-integrin) 的FERM結(jié)構(gòu)域。
自發(fā)現(xiàn)以來，Myo X被廣泛的研究，近年來的研究表明，Myo X參與絲足的形成、 延伸和穩(wěn)定，對絲足內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸起著非常重要的作用，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，Myo X的高表達(dá)預(yù)示著腫瘤具有強(qiáng)的轉(zhuǎn)移潛能，所以特異性的沉默Myo X至關(guān)重要。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是合成特定的能夠靶向沉默Myo X的特異堿基序列，為更加深入的研究Myo X以及Myo X在選擇、制備治療腫瘤藥物中的作用提供了有效的手段。
本發(fā)明中所需要構(gòu)建的主要是Myo X的沉默表達(dá)載體。核心沉默表達(dá)載體構(gòu)建分為兩個大的步驟，首先是根據(jù)人源的Myo X序列設(shè)計出19bp的目的片段，合成的目的片段兩端帶有合適的酶切位點(diǎn)，將目的片段連接到pEN-h-siRNA載體上，連接轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆鑒定。鑒定正確后，用pEN-h-siRNA-Myo X和pDSL_hpGIP進(jìn)行LR重組反應(yīng)，這兩個載體重組后形成核心的沉默表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆鑒定，陽性克隆酶切鑒定測序正確，進(jìn)行沉默效率的檢測。
本發(fā)明中設(shè)計合成了能夠靶向人源Myo X的19bp的目的片段，片段序列為 cctcctagcc cttatcaat能夠特異性沉默Myo X的表達(dá)載體的構(gòu)建包括以下步驟第一步，序列設(shè)計根據(jù)人源Myo X基因序列在Invitrogen公司主頁上用相應(yīng)的軟件設(shè)計特異性識別Myo X的序列。
第二步，表達(dá)載體pEN_hHl-Myo X的構(gòu)建將表達(dá)載體pEN_hHl雙酶切后，利用回收試劑盒回收線性化載體。經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、 提取等步驟獲得重組的表達(dá)載體。酶切鑒定重組體，并且測序進(jìn)一步確定。
第三步，LR重組構(gòu)建Myo X -shRNA質(zhì)粒抽提試劑盒抽提pDSL_hpUGIP和pEN_hHl_Myo X質(zhì)粒,經(jīng)重組、轉(zhuǎn)化、提取等步驟獲得重組的載體。酶切鑒定重組體，并且測序進(jìn)一步確定。
第四步，沉默靶蛋白效率的檢測經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后提取蛋白，利用western blot等試驗(yàn)手段檢測沉默效率。


圖I為特異性沉默靶蛋白My0 X的序列的合成凝膠電泳圖；圖2為pEN_hHl表達(dá)載體BamH I和Xhol雙酶切電泳圖；圖3為pEN_hHl表達(dá)載體BamH I和Xhol雙酶切回收電泳圖；圖4為LR重組構(gòu)建Myo X -shRNA測序結(jié)果；圖5為利用RT-PCR檢測，轉(zhuǎn)入Myo X-shRNA后Myo X表達(dá)量明顯降低，GAPDH為內(nèi)參； 圖6為圖5結(jié)果的統(tǒng)計圖，對5次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，沉默效率為51. 5%，進(jìn)行t檢驗(yàn) p〈0. 01差異極顯著；圖7為Western blot免疫印跡分析，轉(zhuǎn)入Myo X siRNA沉默載體后Myo X表達(dá)量降低 70%ο
本發(fā)明中設(shè)計合成的19bp的目的片段，能夠特異性的沉默Myo X，同時也為構(gòu)建Myo X-shRNA提供關(guān)鍵的序列片段。Myo X是一種非傳統(tǒng)的肌球蛋白，經(jīng)研究表明，Myo X在腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮一定的作用，構(gòu)建成功的載體，能夠用來特異性的沉默Myo X，沉默Myo X能夠降低腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能，所以能夠?yàn)檫x擇、制備治療腫瘤藥物提供了理論基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一特異性沉默祀標(biāo)蛋白Myo X的表達(dá)載體構(gòu)建I、特異性沉默靶蛋白Myo X的序列設(shè)計(I)根據(jù)人源Myo X基因序列在Invitrogen公司主頁上用相應(yīng)的軟件設(shè)計，設(shè)計的原則19bp的特異性結(jié)合Myo X的序列的GC含量為45%_55%，退火溫度45°C _65°C，同時避免起始端有兩個以上的A，尾端不能有兩個以上的T。將選取的片段進(jìn)行BLAST人基因組比對，選擇特異性序列。
(2)以 BamH I - N19-TT_loop- N’ 19-Xhol 形式合成一段 60bp 序列，N’ 19 為 N19的反向互補(bǔ)，5’端為BamH I酶切位點(diǎn)，3’端為Xhol酶切位點(diǎn)。設(shè)計合成的片段分別靶向 Myo X 的 cDNA 序列 1971- 1989 (Myo XshRNA I)和 3299 -3317 (Myo XshRNA 2)， Scramble shRNA 非特異靶向片段為 GTGAGATCGTAGTGCGTGA。
2、特異性沉默靶蛋白Myo X的序列的合成與儲存圖I(I)將合成的兩段olig溶解至50 μΜ，各取ΙΟΟμΙ混合。
(2)95 °C變性5min，快速轉(zhuǎn)移至70 1水浴鍋中，孵育lOmin，關(guān)閉水浴鍋電源，過夜。
(3)次日取出混勻，放在冰上備用，或者-20 °C長期保存。
3、表達(dá)載體pEN_hHl_Myo X的構(gòu)建(I)取Mg pEN_hHl載體，BamH I和Xhol雙酶切，電泳，回收線性pEN_hHl大片段圖 2圖3。
(2)連接和轉(zhuǎn)化。將線性pEN_hHl濃度稀釋至160ng/>，連接反應(yīng)(NEB公司的T4 DNA連接酶)權(quán)利要求
1.能夠靶向沉默MyoX的特異堿基序列，其特征是其序列為cctcctagcc cttatcaat。
2.按照權(quán)利要求I所述的能夠靶向沉默MyoX的特異堿基序列在選擇、制備治療腫瘤藥物中的作用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程中的DNA重組技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及特異性沉默靶標(biāo)蛋MyoⅩ的序列設(shè)計合成、表達(dá)載體構(gòu)建及其應(yīng)用。本發(fā)明通過根據(jù)人源的MyoⅩ序列設(shè)計出19bp的目的片段，合成的目的片段兩端帶有合適的酶切位點(diǎn)，將目的片段連接到pEN-h-siRNA載體上，連接轉(zhuǎn)化，挑取鑒定，重組反應(yīng)等形成核心的沉默表達(dá)載體，能夠特異性的沉默MyoⅩ，同時也為構(gòu)建MyoⅩ-shRNA提供關(guān)鍵的序列片段，從而為選擇、制備治療腫瘤藥物提供了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/113GK102925443SQ20121043024
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月1日
發(fā)明者朱筱娟, 曹讓娟, 陳晶瀅, 卿旭, 翟艷華, 俞華莉 申請人:東北師范大學(xué)